梁明川，蒙艷麗，王曉溪，王博，徐慧星，王欣，王磊，王偉明（黑龍江省中醫(yī)藥科學院，哈爾濱150036）

肺炎支原體（mycoplasma pneumoniae，MP）是呼吸道傳播和感染中最為常見的一種致病菌，在兒童群體中致病率較高。研究表明，MP感染可以直接造成肺呼吸道黏膜上皮細胞的損傷，是破壞肺組織結(jié)構(gòu)完整，誘發(fā)多種肺部系統(tǒng)疾病的主要影響因素。所以修復受損的肺組織在MP感染的治療中尤為重要。

表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）在支原體肺炎的治療和呼吸道黏膜修復中的作用逐漸成為研究的熱點。研究顯示，EGF于1962年被首次發(fā)現(xiàn)。EGF存在于大多數(shù)體液分泌物及組織中，尤其在肺臟中EGF表達較高。EGF可以對多種組織的表皮細胞如呼吸道上皮細胞的增殖、分化和修復起重要作用，并能促進肺血管類疾病的發(fā)生、發(fā)展。實驗表明，芩百清肺濃縮丸可通過調(diào)控小鼠肺組織中EGF的表達修復受損的肺上皮細胞。

Biacore分子互作檢測實驗基于表面等離子共振（surface plasmon resonance，SPR）技術，具有高靈敏度、免標記、實時監(jiān)測、樣品用量少等優(yōu)點，在生物制藥、新藥研發(fā)等相關領域有著廣泛的應用。徐明杭等通過Biacore實驗釣取了芩百清肺濃縮丸中與TGF-

β

1蛋白結(jié)合的親和活性成分為黃芩苷，并通過親和力實驗進行驗證。地龍又名蚯蚓，主要含有蚯蚓素、蚯蚓毒素、花生四烯酸等活性成分。當代研究表明，地龍對MP肺炎有較好的治療作用。地龍可通過調(diào)控TGF與

α

-SMA的表達來改善肺纖維化癥狀。本實驗主要通過Biacore系統(tǒng)檢測地龍與EGF蛋白體外是否存在有效結(jié)合，并應用MP感染動物模型，采用免疫組化（immunohistochemistry，IHC）、Western blot及RT-PCR實驗進行體內(nèi)驗證，闡明地龍對小鼠肺組織EGF表達的影響，為地龍治療MP感染的進一步研究和開發(fā)提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物

60只8周齡BALB/c小鼠，雌雄各半。購自哈爾濱醫(yī)科大學，飼養(yǎng)于黑龍江省中醫(yī)藥科學院實驗動物中心，許可證編號SCXK（黑）2019-001。本研究中的動物實驗得到了黑龍江省中醫(yī)藥科學院保護和使用委員會的批準（許可證號：[2011]93），依照《黑龍江省實驗動物護理和使用指南》進行。采用人道主義方式脫頸椎處死實驗動物。

1.2 試藥

地龍藥材購買自同仁堂香坊店，并由黑龍江省中醫(yī)藥科學院王偉明研究員鑒定為巨蚓科動物參環(huán)毛蚓的干燥完整體；TRIzol試劑（美國Invitrogen，批號：113604）；一抗EGF（Bioss公司，批號：bs-0086R）；EGF蛋白（Acro公司，批號：H525b）；Biacore T200試劑盒、CM5芯片（GEHealthcare公司，批號：10280148）；RT-PCR試劑盒（CWBIO公司，批號：29520），引物合成由上海Invitrogen公司完成。

1.3 儀器

Reverse Transcribe PCR儀 Tc-24/H（b）（中 國博日生物公司）；KD-BM生物組織包埋機、KDTS3A自動組織脫水機（浙江科迪儀器設備公司）。

1.4 提取地龍原液

稱取地龍飲片200.2 g，剪碎，用70%的乙醇回流提取兩次，將兩份提取液過濾并合并，調(diào)整相對密度為1.35（60℃）的浸膏，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法

2.1 蛋白純度檢測

通過SDS-PAGE凝膠電泳檢測EGF蛋白的純度，EGF蛋白的相對分子質(zhì)量為6.3 kDa。EGF用去離子水制備成200 mg·L的蛋白溶液，經(jīng)過制膠、上樣、電泳和切膠后，考馬斯亮藍染色2 h，再用脫色液進行脫色至背景完全清晰。使用凝膠成像儀對凝膠進行拍照并分析，與marker相對分子質(zhì)量條帶比較。

2.2 Biacore預富集實驗

采用單一通道流通方式，將EGF蛋白偶聯(lián)在2通道上，1通道作為參比通道。本實驗室前期實驗數(shù)據(jù)表明pH為4.0時的醋酸鹽溶液偶聯(lián)效果最好，故配制pH 4.0的醋酸鹽溶液并各取97 μL與3 μL EGF蛋白（400 mg·L）配制蛋白溶液加入到無蓋的1.5 mL離心管中。芯片結(jié)合采用氨基偶聯(lián)方式，另取一個無蓋的1.5 mL離心管加入200 μL氫氧化鈉放置在指定位置上。設置偶聯(lián)條件為溫度25℃，進樣60 s，流速10 μL·min，0.05 mol·LNaOH再生30 s進行預結(jié)合實驗，觀察RU值（Resonance unit，響應單位）。

2.3 Biacore配體偶聯(lián)實驗

取100 μL EDC與100 μL NHS混合均勻，以活化芯片表面。量取140 μL乙醇胺將1通道封閉。用pH 4.0醋酸鈉緩沖液180 μL＋EGF 20 μL（400 mg·L）配制蛋白溶液，蛋白以脈沖進樣的方式結(jié)合到芯片表面，芯片表面結(jié)合不牢的蛋白使用PBS緩沖液沖洗掉。偶聯(lián)時間設置為600 s，流速為10 μL·min。

2.4 地龍原液與EGF蛋白結(jié)合實驗

用PBS配制質(zhì)量濃度為4.8 g·L的地龍蛋白原液。進樣程序：進樣速度10 μL·min，進樣時間60 s，等待時間60 s，再生30 s。從Biacore輸出的傳感圖結(jié)果中觀察和分析RU值。

2.5 體內(nèi)動物實驗

2.5.1 MP培養(yǎng) 在無菌環(huán)境下復蘇MP，培養(yǎng)在含胎牛血清的PPLO培養(yǎng)基中，37℃孵箱培養(yǎng)，每日觀察，直至培養(yǎng)基變黃，按1∶9比例傳代。

2.5.2 建立MP感染模型 將60只小鼠雌雄分籠混養(yǎng)，適應性飼養(yǎng)7 d后，隨機分為6組，分別為空白組，模型組，陽性對照組（阿奇霉素），地龍高、中、低劑量組，每組10只。除空白組外，各組小鼠連續(xù)3 d以鼻滴入的方式給藥20 μL 1×10CCU MP培養(yǎng)液，MP感染成功后，陽性對照組（阿奇霉素22.5 mg·kg），地龍高（4.7 g·kg）、中（2.35 g·kg）、低（1.175 g·kg）劑量組，每日灌胃給藥1 mL，共10 d，空白組與模型組每日灌胃給予同等劑量的生理鹽水。10 d后脫頸椎處死小鼠，取小鼠肺組織于－80℃保存，備用后續(xù)實驗。

2.5.3 HE染色觀察肺組織形態(tài)變化 取各組小鼠新鮮的左肺組織提前用甲醛固定過夜后，石蠟包埋。在－20℃冰凍4 h后，使用組織切片機將組織切成厚度為5 μm的切片，使用HE染色試劑盒進行操作，樹脂封片。置于室溫通風處晾干2 h，在顯微鏡下觀察肺組織形態(tài)并拍照記錄。

2.5.4 IHC法檢測肺組織中EGF的表達 取各組小鼠右肺組織用自動石蠟包埋機包埋，切成厚度為5 μm的切片。使用免疫組化試劑盒說明書進行操作。樹脂封片后，20×光鏡下顯微鏡觀察EGF的表達，采用Image J分析軟件分析圖像，計算EGF的平均光密度值（

OD

值），對結(jié)果進行半定量分析。2.5.5 Western blot實驗檢測肺組織中EGF蛋白表達水平 取各組小鼠右肺組織提取組織蛋白，檢測蛋白濃度，15% SDS-PAGE電泳，EGF蛋白分子量約為6 kDa，切膠范圍為0～11 kDa，轉(zhuǎn)PVDF膜，Rabbit anti-EGF抗 體1∶1000稀 釋，4℃孵化整夜，山羊抗兔二抗室溫避光封閉孵化60 min，ECL顯影液封閉2 min。使用凝膠成像分析儀進行顯影，而后用凝膠圖像處理軟件Image J定量分析目標條帶的灰度值，以

β

-actin蛋白對目的蛋白進行標準化，分析蛋白變化差異。2.5.6 RT-PCR法檢測肺組織中EGF mRNA表達水平 提取各組小鼠左肺組織中的總mRNA，酶標儀檢測RNA濃度。EGF引物委托上海Invitrogen公司進行合成。使用一步法RT-PCR試劑盒步驟對目的基因進行擴增。引物基因序列：上游5'-GTCACCCACAGAAACAAT-3'，下游5'-AGGAGCGAACCTACTAAA-3'；

β

-actin F：5'-GACGGCCAGGTCATCACTATTG-3'，R：5'-AGGAAGGCTGGAAAAGAGCC-3'。采用2分析方法，計算目的基因的表達量。

2.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 26統(tǒng)計學軟件進行結(jié)果分析，數(shù)據(jù)以±s 表示，單因素方差分析方法分析組間差異，以

P

＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 蛋白純度

通過圖1可以看出，目的蛋白EGF條帶清晰對應相對分子質(zhì)量在0～11 kDa，符合EGF分子量范圍。EGF蛋白說明書表明蛋白純度大于0.95，符合Biacore操作要求，可用于后續(xù)操作。

圖1 EGF蛋白純度檢測Fig 1 Purity detection of EGF protein

3.2 EGF蛋白偶聯(lián)實驗

應用pH 4.0的醋酸鹽溶液緩沖液結(jié)果顯示目的蛋白EGF與CM5芯片的偶聯(lián)值達到616.6，表明EGF蛋白成功與芯片偶聯(lián)，見圖2。

圖2 Biacore實驗中EGF蛋白與芯片偶聯(lián)Fig 2 EGF protein and chip couple in Biacore experiment

3.3 地龍與EGF結(jié)合實驗

由圖3中可知，蛋白2通道曲線始終高于參比1通道，峰2（地龍）的binding值與基線有較高差值，表明地龍藥液與EGF蛋白在體外可以有效結(jié)合。

圖3 Biacore實驗地龍與EGF蛋白結(jié)合Fig 3 Binding of earthworm to EGF protein in Biacore experiment

3.4 肺組織HE染色

肺組織HE染色見圖4?？瞻捉M肺組織HE染色結(jié)果顯示肺泡組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁完整；與空白組相比，模型組小鼠肺組織肺泡間隔增厚或被破壞，有大量炎性細胞浸潤，支氣管上皮脫落。地龍各劑量組給藥后，可見炎性細胞減少，地龍中、高劑量組僅有少量炎性細胞，肺泡結(jié)構(gòu)清晰完整，表明地龍中、高劑量組可有效改善MP感染癥狀。

圖4 BALB/c小鼠肺病理學觀察（×20）Fig 4 Pathological observation of lung in BALB/c mice（×20）

3.5 IHC法檢測地龍對肺組織EGF蛋白表達的影響

由圖5、6可知，與空白組比較，模型組

OD

值有所降低（

P

＜0.05）；與模型組比較，地龍低、中、高劑量組

OD

值均升高（

P

＜0.05），其中地龍中、高劑量組

OD

值升高顯著，EGF著色點增加明顯，表明地龍中、高劑量組可顯著增加肺組織中EGF的表達。

圖5 地龍對肺組織EGF蛋白表達的影響（×20）Fig 5 Effect of earthworm on EGF protein expression in lung tissue（×20）

圖6 各組小鼠肺組織EGF蛋白表達OD值Fig 6 OD value of EGF protein expression in lung tissue of mice in each group

3.6 Western blot檢測地龍對肺組織EGF蛋白表達水平的影響

如圖7所示，與空白組比較，模型組EGF蛋白水平明顯下降（

P

＜0.05）。與模型組比較，地龍中、高劑量組EGF蛋白表達均升高（

P

＜0.05）。

圖7 地龍對肺組織中EGF蛋白表達的影響Fig 7 Effect of earthworm on the expression of EGF protein in the lung tissue

3.7 地龍對肺組織 EGF mRNA 表達的影響

圖8顯示，與空白組比較，模型組小鼠EGF mRNA表達顯著降低（

P

＜0.05）；與模型組比較，模型小鼠經(jīng)地龍給藥治療后，地龍中、高劑量組小鼠的EGF mRNA表達水平明顯增加（

P

＜0.05）。

圖8 地龍對肺組織EGF mRNA表達的影響Fig 8 Effect of earthworm on EGF mRNA expression in lung tissue

4 討論

MP是引發(fā)呼吸系統(tǒng)感染的常見致病菌，潛伏期通常為14～21 d，嚴重感染時會發(fā)展為MP肺炎。目前關于MP肺炎致病機制仍不十分明確，如不及早干預，會導致病情惡化，引發(fā)其他呼吸道疾病。臨床上，阿奇霉素對治療小兒支原體肺炎具有較好的療效，是治療MP感染的常用藥物，但近年關于阿奇霉素的不良反應報道逐漸增多，阿奇霉素長期靜脈滴注會引發(fā)胃腸反應、局部疼痛等，急需尋找新的治療藥物。地龍作為一味應用廣泛的動物類中藥，在現(xiàn)代臨床常用于治療肺部疾病。研究表明，地龍可顯著降低MP感染小鼠IFN-

γ

、IL-6水平。本實驗中HE染色表明，地龍中、高劑量組能修護受損的肺組織，改善MP感染造成的肺組織結(jié)構(gòu)異常損害。

EGF具有較強的促進細胞分裂作用，在體內(nèi)外刺激多種組織及細胞的增殖、分化，并通過自分泌和旁分泌等多種方式調(diào)節(jié)呼吸道上皮細胞的分化及成熟。其修復功能可能與線粒體的運轉(zhuǎn)功能有關，EGF可以使受損的表皮細胞代謝加快，運動活性增強，老化的組織及細胞得到更新。研究表明EGF對胎兒肺成熟有促進作用以及有助于消除成人肺水腫。EGF可調(diào)控成年大鼠肺泡Ⅱ型的細胞增生，促進肺部的生長發(fā)育。目前關于治療MP引起的肺損傷的相關研究較少，也并無阿奇霉素通過調(diào)控EGF蛋白治療MP感染的相關報道。故本研究基于EGF蛋白探究地龍治療MP的作用機制，進一步開發(fā)治療MP感染的中藥新藥。本課題組前期大量實驗表明應用Biacore實驗技術可有效在體外預測藥物與靶蛋白的結(jié)合效果，本實驗通過Biacore實驗證實了在體外地龍可與EGF蛋白存在穩(wěn)定結(jié)合。IHC、Western blot及RT-PCR體內(nèi)藥效學實驗表明，地龍中、高劑量組能明顯提高EGF蛋白和mRNA的表達，表明地龍可通過調(diào)控EGF的表達水平，改善MP感染癥狀，闡明了地龍治療MP感染的作用機制。但與模型組相比，阿奇霉素陽性對照組對EGF蛋白和mRNA的表達沒有明顯統(tǒng)計學差異，原因可能為阿奇霉素并不能通過調(diào)控EGF蛋白發(fā)揮治療MP感染的作用。

本研究顯示，地龍可通過提高EGF的表達，修復受損傷的肺組織，改善MP感染引起的呼吸道癥狀，進一步闡明了地龍治療MP感染的作用機制，為中藥新藥研制提供了一種創(chuàng)造性的思路。但地龍藥材中化學成分復雜，與EGF蛋白結(jié)合的具體單體成分還需進一步研究。