周太敏，何華，徐嬌，江維克，潘琪，張成剛，周濤（貴州中醫(yī)藥大學，貴陽 550025）

中藥材續(xù)斷來源于川續(xù)斷科植物川續(xù)斷

Dipsacus asper

Wall. ex Henry的干燥根，具有補肝腎、強筋骨、續(xù)折傷等功效。川續(xù)斷皂苷Ⅵ是續(xù)斷藥材質(zhì)量評價的指標成分，現(xiàn)代藥理研究表明其能預防骨質(zhì)疏松、鎮(zhèn)痛。2020年版《中國藥典》規(guī)定續(xù)斷藥材需進行發(fā)汗加工。已有研究結(jié)果表明，續(xù)斷經(jīng)發(fā)汗加工后，川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量會顯著升高，但是其對應的機制尚不清楚。研究表明，真菌在促進萜類、生物堿類等中藥活性成分的轉(zhuǎn)化及積累中發(fā)揮作用，可以用于提高中藥活性成分的含量，其對應的機制主要包括提供底物轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶以及作為誘導子激發(fā)特定次級代謝產(chǎn)物的合成。趙慧在厚樸發(fā)汗的研究中發(fā)現(xiàn)，不同發(fā)汗階段的厚樸中內(nèi)生真菌的數(shù)量存在差異，而內(nèi)生真菌會對厚樸次級代謝產(chǎn)物的形成具有一定影響。

基于上述研究背景，推測續(xù)斷發(fā)汗后藥材中川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量的變化與其真菌群落的構(gòu)成有一定關(guān)系。因此，本研究在前期建立的續(xù)斷發(fā)汗條件的基礎(chǔ)上，對續(xù)斷發(fā)汗前后藥材中的真菌群落進行高通量測序，分析發(fā)汗前后續(xù)斷中的真菌群落差異，篩選出發(fā)汗續(xù)斷中的優(yōu)勢菌，將優(yōu)勢菌制備成誘導子與川續(xù)斷無菌苗共培養(yǎng)，探討優(yōu)勢菌對發(fā)汗藥材中川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量變化的影響，為解析中藥材發(fā)汗加工的科學內(nèi)涵奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 試藥

新鮮川續(xù)斷、川續(xù)斷成熟種子采于貴州省龍里縣，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學江維克教授鑒定為川續(xù)斷科植物川續(xù)斷

Dipsacus asper

Wall. ex Henry。將根洗凈，切段，取部分進行發(fā)汗處理，標記為DP3，未發(fā)汗樣品標記為CK。川續(xù)斷無菌苗來源于貴州中醫(yī)藥大學中藥民族藥資源研究院組培室；鐮刀菌屬（

Fusarium

sp.）菌株J35由本課題組從川續(xù)斷中分離鑒定。

對照品川續(xù)斷皂苷Ⅵ（批號：111685-201305，純度：99.29%，成都埃法生物科技有限公司）；乙腈（色譜純）、95%乙醇（分析純）（國藥集團化學試劑有限公司）；水為自制超純水；其他試劑均為分析純。微生物總DNA提取采用DNA試劑盒（Omega Biotek）；在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行微生物測序。

1.2 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀（Alliance 2695，美國沃特斯公司）；電子天平（AG285，瑞士梅特勒公司）；振蕩培養(yǎng)箱（BSD-150，上海博訊醫(yī)療生物儀器）；PCR擴增儀（ABIGene Amp 9700型，美國）；5810R臺式冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；Nanodrop 2000微量核酸定量分析儀（美國Thermo公司）。

2 方法

2.1 續(xù)斷發(fā)汗前后樣品的DNA提取和測序

將發(fā)汗前后的樣品分別用液氮研磨成細粉，平均分為3份，DNA試劑盒提取總DNA，檢測樣品DNA濃度和純度，PCR擴增真菌ITS1區(qū)，引物：ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2R （5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）。擴增體系：引物ITS1F（5 μmol·L）和ITS2R（5 μmol·L）各0.8 μL，10×緩沖液和dNTPs（2.5 mmol·L）各2 μL，rTaq Polymerase 0.2 μL，BSA 0.2 μL，DNA模 板 10 ng，超 純 水補足至20 μL。PCR擴增程序為：95℃預變性3 min，30個循環(huán)（95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s），72℃后延伸10 min。將真菌擴增子構(gòu)建Miseq文庫并測序。

2.2 測序數(shù)據(jù)分析

原始序列使用Flash（1.2.11）軟件進行序列拼接，F(xiàn)astp 軟件質(zhì)控。根據(jù)聚類分析序列之間的相似性分為多個操作單元（Operational taxonomic unit，OTU），序列相似性域值97%，Usearch軟件（http：//www.drive5.com/usearch/）對物種OTU進行聚類和生物信息統(tǒng)計分析。RDP classifier 軟件（https：//sourceforge.net/projects/rdp-classifier/）對每條序列進行物種分類注釋。真菌ITS數(shù)據(jù)庫為Unite（Release 8.0 http：//unite.ut.ee/index.php）。利用Mothur軟件（https：//www.mothur.org/wiki/Download_mothur）進行Alpha多樣性分析；基于分類學信息（域、界、門、綱、目、科、屬、種），運用R語言等相關(guān)軟件對發(fā)汗前后樣本的群落組成進行分析。根據(jù)發(fā)汗前后真菌物種差異分析得到的群落豐度數(shù)據(jù)，找出具有顯著差異的物種。

2.3 真菌誘導子的制備及共培養(yǎng)

鐮刀菌屬（

Fusarium

sp.）菌株J35接種于PDA液體培養(yǎng)基中，在搖床上以200 r·min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)5 d，分為兩份。一份用于川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量分析，另一份用于制備真菌誘導子。121℃高溫高壓滅菌20 min，分離出菌絲體，接種至生長狀況健康且較一致的組培苗，共培養(yǎng)60 d，采用HPLC檢測川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量。

2.4 川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量的測定

2.4.1 對照品溶液的制備 取適量川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品精密稱定，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，稀釋至質(zhì)量濃度為0.1016 mg·mL。

2.4.2 供試品溶液的制備 取“2.3”項下PDA液體培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)的真菌，分離菌絲及發(fā)酵液。量取發(fā)酵液40 mL減壓濃縮至黏稠，甲醇定容至40 mL，超聲40 min，過濾，濃縮，吸取2 mL色譜甲醇溶解，0.45 μm濾膜過濾，即得樣品。菌絲用甲醇定容至40 mL，后續(xù)制備同發(fā)酵液。菌株J35制備的誘導子與川續(xù)斷無菌苗共培養(yǎng)60 d后，去除無菌苗根表面瓊脂，清水洗凈，45℃烘干。磨成細粉，稱取10 mg于2 mL離心管中，吸取1.5 mL甲醇，超聲30 min，放冷。離心，吸取上清液于2 mL離心管中，揮干，精密吸取400 μL色譜甲醇溶解，0.45 μm濾膜過濾，即得樣品。

2.4.3 色譜條件 色譜柱為Symmetry-C（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈-水（30∶70），檢測波長為212 nm，進樣量為20 μL，流速為1.0 mL·min，柱溫為30℃。

3 結(jié)果與分析

3.1 續(xù)斷發(fā)汗前后樣品測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

發(fā)汗前后樣品的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)控及過濾后，獲得序列數(shù)及序列長度等信息，見表1。序列數(shù)平均52 448條；堿基數(shù)平均為13 343 250 bp；每條序列平均長度為255 bp。CK和DP3樣本的Coverage指數(shù)超過99%（見表2），表明樣本中大多數(shù)真菌群落均檢測到，數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠，可用于后續(xù)分析。

表1 續(xù)斷發(fā)汗前后樣品的測序數(shù)據(jù)
Tab 1 Sequencing data in crude and sweated

樣品信息 序列數(shù)/條 堿基數(shù)/bp 序列長度/bp CK_1 49 808 13 793 650 277 CK_2 47 057 12 442 372 264 CK_3 51 635 13 577 654 263 DP3_1 50 195 12 202 047 243 DP3_2 53 205 12 842 421 241 DP3_3 62 788 15 201 356 242

3.2 Alpha多樣性分析

對發(fā)汗前后樣品的Alpha多樣性指數(shù)的分析見表2。Shannon和Simpson指數(shù)均可反映樣品中微生物的多樣性。Simpson指數(shù)值越大，說明群落多樣性越低；而Shannon值越大，說明群落多樣性越高。根據(jù)上述衡量標準，結(jié)合CK和DP3樣本的Shannon和Simpson指數(shù)，表明發(fā)汗后續(xù)斷中真菌群落的多樣性升高，但是兩者差異并無統(tǒng)計學意義。進一步對兩組樣本的Ace和Chao指數(shù)進行了分析，結(jié)果表明Ace和Chao指數(shù)在DP3樣品中均較高，表明發(fā)汗后續(xù)斷中真菌群落的豐富度顯著提高。

表2 續(xù)斷發(fā)汗前后樣品的Alpha多樣性評估指數(shù)統(tǒng)計
Tab 2 Alpha diversity evaluation indexes in both crude and sweated

注：與CK相比，＜0.05，＜0.01。
Note：Compared with the CK，＜0.05，＜0.01.

評估指數(shù) CK DP3 Shannon 2.731±0.265 3.236±0.011 Simpson 0.155±0.053 0.101±0.004 Ace 154.150±13.545 222.940±16.857**Chao 154.82±13.732 222.400±16.165**Coverage 0.999±4.250×10－5 0.999±6.40×10－5*

3.3 續(xù)斷發(fā)汗前后樣品的真菌群落組成及優(yōu)勢菌分析

CK和DP3樣品在屬水平上的真菌組成見圖1。續(xù)斷發(fā)汗前后樣品中共鑒定到200個屬的真菌群落，其中有35個屬的真菌群落在發(fā)汗前后樣品中的相對豐度具有顯著差異（見表3），表明續(xù)斷發(fā)汗前后樣品中真菌組成的種類沒有改變，但是其相對豐度發(fā)生了明顯變化。由表3可知，續(xù)斷發(fā)汗后，蜜環(huán)菌屬 （

Armillaria

sp.）及螺旋聚孢霉屬（

Clonostachys

sp.）的真菌相對豐度分別下降了77%和81%，而鐮刀菌屬（

Fusarium

sp.）真菌的相對豐度是發(fā)汗前的16.8倍左右，成為了優(yōu)勢菌屬。

表3 續(xù)斷發(fā)汗前后樣品真菌相對豐度差異性分析
Tab 3 Difference of fungi relative abundance in crude and sweated

注：與CK相比， ＜0.05，＜0.01，＜0.001。
Note：Compared with the CK，＜0.05，＜0.01， ＜0.001.

菌屬 CK相對豐度 DP3相對豐度Armillaria sp. 33.140±8.522 7.487±0.910*Fusarium sp. 1.635±1.105 27.520±0.874***Clonostachys sp. 14.760±2.722 2.768±0.315*Minimelanolocus sp. 6.560±0.176 3.966±0.130*unclassified_f_Herpotrichiellaceae 1.935±0.317 5.786±0.388***Cyphellophora sp. 5.756±0.836 1.032±0.042*Cladosporium sp. 0.610±0.112 4.414±0.603**Alternaria sp. 0.240±0.054 3.055±0.781*Ilyonectria sp. 0.407±0.259 2.497±0.090**Neocosmospora sp. 0.149±0.045 2.283±0.112*Dactylonectria sp. 0.716±0.159 1.300±0.096**Plectosphaerella sp. 0.122±0.135 1.083±0.399*Macrophomina sp. 0.011±0.012 1.161±0.358*Cephalotrichum sp. 0.925±0.244 0.163±0.060*Titaea sp. 0.782±0.217 0.235±0.024*Filobasidium sp. 0.292±0.173 0.721±0.0417*Gibberella sp. 0.031±0.031 0.980±0.115**Trichoderma sp. 0.052±0.011 0.716±0.267*unclassified_o_Branch06 0.526±0.111 0.115±0.022*Thanatephorus sp. 0.126±0.027 0.270±0.062*Aureobasidium sp. 0.049±0.021 0.342±0.116*Alatospora sp. 0.317±0.073 0.031±0.013*Penicillium sp. 0.270±0.071 0.055±0.013*Hannaella sp. 0.032±0.032 0.277±0.093*unclassified_o_Saccharomycetales 0.003±0.005 0.260±0.099*unclassified_f_Nectriaceae 0.047±0.028 0.160±0.026**Dictyocheirospora sp. 0.061±0.021 0.136±0.024*Colletotrichum sp. 0.006±0.010 0.184±0.055*Cladophialophora sp. 0.159±0.058 0.009±0.009*Cylindrocarpon sp. 0.025±0.012 0.117±0.019**Haematonectria sp. 0.009±0.015 0.010±0.038*Metarhizium sp. 0.008±0.014 0.045±0.011*Setophoma sp. 0.001±0.002 0.051±0.010*Uncispora sp. 0 0.212±0.076*Memnoniella sp. 0 0.084±0.021*

圖1 CK和DP3樣本中真菌在屬水平上群落組成分析Fig 1 Community composition of fungi in CK and DP3 samples at the genus level

3.4 優(yōu)勢菌屬的真菌J35對川續(xù)斷無菌苗中川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量的影響

課題組利用前期從川續(xù)斷中分離的鐮刀菌屬內(nèi)生真菌J35（

Fusarium

sp.）進行相關(guān)樣品中川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量的檢測，結(jié)果顯示，J35發(fā)酵培養(yǎng)的發(fā)酵液及分離的菌絲體中雖未檢測到川續(xù)斷皂苷Ⅵ，但J35菌絲體制備的誘導子與川續(xù)斷無菌苗共培養(yǎng)60 d后，川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量相比對照組（未加誘導子的川續(xù)斷無菌苗）顯著提高了約5.4倍（見圖2）。該結(jié)果表明，J35制備的誘導子能夠促進川續(xù)斷皂苷Ⅵ的積累，推測續(xù)斷發(fā)汗后川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量升高與鐮刀菌屬真菌相關(guān)，可能與鐮刀菌屬真菌產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物激發(fā)的信號通路有關(guān)。

圖2 不同處理樣品中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量比較分析Fig 2 Comparative analysis of asperosaponinⅥ content in different treatment samples

4 討論

本研究通過真菌群落的高通量測序，發(fā)現(xiàn)續(xù)斷發(fā)汗后真菌群落的物種多樣性及豐富度均提高，鐮刀菌屬 （

Fusarium

sp.）、新赤殼屬（

Ilyonectria

sp.）以及赤霉菌屬（

Gibberella

sp.）等真菌群落的相對豐度顯著提高，表明發(fā)汗過程促進了上述真菌的增殖和代謝，這可能是發(fā)汗改變了續(xù)斷藥材的溫、濕條件從而影響微生物的代謝活動。

鐮刀菌屬真菌在續(xù)斷藥材發(fā)汗后相對豐度明顯增加，其對應菌屬的真菌J35菌絲體制備的誘導子能顯著提高川續(xù)斷無菌苗根中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量，而其本身并不產(chǎn)生川續(xù)斷皂苷Ⅵ，表明J35可能是作為一個誘導因子通過調(diào)節(jié)或激活信號傳導途徑中與川續(xù)斷皂苷Ⅵ合成相關(guān)酶的表達，從而影響川續(xù)斷皂苷Ⅵ的合成和積累，這個過程可能還涉及茉莉酸、水楊酸、一氧化氮以及活性氧等信號分子。胡正平等通過茉莉酸甲酯（MeJA）處理川續(xù)斷的研究表明，MeJA可通過上調(diào)川續(xù)斷皂苷Ⅵ合成關(guān)鍵酶基因的表達來促進川續(xù)斷皂苷Ⅵ的積累，進一步表明茉莉酸在促進川續(xù)斷皂苷Ⅵ積累中的作用。課題組后續(xù)將繼續(xù)探討J35促進川續(xù)斷皂苷Ⅵ積累的機制，研究續(xù)斷發(fā)汗過程影響三萜皂苷類成分變化的機制，為揭示中藥材發(fā)汗加工的科學內(nèi)涵奠定理論基礎(chǔ)。