薛濤濤，唐志書，孫強(qiáng)，胡曉慧，阮凱華，宋忠興，段金廒，許洪波*（. 陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，秦藥特色資源研究開發(fā)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（培育），陜西 咸陽 72083；2. 南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇省方劑高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 20023）

藥蜀葵（

Althaea officinalis

），為錦葵科蜀葵屬的多年生草本植物，其根、莖、葉和花均可入藥，主要以根為主，收錄于歐洲藥典，主產(chǎn)于歐洲等地區(qū)，我國多為栽培品種，是藥食兩用植物，根入藥有解表散寒、利尿止咳、消炎解毒的功效，作為茶飲可清喉利咽，還可作為觀賞性植物栽培。現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)揭示，藥蜀葵提取物具有鎮(zhèn)咳、抗炎、抗氧化、抗菌、免疫調(diào)節(jié)和降血糖等作用。國內(nèi)外化學(xué)研究表明，藥蜀葵富含黃酮、多糖和酚酸類成分，截至目前，從藥蜀葵中共分離得到40余個化合物，其中17個黃酮類，7個酚酸類，3個香豆素類，1個甾體類，1個三萜類。藥蜀葵作為民間藥用植物，資源分布廣泛，但是目前對于其基礎(chǔ)研究比較薄弱，功效物質(zhì)成分不明確，作用機(jī)制不清晰。迄今為止，尚未有對總黃酮提取工藝優(yōu)化及相關(guān)生物活性的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)首次采用響應(yīng)面法對藥蜀葵莖葉總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，首次采用D101大孔樹脂對所得總黃酮進(jìn)行了富集純化；并進(jìn)一步考察藥蜀葵總黃酮的抗氧化活性及體外抑制

α-

葡萄糖苷酶的活性，以期為藥蜀葵總黃酮的開發(fā)利用提供參考。

1 材料

1.1 試藥

藥蜀葵莖葉收集于永壽縣監(jiān)軍鎮(zhèn)陜西輝勝現(xiàn)代農(nóng)業(yè)園區(qū)，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)許洪波副教授鑒定為錦葵科蜀葵屬植物藥蜀葵（

Althaea officinalis

）的莖葉。蘆丁對照品（純度≥97%，批號：H24N9Z75966）和維生素C（V，純度≥99%，批號：J19O10R100374）（上海源葉生物科技有限公司）；DPPH、ABTS（美國Sigma公司）；阿卡波糖（純度≥98%，批號：wkq20031707）、對硝基苯基-

α

-

D

-葡萄糖吡喃苷（純度≥98%，批號：wkq20071504）（四川省維克奇生物科技有限公司）；D-101型大孔吸附樹脂（天津允開樹脂科技有限公司）；其他試劑（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器

Multiskan GO全波長酶標(biāo)儀（Thermo Scientific，USA）；UV-2600型紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；H-2型恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；TP-A2000型電子天平（福州華志科學(xué)儀器有限公司）；EYELA N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化器械株式會社）；KQ-300 DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品前處理

藥蜀葵莖葉樣品置于通風(fēng)陰涼處陰干后，將其剪碎后保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 總黃酮含量測定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用NaNO-Al（NO）-NaOH比色法測定總黃酮含量。用60%乙醇溶解蘆丁對照品后制得0.2 mg·mL的對照品溶液。精確吸取不同體積對照品溶液（0.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL）于25 mL量瓶中，加5% NaNO溶液1.0 mL，搖勻靜置6 min，加10% Al（NO）溶液1.0 mL，搖勻靜置6 min，加4% NaOH溶液10.0 mL，60%乙醇溶液定容至刻度，搖勻靜置15 min，于510 nm處測定吸光度（

A

）值。以蘆丁質(zhì)量濃度（

C

）為橫坐標(biāo)（

X

），

A

為縱坐標(biāo)（

Y

），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程為：

Y

＝6.455

X

＋0.0452（

r

＝0.9990），表明蘆丁在0.016～0.056 mg·mL與吸光度線性關(guān)系良好。

2.2.2 樣品溶液中總黃酮含量的測定 將提取液抽濾后濾液合并濃縮至約50 mL，轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，然后用60%乙醇定容至刻度，搖勻，作為樣品溶液。精密吸取2 mL樣品溶液于10 mL量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。精密吸取0.5 mL供試品溶液，先后加入5% NaNO溶 液，10% Al（NO）溶 液 和4%NaOH溶液，用60%乙醇定容至刻度線，15 min后于510 nm處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出測定稀釋后樣品溶液總黃酮濃度，計(jì)算提取率，提取率（%）＝[黃酮的質(zhì)量濃度（mg·mL）×稀釋倍數(shù)×最初溶液體積（mL）/10]/原料質(zhì)量（g）×100%。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取10 g干燥的莖葉碎片，回流提取，分別考察提取次數(shù)（1、2、3、4次）、提取溫度（50、60、70、80、90℃）、料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，g/mL）、乙醇濃度（40%、50%、60%、70%、80%）和提取時(shí)間（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）對總黃酮提取率的影響。將供試品溶液按照總黃酮含量測定方法操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算提取率，結(jié)果見圖1。綜合考慮時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本，選擇提取次數(shù)為2次，料液比為1∶25，提取溶劑為50%乙醇，單次提取時(shí)間為2 h，提取溫度為80℃。

圖1 提取次數(shù)（A）、料液比（B）、乙醇濃度（C）、提取時(shí)間（D）和提取溫度（E）對藥蜀葵總黃酮提取率的影響Fig 1 Effect of extraction time（A），solid-to-liquid ratio（B），ethanol concentration（C），extraction time（D）and extraction temperature（E）on the yield of total flavonoids of Althaea officinalis

2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

2.4.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以總黃酮提取率為響應(yīng)值，考察料液比（A）、提取時(shí)間（B）和乙醇濃度（C）三個因素，利用Design Expert 8.0軟件根據(jù)Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)并對相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，最后通過模型驗(yàn)證最佳提取工藝。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平如表1所示，結(jié)果如表2所示，方差分析如表3所示。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平
Tab 1 Factor and level of response surface experiment

水平 因素A.料液比 B.提取時(shí)間/h C.乙醇濃度/%－1 1∶20 1.5 40 0 1∶25 2.0 50 1 1∶30 2.5 60

2.4.2 優(yōu)化結(jié)果及分析 根據(jù)Box-Benhnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用Design Expert 8.0軟件對表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到總黃酮提取率

Y

的函數(shù)：

Y

＝2.244－0.05875

A

－0.0475

B

－0.00875

C

－0.0525

AB

＋0.04

AC

－0.0425

BC

－0.252

A

－0.2345

B

－0.182

C

。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果
Tab 2 Response surface design and experimental results

編號 A.料液比 B.乙醇濃度/% C.提取時(shí)間/hR.提取率/%1 1∶30 50 2.5 1.80 2 1∶20 60 2.0 1.84 3 1∶25 40 2.5 1.91 4 1∶30 40 2.0 1.78 5 1∶25 50 2.0 2.30 6 1∶20 40 2.0 1.87 7 1∶20 50 2.5 1.76 8 1∶25 40 1.5 1.80 9 1∶30 60 2.0 1.54 10 1∶20 50 1.5 1.90 11 1∶25 50 2.0 2.12 12 1∶25 60 2.5 1.77 13 1∶25 50 2.0 2.20 14 1∶25 60 1.5 1.83 15 1∶25 50 2.0 2.20 16 1∶25 50 2.0 2.40 17 1∶30 50 1.5 1.78

從表3可知模型的

F

＝9.290、

P

＜0.01，差異極顯著；失擬項(xiàng)

P

值為0.6815＞0.05，無顯著性差異，表明所選因素合理，不存在失擬因素；決定系數(shù)

R

＝0.9227和校正決定系數(shù)

R

＝0.8233表明實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛿M合程度良好；變異系數(shù)為5.02%，說明模型的重現(xiàn)性較好，回歸方程能夠解釋響應(yīng)值的變異，實(shí)驗(yàn)方法可靠，可用于藥蜀葵總黃酮提取工藝的條件優(yōu)化。模型中一次項(xiàng)

A

、

B

和

C

，二次項(xiàng)

C

，交互項(xiàng)

AB

、

AC

和

BC

對響應(yīng)值的影響均不顯著；二次項(xiàng)

A

、

B

（

P

＜0.01）對響應(yīng)值的影響極顯著，說明實(shí)驗(yàn)因素對響應(yīng)值的影響是非線性關(guān)系。

表3 方差分析結(jié)果
Tab 3 Analysis of variance

方差來源 平方和 自由度 均方和 F值 P值模型 0.780 9 0.087 9.290 0.0039 A 0.028 1 0.028 2.950 0.1296 B 0.018 1 0.018 1.930 0.2076 C 0.001 1 0.001 0.065 0.8055 AB 0.011 1 0.011 1.180 0.3138 AC 0.006 1 0.006 0.680 0.4357 BC 0.007 1 0.007 0.770 0.4089 A2 0.270 1 0.270 28.560 0.0011 B2 0.230 1 0.230 24.730 0.0016 C2 0.140 1 0.140 14.890 0.0062殘差 0.066 7 0.009失擬項(xiàng) 0.019 3 0.006 0.540 0.6815純誤差 0.047 4 0.012總和 0.848 16 R2＝0.9227 R2 Adj＝0.8233

響應(yīng)曲面圖能夠直觀反映各因素對提取率的影響程度，坡度越陡峭，說明操作條件對響應(yīng)值的影響越顯著。如圖2所示，料液比對藥蜀葵總黃酮提取率影響最為顯著，其次是乙醇濃度和提取時(shí)間。

圖2 各提取因素之間的交互影響Fig 2 Different factors on the yield of flavonoids

2.4.3 最佳工藝條件及驗(yàn)證 通過對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到藥蜀葵的最佳提取工藝：提取次數(shù)2次，提取溫度80℃，乙醇濃度49.135%、料液比1∶24.451、提取時(shí)間1.987 h，藥蜀葵總黃酮提取率理論值為2.25%。由于實(shí)際操作的局限性，調(diào)整乙醇濃度為49.0%、料液比為1∶25、提取時(shí)間為2.0 h，其他條件不變，進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到藥蜀葵總黃酮的平均提取率為2.15%，

RSD

為0.50%，驗(yàn)證結(jié)果與模型預(yù)測接近，表明所建立模型可靠，最優(yōu)工藝可行性高。

2.5 總黃酮的富集和純化

將最優(yōu)工藝下的提取液減壓濃縮至無醇味，吸附于預(yù)處理的大孔樹脂色譜柱（D101，12 cm×85 cm），依次用水、70%乙醇洗脫，收集70%洗脫液濃縮為干浸膏，采用“2.2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行黃酮含量測定。結(jié)果顯示經(jīng)過D101大孔樹脂富集純化后得到的藥蜀葵總黃酮純度達(dá)到53.62%。

2.6 體外抗氧化活性測試

2.6.1 DPPH活性測試 參考文獻(xiàn)：精密量取100 μL不同濃度的樣品溶液于96孔板中，加入0.1 mmol·LDPPH溶液100 μL，避光反應(yīng)30 min（室溫），于517 nm處測定吸光度值（

A

），設(shè)置樣品對照組

A

（等量無水乙醇代替DPPH溶液），對照組

A

（等量無水乙醇代替樣品溶液），空白對照

A

組（無水乙醇）和陽性對照組（V）。平行操作3次，計(jì)算清除率，清除率（%）＝[1－（

A

－

A

）/（

A

－

A

）]×100%。2.6.2 ABTS活性測試 將7.4 mmoL·LABTS溶液和2.6 mmoL·L過硫酸鉀溶液按1∶1混合，于室溫避光放置過夜后得到ABTS母液，稀釋母液至（0.7±0.02）（

A

），即得ABTS工作液。精確量取不同濃度的樣品溶液50 μL于96孔板中，加入150 μL ABTS工作液，搖勻，靜置6 min，于734 nm處測定吸光度值。設(shè)置樣品對照組、對照組、空白對照組和陽性對照組（同DPPH法），平行操作3次，清除率計(jì)算同DPPH法。結(jié)果如圖3A、3C所示，藥蜀葵總黃酮在測定的濃度范圍內(nèi)對DPPH、ABTS自由基的清除具有濃度依賴性。其

IC

值分別為（8.36±0.06）μg·mL、（8.45±0.14）μg·mL。陽性對照V的測試結(jié)果如圖3B、3D所示，V在2.0～15.6 μg·mL內(nèi)對DPPH自由基的清除能力與濃度呈線性關(guān)系，其

IC

值為（6.40±0.31）μg·mL；在0.5～3.9 μg·mL內(nèi)對ABTS自由基的清除能力與濃度呈線性關(guān)系，其

IC

值為（2.77±0.09）μg·mL。

圖3 藥蜀葵總黃酮和陽性對照VC對DPPH（A，B）和ABTS（C，D）自由基清除能力Fig 3 Scavenging effect of flavonoids and VC to DPPH（A，B）and ABTS（C，D）free radical

2.7 體外抑制α-葡萄糖苷酶活性測試

本研究采用酶標(biāo)儀微量法作為藥蜀葵富集純化后總黃酮體外抑制

α

-葡萄糖苷酶活性的檢測手段。實(shí)驗(yàn)所用的緩沖溶液、底物溶液和酶液的配制方法參照文獻(xiàn)，具體步驟簡述如下：精密稱取藥蜀葵富集純化后總黃酮適量，用PBS緩沖溶液配制成不同濃度的樣品溶液。將50 μL樣品溶液，100 μL 0.1 U·mL

α-

葡萄糖苷酶溶液（用pH 6.9，0.1 moL·LPBS配制）依次加入到96孔板中，25℃下孵育5 min，立即加入5 mmoL·L底物（對硝基苯基-

α

-

D

-吡喃葡萄糖溶液）50 μL啟動反應(yīng)，25℃下孵育5 min，孵育前后，記錄405 nm處吸光度值。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置樣品組

A

（加樣品、底物和酶液），酶組

A

（用PBS代替樣品），陽性對照組（阿卡波糖），平行操作3次，計(jì)算抑制率，抑制率（%）＝[（△

A

－△

A

）/△

A

]×100%。藥蜀葵作為傳統(tǒng)的藥食兩用植物，其具有明確的降血糖功效?；诖?，作者對藥蜀葵總黃酮進(jìn)行了

α-

葡萄糖苷酶抑制活性測試。結(jié)果如圖4，藥蜀葵總黃酮在測試濃度范圍（7.8～250.0 μg·mL）對

α

-葡萄糖苷酶具有明顯的抑制作用且呈現(xiàn)濃度依賴性，其

IC

值為（76.63±1.12）μg·mL，抑制作用強(qiáng)于陽性對照阿卡波糖[

IC

值為（323.43±7.06） μg·mL]。

圖4 藥蜀葵總黃酮抑制α-葡萄糖苷酶量效關(guān)系Fig 4 Dose-effect relationship for total flavonoids of Althaea officinalis inhibiting α-glucosidase

3 討論和結(jié)論

本研究首次利用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)優(yōu)化得到藥蜀葵總黃酮的最佳提取工藝條件：提取次數(shù)2次，提取溫度80℃，料液比為1∶25，提取時(shí)間2.0 h，乙醇濃度49.0%，在該條件下預(yù)測提取率為2.25%，實(shí)際提取率為2.15%，預(yù)測值與測定值相符，表明優(yōu)化的工藝可靠。由于經(jīng)過最優(yōu)提取工藝得到的是含有藥蜀葵總黃酮的粗提物，且提取率較低，因此需要對粗提物進(jìn)一步的富集純化，以便后續(xù)的活性研究。D101大孔樹脂是分離純化總黃酮應(yīng)用較為廣泛的非極性大孔樹脂；基于后續(xù)藥蜀葵總黃酮工業(yè)化大生產(chǎn)的考慮，本研究選擇D101大孔樹脂進(jìn)行富集純化，其總黃酮純度達(dá)到53.62%。

許多疾病的發(fā)生與氧化有著密切的關(guān)系，其中自由基引發(fā)的氧化會導(dǎo)致機(jī)體衰老。攝入抗氧化物質(zhì)能夠降低自由基對機(jī)體的氧化損傷。DPPH自由基和ABTS自由基是表征物質(zhì)抗氧化活性實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用最為經(jīng)典的模型。本研究結(jié)果表明，藥蜀葵總黃酮對DPPH自由基和ABTS自由基均具有顯著的清除作用，特別是清除DPPH自由基的能力與陽性對照V相當(dāng)。經(jīng)過本研究富集純化所得的總黃酮抗氧化能力顯著，可為開發(fā)天然高效的抗氧化物質(zhì)提供思路。

糖尿病是嚴(yán)重威脅人類健康的三大疾病之一。持續(xù)性高血糖會引發(fā)一系列并發(fā)癥，如心血管疾病等。有效控制餐后血糖上升是防治疾病發(fā)生的必要措施。

α

-葡萄糖苷酶作為降低餐后血糖的有效分子靶標(biāo)，在碳水化合物轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟堑倪^程中至關(guān)重要。目前臨床常用藥物如阿卡波糖等，雖然降血糖作用顯著，但長期服用會引起多種不良反應(yīng)，甚至產(chǎn)生耐藥性。因此，亟待尋找和開發(fā)新的

α-

葡萄糖苷酶抑制劑。相較于阿卡波糖，本研究首次發(fā)現(xiàn)富集純化得到的藥蜀葵總黃酮抗

α-

葡萄糖苷酶活性顯著，其

IC

值為（76.63±1.12） μg·mL。本研究結(jié)果可為藥蜀葵中總黃酮的開發(fā)利用提供參考。