鄭東梅，王星晨，張瑩，劉星星，劉雪英，王慶偉，3*（. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽(yáng)7206；2. 空軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系藥物化學(xué)教研室，西安 70032；3. 西安秦皇醫(yī)院，西安 70600；. 西安培華學(xué)院，西安7025）

肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是肺臟損傷后常見(jiàn)的病理過(guò)程，目前研究認(rèn)為肺纖維化不可逆，嚴(yán)重者可引起呼吸衰竭。中醫(yī)將肺纖維化歸屬為“肺痿”范疇，肺痿以氣虛為根本病機(jī)，病證以痰、熱最為多見(jiàn)，病位在肺、胃，可累及脾腎，病理上肺脾腎三臟病變可互相影響；現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，纖維化類(lèi)疾病均表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，其生物過(guò)程包含某些炎性細(xì)胞、纖維化因子、炎癥因子及相關(guān)蛋白參與的關(guān)鍵通路等。

黃芪，歸脾、肺經(jīng)，可補(bǔ)肺脾之氣，生津止渴。知母，歸肺、胃、腎經(jīng)，可滋腎陰，潤(rùn)肺燥，瀉腎火。近代醫(yī)家張錫純所著的《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》中記載黃芪、知母常作為藥對(duì)配伍的方劑有玉津湯、升陷湯、理郁升陷湯及速降糖煎Ⅱ號(hào)，現(xiàn)代藥學(xué)專(zhuān)著《施今墨對(duì)藥》 《中藥藥對(duì)大全》均收錄了黃芪-知母藥對(duì)。在黃芪-知母藥對(duì)有效成分含量的測(cè)定中，陳沛鑫等發(fā)現(xiàn)，與單味藥相比，兩者同比例配伍時(shí)更有利于成分溶出與轉(zhuǎn)化。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪-知母同比例配伍常用于治療肺病，在新型冠狀病毒肺炎中也有應(yīng)用，但其作用機(jī)制尚不明確。肺部疾病常伴隨著炎癥的產(chǎn)生，慢性炎癥可進(jìn)一步發(fā)展為肺纖維化，嚴(yán)重者甚至發(fā)展為肺癌?；诖?，本實(shí)驗(yàn)擬采用博來(lái)霉素誘導(dǎo)大鼠肺纖維化，初步研究黃芪-知母藥對(duì)（1∶1）對(duì)肺纖維化的抗炎作用，并探討其機(jī)制，為中藥的臨床應(yīng)用及二次開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性SD大鼠62只，體質(zhì)量（200±20）g [空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（軍）2015-006]。

1.2 試藥

黃芪、知母均購(gòu)于西安天晟中藥飲片公司，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)白吉慶教授鑒定，黃芪為豆科植物蒙古黃芪

Astragalus membranaceus

（Fisch.）Bge.

var. mongholicus

（Bge.）Hsiao的干燥根；知母為百合科植物知母

Anemarrhena asphodeloides

Bge的干燥根莖。

稱(chēng)取黃芪、知母藥材，每份約3 kg，6倍量80%乙醇加熱回流提取，每次2 h，合并醇提取液，旋蒸，濃縮，減壓回收乙醇，得黃芪浸膏1.335 kg，濃縮至每克提取物相當(dāng)于原藥材1.972 g；得知母浸膏1.686 kg，濃縮至每克提取物相當(dāng)于原藥材1.532 g，置4℃冰箱冷藏備用。

注射用鹽酸博來(lái)霉素（H 20055883，瀚暉制藥有限公司）；蘇木精伊紅（HE）染色液（G1005，武漢谷歌生物科技有限公司）；Masson染色套裝（G1006，Servicebio）；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-

β

（TGF-

β

）試劑盒、腫瘤壞死因子-

α

（TNF-

α

）試劑盒、白介素-10（IL-10）試劑盒（江蘇酶免有限公司）；核轉(zhuǎn)錄因子-

κ

B p65（NF-

κ

B p65）抗體（AF5006）、

α

-平滑肌肌動(dòng)蛋白（

α

-SMA）抗體（AF1032）（Affinity公司）；TNF-

α

（ER 1919-22）、GAPDH抗 體（ET 1601-4）（華安生物有限公司）；HRP標(biāo)記山羊抗兔抗體（GB 23303）、組化試劑盒DAB顯色劑（G1211）（Servicebio公司）。

1.3 儀器

xn300血細(xì)胞分析儀（希斯美康）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；RM2016病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）；Nikon Eclipse E100型正置光學(xué)顯微鏡、Nikon DS-U3型成像系統(tǒng)（日本尼康）；XSP-C204型顯微鏡（CIC）；TANON-5200型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥

健康SD雄性大鼠62只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取52只，腹腔注射20%烏拉坦（5 mL·kg）進(jìn)行麻醉，在大鼠頸部剪1 cm小口，鈍性鑷子逐層分離頸部肌肉，直至暴露氣管，用1 mL注射器緩慢注入博來(lái)霉素（5 mg·kg），注入后立即將大鼠直立并左右旋轉(zhuǎn)，使藥液在肺內(nèi)均勻分布，建立大鼠纖維化模型。取剩余同批次大鼠10只，作為正常組。造模2周后，隨機(jī)選取經(jīng)博來(lái)霉素處理過(guò)的大鼠2只處死，取肺組織行HE和Masson染色，觀察到有大量炎性改變和膠原生成，確定肺纖維化模型復(fù)制成功。造模成功后，取剩余的50只大鼠，運(yùn)用隨機(jī)數(shù)表法將其分為模型組、醋酸潑尼松組、黃芪組、知母組、黃芪-知母藥對(duì)組，每組10只。正常組給予0.5%的羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）水溶液灌胃；模型組造模后予以0.5%的CMC-Na水溶液灌胃；醋酸潑尼松組給予醋酸潑尼松3 mg·kg；黃芪、知母給藥劑量參照《中藥藥理與實(shí)驗(yàn)方法》中人與大鼠表皮面積換算，分別為0.6846 g·kg和0.8812 g·kg；黃芪-知母藥對(duì)組給藥劑量以黃芪、知母生藥量計(jì)算。所有藥物均用0.5%的CMC-Na配制成溶液，每日給藥一次，每次5 mL·kg，連續(xù)給藥28 d。

2.2 取材

末次給藥后，大鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射20%烏拉坦（5 mL·kg）麻醉，頸總動(dòng)脈取血用于外周血細(xì)胞檢測(cè)。取肺組織，水洗，濾紙吸干，稱(chēng)定質(zhì)量，左側(cè)肺葉固定于4%多聚甲醛，右側(cè)肺葉于凍存管－80℃冰箱備用。

2.3 HE染色觀察肺臟病理學(xué)變化

各組大鼠左側(cè)部分肺組織制成石蠟切片，將脫蠟水化的切片進(jìn)行蘇木精染色，鹽酸水溶液分化，氨水水溶液返藍(lán)，伊紅染色，脫水，封片，觀察肺臟炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔內(nèi)有無(wú)滲出物，有無(wú)充血水腫改變等，并采用Image J軟件對(duì)炎性細(xì)胞的藍(lán)色陽(yáng)性染色進(jìn)行相對(duì)定量分析，通過(guò)計(jì)算炎性細(xì)胞陽(yáng)性面積和陽(yáng)性區(qū)域進(jìn)行定量。

2.4 Masson染色觀察肺臟膠原沉積程度

Masson染色按照試劑盒依次操作，左側(cè)肺組織切片脫水，封片，觀察肺泡結(jié)構(gòu)及纖維結(jié)節(jié)，膠原沉積情況，并采用Image J軟件對(duì)膠原纖維的藍(lán)色陽(yáng)性染色進(jìn)行相對(duì)定量分析，通過(guò)計(jì)算膠原纖維陽(yáng)性面積和陽(yáng)性區(qū)域進(jìn)行定量。

2.5 ELISA試劑盒測(cè)定大鼠血清中TNF-α、IL-10、TGF-β1水平

將凍存的血清樣本梯度放入－20℃和4℃解凍，試劑盒平衡到室溫，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟加樣，溫育，洗板，檢測(cè)血清中TNF-

α

、IL-10、TGF-

β

含量變化。

2.6 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)NF-κB p65、TNF-α、α-SMA蛋白陽(yáng)性表達(dá)

石蠟切片脫蠟、水化后，枸櫞酸抗原修復(fù)緩沖液中進(jìn)行抗原修復(fù)，置內(nèi)源性過(guò)氧化物封閉液室溫避光孵育25 min，3%BSA室溫封閉30 min；加

α

-SMA（1∶1000）、TNF-

α

（1∶100）、NF

κ

B p65（1∶600）一抗，4℃孵育過(guò)夜；加二抗（1∶200），室溫孵育50 min；DAB顯色；蘇木素復(fù)染、脫水封片，陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色或深棕。

2.7 Western blot法定量檢測(cè)NF-κB p65、TNF-α、α-SMA蛋白表達(dá)

將右側(cè)肺組織剪碎，在冰上勻漿，加入裂解液 裂 解30 min，10 000 g·min，4℃離 心10 min，取上清液進(jìn)行蛋白定量，調(diào)整蛋白量后，取等量裂解產(chǎn)物，加入上樣緩沖液進(jìn)行SDSPAGE電泳，電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加一抗，4℃孵育過(guò)夜，PBST洗滌，加二抗，室溫孵育1 h，PBST洗滌，化學(xué)發(fā)光法顯色，成像掃描分析系統(tǒng)保存圖像。以GAPDH蛋白表達(dá)水平作為內(nèi)參，以各樣本與相應(yīng)內(nèi)參灰度值比值為蛋白相對(duì)含量。

2.8 統(tǒng)計(jì)分析

SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±

s

表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-

t

檢驗(yàn)，

P

＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 黃芪-知母藥對(duì)對(duì)肺纖維化大鼠病理變化的影響

正常組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)充血水腫結(jié)節(jié)現(xiàn)象；模型組大鼠肺泡間隔增寬，肺泡腔內(nèi)充滿分泌物及滲出物且大量炎性浸潤(rùn)（HE染色，見(jiàn)圖1a），肺實(shí)變區(qū)膠原增生明顯且聚集成塊狀（Masson染色，見(jiàn)圖1b），炎癥相對(duì)面積顯著增高（

P

＜0.01，見(jiàn)圖2a），肺臟纖維化相對(duì)面積顯著增高（

P

＜0.01，見(jiàn)圖2b）。與模型組比較，醋酸潑尼松組大鼠肺組織水腫、充血不明顯，肺臟損傷較為明顯和炎性改變減輕，肺泡腔見(jiàn)少量纖維組織及炎性浸潤(rùn)，其炎癥及纖維化相對(duì)面積均顯著下降（

P

＜0.01）。黃芪-知母藥對(duì)組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)較完整，肺泡腔內(nèi)少量滲出物，纖維增生不嚴(yán)重，可見(jiàn)少量炎性浸潤(rùn)及纖維結(jié)節(jié)出現(xiàn)，其炎癥及纖維化相對(duì)面積均顯著下降（

P

＜0.05，

P

＜0.01）。單味黃芪、知母治療后，肺泡結(jié)構(gòu)基本完整，但肺泡腔內(nèi)仍較多炎性浸潤(rùn)，纖維結(jié)節(jié)較多，與模型組相比，其炎癥和纖維化相對(duì)面積均有下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。

圖1 給藥28 d后各組大鼠HE染色（a）和Masson染色（b）情況（×100，n＝3）Fig 1 HE staining（a）and Masson staining（b）of rats 28 days after the administration（×100，n＝3）

圖2 各組肺纖維化大鼠肺臟炎性細(xì)胞（a）及纖維化面積（b）情況（n＝3）Fig 2 Relative area of pulmonary inflammatory cells（a）and fibrosis（b）of rat in each group（n＝3）

3.2 黃芪-知母藥對(duì)對(duì)肺纖維化大鼠外周血炎性細(xì)胞數(shù)目的影響

與正常組相比，模型組大鼠外周血白細(xì)胞數(shù)（WBC）、中性粒細(xì)胞數(shù)（PMN）、單核細(xì)胞數(shù)（MO）、淋巴細(xì)胞數(shù)（LYM）、嗜酸性細(xì)胞數(shù)（EO）均顯著升高（

P

＜0.01）。與模型組相比，醋酸潑尼松組WBC、PMN、MO、LYM、EO含量均顯著降低（

P

＜0.05，

P

＜0.01）；黃芪-知母藥對(duì)組WBC、PMN、MO、LYM顯著降低（

P

＜0.05，

P

＜0.01）；黃芪、知母組WBC、PMN、MO、EO、LYM含量均有降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05），見(jiàn)圖3。

3.3 黃芪-知母藥對(duì)對(duì)肺纖維化大鼠血清中炎癥因子含量的影響

與正常組相比，模型組大鼠血清TNF-

α

、TGF-

β

含量均顯著升高（

P

＜0.01），IL-10水平顯著降低（

P

＜0.01）。與模型組相比，醋酸潑尼松和黃芪-知母藥對(duì)組大鼠血清TNF-

α

、TGF-

β

含量均顯著降低（

P

＜0.05，

P

＜0.01），IL-10含量顯著升高（

P

＜0.01）；知母組大鼠血清中TGF-

β

含量顯著降低（

P

＜0.05）；黃芪組、知母組大鼠血清中IL-10含量均顯著升高（

P

＜0.05），但TNF-

α

含量變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖3。

3.4 黃芪-知母藥對(duì)對(duì)肺纖維化大鼠TNF-α、NF-κB p65、α-SMA蛋白表達(dá)的影響

與正常組相比，模型組大鼠肺泡區(qū)TNF-

α

、NF-

κ

B p65、

α

-SMA蛋白陽(yáng)性率及蛋白表達(dá)顯著升高（

P

＜0.05，

P

＜0.01）；與模型組相比，醋酸潑尼松組與黃芪-知母藥對(duì)組大鼠肺組織中TNF-

α

、NF-

κ

B p65、

α

-SMA蛋白陽(yáng)性率及蛋白表達(dá)顯著下降（

P

＜0.05，

P

＜0.01）（見(jiàn)圖4及圖5）。

圖5 黃芪-知母藥對(duì)對(duì)大鼠肺組織中TNF-α、NF-κB p65、α-SMA蛋白表達(dá)的影響Fig 5 Effect of Astragalus membranaceus and Rhizoma Anemarrhenae couplet medicines on TNF-α，NF-κB p65，and α-SMA protein expression in pulmonary tissues of rats

4 討論

肺纖維化是一種慢性、進(jìn)行性、致命性的纖維化間質(zhì)性疾病，發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。目前臨床多采用激素、免疫抑制劑及肺移植手術(shù)等進(jìn)行治療，但有一定的不良反應(yīng)及風(fēng)險(xiǎn)。近年來(lái)，中醫(yī)藥以多途徑、多靶點(diǎn)、副作用少、療效顯著等特點(diǎn)成為肺纖維化疾病的替代療法之一。肺纖維化疾病的發(fā)展可逐漸演變形成虛損性疾病，久之

患者肺臟損傷、消耗元?dú)?、肺虛失養(yǎng)，以致肺氣閉郁、陰血虧耗，最終導(dǎo)致肺纖維化的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)益氣養(yǎng)陰法較常規(guī)的激素及免疫抑制劑治療副作用更少，可改善患者肺功能、血氧飽和度，減緩肺纖維化進(jìn)程。

研究發(fā)現(xiàn)，黃芪作為治療肺纖維化使用頻率較高的補(bǔ)益類(lèi)藥物，可通過(guò)調(diào)控TNF-

α

的生成，抑制NF-

κ

B的活性來(lái)減輕肺組織炎癥損傷，保持肺組織結(jié)構(gòu)的完整。知母作為清熱兼滋陰藥，通過(guò)降低肺臟系數(shù)，提高肺臟、血清中肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白表達(dá)，減輕氣道及肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，減少肺損傷。黃芪-知母作為經(jīng)典藥對(duì)之一，均歸肺經(jīng)，其中黃芪性溫，味甘，可益氣、升陽(yáng)而固澀；知母性寒，味苦，滋陰、苦降而滑利，兩者合用，一溫一寒、一升一降、一收一散，達(dá)相輔相成之效，以此為基礎(chǔ)的中藥方劑清金益氣湯已在臨床廣泛應(yīng)用。已有研究表明，黃芪中總黃酮和皂苷類(lèi)成分通過(guò)介導(dǎo)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)干預(yù)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化，其中總皂苷通過(guò)調(diào)控TGF-

β

/smad信號(hào)抑制早期纖維化結(jié)節(jié)的產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，知母主要化學(xué)成分為皂苷和雙苯吡酮類(lèi)，知母皂苷BⅡ是皂苷類(lèi)成分的代表，其可在mRNA和蛋白質(zhì)水平上減少炎性細(xì)胞因子如IL-6及TNF-

α

的生成，且對(duì)核因子NF-

κ

B的活性具有一定抑制作用。有研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)雙苯吡酮類(lèi)芒果苷通過(guò)結(jié)合關(guān)鍵蛋白靶點(diǎn)環(huán)氧合酶-2（COX-2），影響NF-

κ

B炎癥通路，從而發(fā)揮抗炎作用。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)失控是導(dǎo)致纖維化發(fā)生的根源，也是促進(jìn)肺纖維化病程進(jìn)展的重要機(jī)制。肺臟發(fā)生纖維化后，肺臟組織細(xì)胞和相應(yīng)免疫細(xì)胞釋放大量炎性因子如TGF-

β

、IL-10、TNF-

α

，這些炎性因子相互作用，引發(fā)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，加重肺損傷。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定肺纖維化大鼠外周血炎性細(xì)胞數(shù)和肺纖維化大鼠血清中TNF-

α

、TGF-

β

和IL-10的含量，發(fā)現(xiàn)黃芪-知母藥對(duì)可調(diào)控炎性因子TNF-

α

、TGF-

β

和IL-10的水平，從而改善炎性損傷。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察了NF-

κ

B炎癥通路中TNF-

α

、NF-

κ

B p65、

α

-SMA蛋白的陽(yáng)性變化，探討黃芪-知母藥對(duì)調(diào)控肺纖維化大鼠NF-

κ

B炎癥反應(yīng)通路的作用機(jī)制。TNF-

α

是參與炎癥反應(yīng)關(guān)鍵的促炎因子，其過(guò)表達(dá)會(huì)趨化中性粒細(xì)胞，增加局部淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)，誘發(fā)炎性改變。據(jù)研究報(bào)道，TNF-

α

基因啟動(dòng)子含NF-

κ

B位點(diǎn)，激活NF-

κ

B信號(hào)通路，NF-

κ

B信號(hào)通路是調(diào)控炎癥反應(yīng)的重要通路之一，也是肺纖維化形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化過(guò)程中存在NF-

κ

B過(guò)度活化，亞基NF

κ

B p65磷酸化及總NF-

κ

B p65表達(dá)增加會(huì)釋放過(guò)量TNF-

α

、IL-1

β

、IL-6和 IL-10 等炎癥因子，使肺成纖維細(xì)胞增殖分化、活力增強(qiáng)，過(guò)度產(chǎn)生

α

-SMA，加快肺纖維化病變的程度；

α

-SMA是活化的成纖維細(xì)胞的標(biāo)志，其過(guò)度產(chǎn)生導(dǎo)致纖連蛋白、膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度分泌，膠原異常分泌是肺纖維化形成的根本原因，故

α

-SMA表達(dá)水平的多少判斷纖維化程度。此外，TNF-

α

可直接刺激肺成纖維細(xì)胞增殖，合成膠原蛋白，促進(jìn)肺纖維化進(jìn)程，因此抑制NF-

κ

B通路激活，減少TNF-

α

的釋放及

α

-SMA的合成是治療肺纖維化的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)采用Western blot法和免疫組織化學(xué)雙重定性定量考察TNF-

α

、NF-

κ

B p65和

α

-SMA蛋白在肺纖維化大鼠肺組織中表達(dá)的情況，發(fā)現(xiàn)黃芪、知母、黃芪-知母藥對(duì)可在不同程度上抑制肺纖維化大鼠TNF-

α

、NF-

κ

B p65和

α

-SMA蛋白表達(dá)，其中黃芪-知母藥對(duì)治療后肺臟NF-

κ

B P65蛋白表達(dá)較單味藥治療更低，這與組織病理學(xué)（Masson染色）觀察結(jié)果一致。綜上所述，黃芪-知母藥對(duì)可減輕肺臟炎癥進(jìn)而控制纖維化的發(fā)展，其機(jī)制可能與減少TNF-

α

、TGF-

β

的釋放及

α

-SMA的合成，升高抗炎因子IL-10水平，調(diào)控NF-

κ

B信號(hào)通路表達(dá)有關(guān)。本研究?jī)H從炎癥介質(zhì)調(diào)控方面探討了黃芪-知母藥對(duì)治療肺纖維化的作用和機(jī)制，其他作用機(jī)制需進(jìn)一步研究證實(shí)。