崔乃菠，馬境謙，余河水，3，李正，2，3，何永志，3，別松濤，3*（. 天津中醫(yī)藥大學(xué) 中藥制藥工程學(xué)院，天津 3067；2. 組分中藥國家重點實驗室，天津 3067；3. 中藥制藥工程市級實驗教學(xué)示范中心，天津 3067）

菊葉薯蕷（

Dioscorea composita

Hemsl.）為薯蕷科薯蕷屬植物，是甾體激素藥物的重要來源。薯蕷皂苷主要存在于菊葉薯蕷的根和塊莖中，具有抗炎、抗真菌、抗纖維化、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性，對肝臟、心血管系統(tǒng)等多器官系統(tǒng)具有保護作用。研究發(fā)現(xiàn)，菊葉薯蕷中的甾體皂苷類成分經(jīng)微生物發(fā)酵后會發(fā)生轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生次級皂苷及薯蕷皂苷元。在此過程中，不僅原有成分的含量會發(fā)生改變，還可能會產(chǎn)生新的物質(zhì)，藥效成分含量提高，藥物活性增強。響應(yīng)面分析法（RSA）是目前常用的多元統(tǒng)計技術(shù)，其與中心組合設(shè)計（CCD）結(jié)合可廣泛應(yīng)用于參數(shù)較少但參數(shù)間存在交互作用的參數(shù)條件的優(yōu)化，改善了傳統(tǒng)技術(shù)的不足，節(jié)省時間、試劑與材料，降低實驗成本。目前，此方法已逐漸應(yīng)用于優(yōu)化中藥有效成分的提取。

2020年版《中國藥典》未收錄菊葉薯蕷，也未見生物富集菊葉薯蕷中薯蕷皂苷的報道，本研究以高效液相色譜法測得的菊葉薯蕷中的薯蕷皂苷含量為考察指標(biāo)，采用單因素實驗考察發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、接種量對發(fā)酵過程中薯蕷皂苷含量的影響。在此基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法進一步優(yōu)化發(fā)酵條件，富集薯蕷皂苷，為菊葉薯蕷的深入開發(fā)與綜合利用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥

菊葉薯蕷藥材，采自云南省會澤縣，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室張麗娟教授鑒定為薯蕷科薯蕷屬植物菊葉薯蕷的干燥根莖；活性干酵母（安琪酵母股份有限公司）；馬鈴薯葡萄糖肉湯（PDB北京索萊寶科技有限公司）；薯蕷皂苷對照品（批號：Y20A10Z95575，純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；乙腈（色譜純，美國Fisher公司）；乙醇（色譜純，天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；水為超純水。

1.2 儀器

Waters e2695HPLC色譜系統(tǒng)（四元泵、真空在線脫氣機、自動進樣器、柱溫箱和Empower 色譜工作站，配有2424蒸發(fā)光散射檢測器，美國活特世）；SB-5200DTD型數(shù)控超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；CP1003電子天平[奧豪斯儀器（常州）有限公司]；AB135-S電子分析天平（Mettler Toledo）；中草藥粉碎機（天津市泰斯儀器有限公司）；Milli-Q 超純水處理系統(tǒng)（美國 Millipore 公司）；恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）；潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；臺式高速冷凍離心機H1650R（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌器（上海云泰儀器儀表有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 菊葉薯蕷預(yù)處理

將干燥的菊葉薯蕷藥材粉碎后過40目篩，稱取2.0 g藥材粉末和50 mL蒸餾水于150 mL錐形瓶中，混勻，121℃高壓滅菌30 min。將一定接種量的酵母種子液加入菊葉薯蕷溶液中，恒溫培養(yǎng)一定時間后，取出發(fā)酵液，過濾；精密稱取1.0 g發(fā)酵固體，加70%乙醇超聲提取30 min（功率360 W，頻率40 kHz），補足失重，過0.22 μm微孔濾膜，續(xù)濾液為菊葉薯蕷發(fā)酵產(chǎn)物。

2.2 酵母種子液的制備

在250 mL錐形瓶中配制150 mL PDB培養(yǎng)基，121℃高壓蒸汽滅菌30 min，將1.5 g活性干酵母接種至培養(yǎng)基中。30℃、150 r·min恒溫振蕩培養(yǎng)22 h，得到酵母種子液。

2.3 檢測方式與評價依據(jù)

根據(jù)文獻采用HPLC-ELSD法測定發(fā)酵前后菊葉薯蕷中薯蕷皂苷的含量。

2.4 色譜條件

色譜柱為Symmetry C柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-水（B）溶液，梯度洗脫（0～5 min，25%～30%A；5～6 min，30%～31%A；6～10 min，31%A；10～20 min，31%～60%A；20～30 min，60%～95%A；30～32 min，95%A；32～35 min，95%～25%A）；體積流量1.0 mL·min，柱溫30℃，蒸發(fā)光散射檢測器參數(shù)：漂移管溫度70℃，氣體流速2.8 L·min。

2.5 薯蕷皂苷的含量測定

精密稱取適量薯蕷皂苷對照品，用70%乙醇溶解，定容至10 mL量瓶中，配得薯蕷皂苷對照品質(zhì)量濃度為 1.024 mg·mL，用70%乙醇分別稀釋成系列濃度對照品溶液，進樣測定，記錄色譜峰面積，以對照品質(zhì)量濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)（

X

），峰面積的對數(shù)值為縱坐標(biāo)（

Y

），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：

y

＝1.734

x

＋5.855，

R

＝0.9992，薯蕷皂苷在0.0683～1.024 mg·mL內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。薯蕷皂苷對照品的色譜圖見圖1。

圖1 菊葉薯蕷對照品的HPLC色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of dioscin standard

2.6 單因素實驗

根據(jù)預(yù)實驗，以薯蕷皂苷峰面積為評價指標(biāo)，考察酵母菌的接種量（5%、10%、15%、20%、25%），發(fā)酵時間（24、36、48、60、72 h），發(fā)酵溫度（20、28、36、44、52℃）對發(fā)酵過程中薯蕷皂苷含量的影響。

2.6.1 接種量對薯蕷皂苷含量的影響 由圖2A可知接種量是影響發(fā)酵后菊葉薯蕷中薯蕷皂苷含量的一個重要因素。在5%～15%時，隨著接種量的增加，薯蕷皂苷的含量明顯增加，原因是接種量的增加明顯提高了發(fā)酵液中酵母菌的含量，提高了發(fā)酵效率；當(dāng)接種量高于15%時，薯蕷皂苷的含量隨接種量的增加而減小，可能是因為培養(yǎng)基中酵母菌數(shù)量過多，產(chǎn)生競爭性抑制，影響菌體生長代謝，減弱了發(fā)酵效果；同時會消耗部分指標(biāo)成分用于菌種繁殖，降低其含量。故最適接種量的選擇為15%。

2.6.2 發(fā)酵時間對薯蕷皂苷含量的影響 由圖2B可知在24～48 h內(nèi)，薯蕷皂苷的含量隨發(fā)酵時間的延長而增加。但超過48 h，薯蕷皂苷的含量隨著發(fā)酵時間的增加呈下降趨勢。這種現(xiàn)象產(chǎn)生的可能是在發(fā)酵初期，培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)充足，酵母菌代謝旺盛，有利于向薯蕷皂苷的轉(zhuǎn)化，使其含量增加；時間過長，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)不斷被消耗，酵母菌代謝減慢，薯蕷皂苷含量降低，或是薯蕷皂苷在皂苷水解酶作用下生成皂苷元或次皂苷，使薯蕷皂苷含量減少。所以選擇最適發(fā)酵時間為48 h。

2.6.3 發(fā)酵溫度對薯蕷皂苷含量的影響 由圖2C可知在20～36℃內(nèi)，薯蕷皂苷的含量隨發(fā)酵溫度的升高而增加。當(dāng)溫度繼續(xù)升高，薯蕷皂苷的含量隨之下降。原因可能是溫度影響了酵母菌的酶促反應(yīng)。溫度過低時，酶活性受到抑制；溫度過高則使酶失活。溫度為36℃時，酵母菌代謝旺盛，薯蕷皂苷含量最多，所以選擇最適發(fā)酵溫度為36℃。

圖2 接種量（A）、發(fā)酵時間（B）及發(fā)酵溫度（C）對薯蕷皂苷含量的影響Fig 2 Effect of inoculum concentration（A），fermentation time（B），fermentation temperature（C）on dioscin content

2.7 響應(yīng)面分析實驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)中心組合設(shè)計原理，以菊葉薯蕷中薯蕷皂苷的含量為評價指標(biāo)，以發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、接種量為自變量，設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面分析實驗，因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面因素及水平
Tab 1 Factor and level of response surface analysis

水平 因素A.發(fā)酵時間/h B.發(fā)酵溫度/℃ C.接種量/%－1 36 28 10 0 48 36 15 1 60 44 20

2.7.1 數(shù)學(xué)模型的建立及方差分析 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以薯蕷皂苷的含量（Y）為響應(yīng)值，發(fā)酵時間（A）、發(fā)酵溫度（B）、接種量（C）為自變量，采用中心組合設(shè)計法進一步優(yōu)化發(fā)酵條件，實驗設(shè)計方案及結(jié)果見表2。

根據(jù)表2數(shù)據(jù)，采用Design Expert 8.0.6.1軟件對其進行多元回歸擬合，

A

、

B

、

C

為自變量，

Y

為響應(yīng)值進行多元二次回歸擬合，得到二次回歸方程：

表2 響應(yīng)面分析實驗設(shè)計方案與結(jié)果
Tab 2 Design and result of response surface analysis

序號 A. 發(fā)酵時間/h B. 發(fā)酵溫度/℃C. 接種量/%薯蕷皂苷含量/（mg·g－1）1 68.18 36.00 15.00 7.21 2 27.82 36.00 15.00 8.45 3 48.00 36.00 15.00 9.82 4 36.00 28.00 20.00 7.23 5 60.00 28.00 10.00 7.81 6 60.00 44.00 20.00 7.06 7 48.00 49.45 15.00 5.97 8 48.00 36.00 15.00 8.92 9 48.00 36.00 15.00 10.05 10 36.00 44.00 10.00 4.11 11 48.00 36.00 23.41 7.69 12 60.00 44.00 10.00 4.02 13 48.00 36.00 15.00 9.73 14 48.00 36.00 6.59 5.01 15 48.00 36.00 15.00 9.56 16 36.00 28.00 10.00 7.54 17 60.00 28.00 20.00 8.12 18 48.00 36.00 15.00 9.26 19 48.00 22.55 15.00 8.64 20 36.00 44.00 20.00 8.78

Y

＝9.56－0.20

A

－0.82

B

＋0.89

C

－0.37

AB

－0.13

AC

＋0.96

BC

－0.65

A

－0.83

B

－1.17

C

方差分析結(jié)果見表3。該模型差異高度顯著（

P

＜0.0001），薯蕷皂苷含量失擬項

P

＝0.3807＞0.05，失擬不顯著；決定系數(shù)

R

＝0.9685、校正決定系數(shù)

R

＝0.9401，表明薯蕷皂苷含量的真實值與預(yù)測值擬合程度較高，誤差?。荒Ｐ妥儺愊禂?shù)為5.70%（＜10%），說明模型精確度較高。接種量對薯蕷皂苷的含量影響最大，發(fā)酵溫度次之，發(fā)酵時間影響最小。對回歸模型顯著性分析可知：模型的一次項

B

、

C

，二次項及交互項

BC

，為薯蕷皂苷含量極顯著影響因素（

P

＜0.01）；交互項

AB

為薯蕷皂苷含量的影響顯著因素（

P

＜0.05）；一次項

A

、交互項

AC

對薯蕷皂苷含量影響不顯著。

表3 回歸模型方差分析
Tab 3 Regression model analysis of variance

方差來源 平方和 自由度 均方 F值 P值模型 59.88 9 6.65 34.14 ＜0.0001 A 0.55 1 0.55 2.81 0.1245 B 9.22 1 9.22 47.30 ＜0.0001 C 10.93 1 10.93 56.08 ＜0.0001 AB 1.10 1 1.10 5.66 0.0387 AC 0.13 1 0.13 0.65 0.4374 BC 7.43 1 7.43 38.12 0.0001 A2 6.07 1 6.07 31.14 0.0002 B2 10.04 1 10.04 51.51 ＜0.0001 C2 19.80 1 19.80 101.61 ＜0.0001殘差 1.95 10 0.19失擬項 1.11 5 0.22 1.33 0.3807純誤差 0.84 5 0.17總和 61.83 19

2.7.2 響應(yīng)面分析 繪制響應(yīng)面圖及等高線圖，見圖3。兩因素之間交互作用的強弱可以通過等高線的形狀判斷，圓形表示因素間交互作用不顯著，橢圓形表示交互作用顯著。通過等高線圖可以看出發(fā)酵時間與發(fā)酵溫度之間交互作用顯著，隨著發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度的提升，薯蕷皂苷的含量先增加后減少；發(fā)酵溫度與接種量交互作用顯著，薯蕷皂苷的含量隨發(fā)酵溫度和接種量的升高呈先增加后減少的趨勢；發(fā)酵時間、接種量交互作用不顯著，隨著發(fā)酵時間和接種量的增加，薯蕷皂苷的含量開始增加，但當(dāng)兩者增加到一定量后薯蕷皂苷的含量開始下降。

圖3 各因素交互作用對薯蕷皂苷含量影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig 3 Response surface plots and contours of effect of different factors on dioscin content

2.7.3 驗證富集薯蕷皂苷的最佳發(fā)酵條件 通過對響應(yīng)面結(jié)果分析，結(jié)合 Design Expert 8.0.6.1軟件得到富集薯蕷皂苷的最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵時間為46.98 h，發(fā)酵溫度33.38℃，接種量16.28%，在此條件下薯蕷皂苷含量的預(yù)計值為9.81 mg·g。結(jié)合實驗可操作性，調(diào)整發(fā)酵條件為：發(fā)酵時間47 h，發(fā)酵溫度33.4℃，接種量16.3%。平行操作3次，薯蕷皂苷含量的實際值為9.38 mg·g，與預(yù)測值差異不顯著，說明此方程可以較準(zhǔn)確地模擬各因素對發(fā)酵過程中薯蕷皂苷含量的影響，優(yōu)化富集薯蕷皂苷的發(fā)酵條件。

3 討論與結(jié)論

薯蕷皂苷具有多種藥理活性，可用于消腫祛毒、舒筋通絡(luò)止痛、助消化等，主要以與纖維素結(jié)合的形式存在于植物細(xì)胞壁中。傳統(tǒng)的提取方法是用石油醚或者丙酮等有機溶劑直接溶解，產(chǎn)率低且易造成污染。與傳統(tǒng)方法相比，利用微生物發(fā)酵富集目標(biāo)成分不需要添加額外的催化劑，具有毒副產(chǎn)物少、反應(yīng)條件溫和、過程簡單、生物利用率高等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于中藥的開發(fā)與利用。本實驗以菊葉薯蕷中薯蕷皂苷的含量為評價指標(biāo)，單因素實驗考察發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、接種量對薯蕷皂苷含量的影響，采用響應(yīng)面分析法進一步優(yōu)化薯蕷皂苷的發(fā)酵條件，建立二次回歸方程模型。結(jié)果表明，接種量對薯蕷皂苷的含量影響最大，發(fā)酵溫度次之，發(fā)酵時間影響最小。在優(yōu)化后的最佳發(fā)酵條件（溫度33.4℃，時間47 h，接種量16.3%）下，測得薯蕷皂苷含量實際值與預(yù)測值相差不大，證明該方程擬合度高，準(zhǔn)確性好，可行性高，可為富集薯蕷皂苷的發(fā)酵工藝提供參考。

酵母菌屬于真核微生物，適應(yīng)性強、繁殖周期短、代謝途徑簡單、易于培養(yǎng)，廣泛應(yīng)用于食品、化工、制藥等領(lǐng)域，并且有研究表明酵母菌已被用于微生物轉(zhuǎn)化皂苷成分。利用酵母菌發(fā)酵可以富集薯蕷皂苷，可能是因為酵母菌發(fā)酵過程中生物酶的產(chǎn)生，破壞了細(xì)胞壁，有利于薯蕷皂苷在提取介質(zhì)中的擴散。菊葉薯蕷中原薯蕷皂苷含量較高且水溶性良好，薯蕷皂苷含量的增加也可能是因為發(fā)酵過程中呋甾皂苷狀態(tài)的原薯蕷皂苷發(fā)生水解，生成苷元母核相同的F-環(huán)環(huán)合螺甾皂苷薯蕷皂苷（見圖6）。

圖6 原薯蕷皂苷轉(zhuǎn)化成薯蕷皂苷的途徑Fig 6 Transformation of protodioscin into dioscin