魏晴，林彤遠(yuǎn)，2，王強(qiáng)，王雷，3，4，陳衛(wèi)東，3，4*（. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，合肥 23002；2.華東師范大學(xué)附屬蕪湖醫(yī)院（蕪湖二院），藥劑科，安微 蕪湖 2400；3. 中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 23002；4. 安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院藥物制劑研究所，合肥 23002）

癌癥發(fā)病隱匿，大部分癌癥患者明確診斷時(shí)已屬進(jìn)展期，錯(cuò)過(guò)了最佳手術(shù)時(shí)間，這部分患者主要依賴(lài)于化療藥物治療。但是大多數(shù)化療藥物本身不具有腫瘤特異性，通過(guò)靜脈全身給藥，殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)正常細(xì)胞也有較大的毒性，甚至?xí)茐拿庖呦到y(tǒng)，這些因素阻礙了化療藥物在臨床上的廣泛應(yīng)用。為提高化療藥物的水溶性及靶向性，降低毒副作用，納米載藥體系應(yīng)運(yùn)而生。近年來(lái)，納米技術(shù)的發(fā)展為解決藥物穩(wěn)定性低、水溶性差、半衰期短、選擇性低等問(wèn)題提供了新的思路和突破點(diǎn)。脂質(zhì)立方液晶作為新興載藥體系逐漸受到關(guān)注，脂質(zhì)立方液晶納米粒作為納米載體一個(gè)新興的分支，其具有生物可降解性、避免藥物發(fā)生化學(xué)和生理降解以提高藥物穩(wěn)定性、控制藥物釋放等特點(diǎn)。適用于各種藥物的包載，包括小分子藥物、多肽、蛋白質(zhì)和核酸等。除此以外，脂質(zhì)立方液晶納米粒的特殊空間結(jié)構(gòu)，使其具有可同時(shí)包載親脂性和親水性藥物的潛力。

中藥藤黃是藤黃科植物藤黃所分泌出的干燥樹(shù)脂，新藤黃酸（gambogenic acid，GNA，CHO）（結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1A）是中藥藤黃中的主要抗腫瘤化學(xué)成分之一，其對(duì)多種腫瘤細(xì)胞都有不同程度的抑制作用。新藤黃酸的抗腫瘤作用是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期進(jìn)展和抑制腫瘤血管生成而產(chǎn)生的，其可以抑制細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)激酶催化活性位點(diǎn)，阻斷細(xì)胞周期G/G期，直接殺傷腫瘤細(xì)胞。其抗腫瘤活性強(qiáng)且確切，對(duì)肺癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌等都具有較好的療效，對(duì)正常動(dòng)物造血系統(tǒng)和免疫功能不產(chǎn)生或很少產(chǎn)生影響。然而其水溶性差、體內(nèi)消除快、靜脈給藥血管刺激性強(qiáng)、生物利用度低等缺陷，嚴(yán)重限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。

PLHSpT（結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1B）是一種含磷酸化的絲/蘇氨酸的多肽序列，與乳腺癌特異性靶點(diǎn)Polo樣激酶1（polo-like kinase 1，PLK1）特異性高親和（

K

＝0.45±0.11 μmol·L）。PLK1作為腫瘤確診以及腫瘤愈后重要的標(biāo)記物之一，在正常細(xì)胞中低表達(dá)甚至不表達(dá)，而在乳腺癌甚至晚期乳腺癌腦轉(zhuǎn)移過(guò)程中高表達(dá)。因此，PLHSpT可作用于PLK1來(lái)阻滯腫瘤細(xì)胞使其停留在有絲分裂的G/M期，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。但PLHSpT體內(nèi)穩(wěn)定性差、穿膜能力差。新型的磷酸化多肽類(lèi)藥物聯(lián)合傳統(tǒng)的中藥單體同時(shí)使用，能夠顯著增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性，增加協(xié)同抗腫瘤的效果。PLHSpT與GNA兩種藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷原理截然不同，兩者作用于腫瘤細(xì)胞周期的不同階段及代謝途徑，可多種途徑共同起到協(xié)同抗腫瘤的效果。本研究旨在制備共載GNA與PLHSpT的脂質(zhì)立方液晶納米粒[Cubs-（GNA＋PLHSpT）]，并對(duì)其理化性質(zhì)及體外藥效學(xué)進(jìn)行研究。

圖1 GNA的結(jié)構(gòu)式（A）和PLHSpT的結(jié)構(gòu)式（B）Fig 1 Structure formula of GNA（A）and PLHSpT（B）

1 材料

1.1 儀器

島津LC-15C高效液相色譜儀、SPD-15C紫外檢測(cè)器（日本島津公司）；AB135-S 型十萬(wàn)分之一電子分析天平（德國(guó) Mettler Toledo公司）；DF-101B集熱式恒溫磁力攪拌器（金壇市鑫鑫實(shí)驗(yàn)儀器廠）；LC-4016低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；Zetasizer3000HS型激光粒度儀（英國(guó)Malvern公司）；Hitachi-HT7700透射電鏡（上海滬西分析儀器廠有限公司）；KQ-300B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DZF-6050型真空干燥箱（上海傅訊實(shí)業(yè)有限公司）；ESCO二氧化碳培養(yǎng)箱（新加坡 Esco 公司）；Cascada超純水儀（美國(guó)PALL 公司）。

1.2 試藥

GNA對(duì)照品（純度≥ 98%，由安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院GNA課題組提供）；PLHS-PThr-NH2（PLHSpT）（純度≥95%，上海沐晉生物科技有限公司）；泊洛沙姆407（p407）（BASF公司）；單油酸甘油酯（GMO）（天津希恩思生化科技有限公司）；無(wú)水乙醇（上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司）；甘露醇（阿拉丁試劑公司）；色譜甲醇（瑞典Oceanpak公司）；胎牛血清（Gibco公司）；DMEM培養(yǎng)基（賽百慷上海生物科技股份有限公司）；青霉素-鏈霉素溶液、0.25%胰酶、MTT（Biosharp公司）。

1.3 細(xì)胞

乳腺癌SK-BR-3 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所。

2 方法與結(jié)果

2.1 [Cubs-（GNA＋PLHSpT）]的制備

基于實(shí)驗(yàn)室前期研究基礎(chǔ)，采用乳化蒸發(fā)-低溫固化法制備[Cubs-（GNA＋PLHSpT）]。即將適量GNA和GMO在60℃的水浴中完全溶解于5.00 mL無(wú)水乙醇中，得到有機(jī)相。將處方比例的磷酸化五肽和泊洛沙姆407溶于定量水中，水浴加熱到與油相相同溫度構(gòu)成水相。然后在攪拌的條件下，于水浴中用1 mL注射器緩慢勻速將生成的有機(jī)溶液注入水溶液中，繼續(xù)攪拌直至有機(jī)溶劑揮發(fā)完全得到均勻乳狀液，在攪拌條件下將熱乳液倒入適量冰水中冰浴，待其在冰水中完全分散即得淡黃色澄清透明脂質(zhì)立方液晶納米粒。

2.2 單因素考察及正交試驗(yàn)

影響脂質(zhì)立方液晶納米粒的制備因素很多，如乳化溫度與時(shí)間、固化溫度與時(shí)間、轉(zhuǎn)速、GNA與PLHSpT的比例等。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期研究基礎(chǔ)，在原有處方基礎(chǔ)上以外觀、粒徑、粒徑分布和包封率作為考察指標(biāo)，考察GNA與PLHSpT不同比例、攪拌速度、GNA加入量、藥脂比等對(duì)載藥體系的影響，篩選[Cubs-（GNA＋PLHSpT）]脂質(zhì)立方液晶納米粒的最優(yōu)處方。

2.2.1 GNA與PLHSpT質(zhì)量比篩選 將水溶性磷酸化五肽作為水相加入反應(yīng)體系中，在固定其他條件不變的情況下，以粒徑、粒徑分布、外觀、包封率為考察指標(biāo)?？疾觳煌|(zhì)量比（m∶m＝1∶1，2∶1，4∶1，6∶1，8∶1，10∶1，12∶1）下[Cubs-（GNA＋PLHSpT）]的制備情況。結(jié)果GNA與PLHSpT不同質(zhì)量比對(duì)[Cubs-（GNA＋PLHSpT）]的PDI影響較小，對(duì)其外觀、粒徑與包封率有明顯影響，綜合考慮選擇8∶1～12∶1較為適宜。

2.2.2 攪拌速度的選擇 在固定其他條件不變的情況下，僅改變轉(zhuǎn)速的大小，選擇攪拌速度分別為400、800、1000 r·min制備[Cubs-（GNA＋PLHSpT）]溶液，以粒徑、粒徑分布、外觀、包封率作為考察指標(biāo)，結(jié)果攪拌速度為400 r·min時(shí)粒徑、粒徑分布、外觀及包封率均不理想；攪拌速度為800、1000 r·min時(shí)外觀無(wú)較明顯差別，但受粒徑與包封率的影響較大，當(dāng)轉(zhuǎn)速為1000 r·min時(shí)，其粒徑較小、分散性較好、包封率較高，故選擇攪拌速度為1000 r·min。

抓斗式清淤是指利用抓斗式挖泥船開(kāi)挖河底淤泥，但淤泥清除率只能達(dá)到30% 左右，很難改善水質(zhì)。絞吸式清淤挖泥、輸泥和卸泥都是一體化完成，施工精度較高，不會(huì)出現(xiàn)淤泥泄露的問(wèn)題，缺點(diǎn)是容易出現(xiàn)回淤問(wèn)題，清淤效率并不高。水上挖掘機(jī)清淤可懸浮在浮泥或水上自由行走，被廣泛使用于河道清淤和水域治理、資源開(kāi)發(fā)、環(huán)境整治等復(fù)雜的工程中。新一代的水上挖掘機(jī)能在水深5m的狹窄區(qū)域內(nèi)進(jìn)行清淤作業(yè)，但其缺點(diǎn)也較為明顯，不能輸送淤泥，清淤效率較低。

2.2.3 GNA加入量的選擇 在固定其他制備條件不變的情況下，改變GNA加入量（5、8、10 mg）制備[Cubs-（GNA＋PLHSpT）]溶液，以粒徑、粒徑分布、外觀、包封率作為考察指標(biāo)，考察不同GNA加入量對(duì)[Cubs-（GNA＋PLHSpT）]的影響。結(jié)果當(dāng)GNA加入量逐漸增大時(shí)，其平均粒徑與PDI也逐漸增大，包封率隨之減小，所制備的[Cubs-（GNA＋PLHSpT）]乳液透明度亦隨之降低，藍(lán)色乳光消失，故選擇5～6.5 mg進(jìn)行后續(xù)考察。

2.2.4 藥脂比的選擇 在固定其他制備條件不變的情況下，選擇藥脂比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40制備[Cubs-（GNA＋PLHSpT）]溶液，以粒徑、粒徑分布、外觀、包封率作為考察指標(biāo)，結(jié)果粒徑分布對(duì)藥脂比影響較小，隨著藥脂比的增加，粒徑與包封率有一定變化，當(dāng)藥脂比過(guò)大時(shí)很不穩(wěn)定，溶液較渾濁，放置一段時(shí)間會(huì)有沉淀產(chǎn)生，綜合比較藥脂比在1∶20～1∶30較佳。

2.2.5 綜合加權(quán)評(píng)分法綜合評(píng)價(jià)[Cubs-（GNA＋PLHSpT）]的處方 以單因素考察的結(jié)果為基礎(chǔ)，分別選擇m∶m比例（A）、藥脂比（

w/w

）（B）、GNA加入量（C）、空白因素（D），按正交試驗(yàn)表L（3）試驗(yàn)方案考察各因素對(duì)包封率和粒徑的影響。最佳工藝條件要滿(mǎn)足包封率高、粒徑小的特點(diǎn)，因此采用綜合加權(quán)評(píng)分法考察最優(yōu)工藝條件，考慮到包封率對(duì)制劑影響大于粒徑，因此包封率與粒徑的權(quán)重比分別為60%、40%，即GNA包封率（

EE

）、PLHSpT包封率（

EE

）、粒徑分別按30%、30%、40%的權(quán)重系數(shù)計(jì)分，綜合評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：

Y

＝

Y

/

Y

×30%＋

Y

/

Y

×30%－

Y

/

Y

×40%，即綜合評(píng)分總分等于各項(xiàng)指標(biāo)與各項(xiàng)指標(biāo)最大值之比乘以各指標(biāo)加權(quán)系數(shù)之和。正交設(shè)計(jì)各因素水平見(jiàn)表1，加權(quán)評(píng)分結(jié)果及方差分析見(jiàn)表2～3。

表1 因素水平表
Tab 1 Factor and level of orthogonal experiment

水平 因素A B C D 1 8∶1 15% 5.0 －2 10∶1 20% 5.5 －3 12∶1 25% 6.5 －

表2 正交設(shè)計(jì)與綜合評(píng)分結(jié)果
Tab 2 Orthogonal design and comprehensive scoring results

試驗(yàn)號(hào) 因素 EE1/% EE2/% 粒徑/nm綜合評(píng)分A B C D 1 1 1 1 1 73.80 70.98 139.43 18.86 2 1 2 2 2 87.54 85.68 136.21 29.28 3 1 3 3 3 79.96 76.75 138.56 23.12 4 2 1 2 3 74.61 72.39 137.70 20.00 5 2 2 3 1 89.12 86.65 134.65 30.49 6 2 3 1 2 74.40 72.26 130.20 21.53 7 3 1 3 2 72.48 68.59 176.73 9.41 8 3 2 1 3 87.66 85.67 157.00 24.76 9 3 3 2 1 76.90 76.85 182.50 12.49 K1 23.7516.0921.72 K2 24.0128.1820.59 K3 15.5619.0521.01極差 8.4512.09 1.13

由表2可知，各因素影響主次順序?yàn)锽＞A＞C，由表3可知，B因素有顯著性意義。因此，綜合分析以包封率和粒徑為考察指標(biāo)得到的評(píng)分結(jié)果，確定[Cubs-（GNA＋PLHSpT）]最佳處方工藝條件為ABC，即

m

∶

m

為10∶1，藥脂比（

w/w

）為20%，GNA加入量為5 mg，攪拌速度為1000 r·min。

表3 方差分析表
Tab 3 Variance analysis

注：（2，2）＝19.00，（2，2）＝99.00。

方差來(lái)源 偏差平方和 自由度 F值 F臨界值 顯著性A 138.76 2 12.77 19.00 P＞0.05 B 238.19 2 21.92 19.00 P＜0.05 C 1.95 2 0.18 19.00 P＞0.05

2.3 [Cubs-（GNA＋PLHSpT）]的質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.3.1 外觀考察 由圖2可知，所制備的空白立方液晶納米粒外觀帶有淡藍(lán)色乳光的澄清透明液體，沒(méi)有沉淀或絮凝，而[Cubs-（GNA＋PLHSpT）]則呈現(xiàn)黃色。

圖2 空白立方液晶納米粒（左）和[Cubs-（GNA＋PLHSpT）]（右）的外觀Fig 2 Appearance of the blank Cubs（left）and [Cubs-（GNA＋PLHSpT）]（right）

2.3.2 形態(tài)學(xué)考察 取適量納米乳液滴加于有碳膜的銅網(wǎng)上，靜候30 min用濾紙吸去多余納米乳液，并用2.0%的磷鎢酸溶液負(fù)染約2 min，自然晾干后置于透射電鏡下觀察[Cubs-（GNA＋PLHSpT）]的外觀形態(tài)，結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖3可以看出，制備的[Cubs-（GNA＋PLHSpT）]近似圓形，稍立體，粒子與粒子之間無(wú)粘連。

圖3 [Cubs-（GNA＋PLHSpT）]的透射電鏡圖Fig 3 Transmission electron microscopy of [Cubs-（GNA＋PLHSpT）]

2.3.3 平均粒徑與Zeta電位 取適量的[Cubs-（GNA＋PLHSpT）]用超純水稀釋30倍，在室溫條件下用納米激光粒度儀分別測(cè)定其粒徑和Zeta電位。由圖4可知，本試驗(yàn)制備的[Cubs-（GNA＋PLHSpT）]平均粒徑為（133.7±0.57）nm，多分散 系 數(shù)PDI為（0.171±0.01），Zeta電 位 為（－12.40±0.41）mV，表明本試驗(yàn)所制備的脂質(zhì)立方液晶納米粒粒徑較小，粒徑分布的范圍較窄，Zeta電位絕對(duì)值小于30 mV。

圖4 [Cubs-（GNA＋PLHSpT）]的粒徑分布圖（A）及Zeta電位圖（B）Fig 4 [Cubs-（GNA＋PLHSpT）] particle size distribution（A）and Zeta potential（B）

圖5 6種樣品的DSC圖Fig 5 DSC map of 6 samples

EE

%＝

M

/

M

×100%

EE

%＝（

W

－

W

）/

W

×100%式中

M

、

M

、

W

、

W

分別為過(guò)柱后脂質(zhì)立方液晶納米粒內(nèi)被包封GNA的質(zhì)量、分散體系中總GNA的質(zhì)量、游離PLHSpT的含量、脂質(zhì)立方液晶納米粒中總PLHSpT的含量。依據(jù)公式計(jì)算可知，本試驗(yàn)中所制備的[Cubs-（GNA＋PLHSpT]中

EE

為（89.70±0.39）%，

EE

為（87.74±0.71）%。

2.3.6 體外釋放

① 色譜條件：島津LC-15C高效液相色譜儀、SPD-15C紫外檢測(cè)器（日本島津公司）；色譜柱：COSMOSIL C柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：30℃；流速：1.0 mL·min；進(jìn)樣量：20 μL；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸水溶液（90∶10，

V/V

）；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm。

② 釋放介質(zhì)：根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期的基礎(chǔ)，選擇pH＝7.4的磷酸鹽緩沖液作為釋放介質(zhì)，添加1%的吐溫80作為增溶劑，對(duì)[Cubs-（GNA＋PLHSpT）]載藥體系的體外釋放行為進(jìn)行初步考察。

③ 標(biāo)準(zhǔn)曲線：取適量的GNA對(duì)照品溶液，加PBS溶液（含1%的吐溫80）制備成不同濃度的對(duì)照品溶液，12 000 r·min離心10 min，取上清液，進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積（

y

）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（

x

）為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線圖進(jìn)行線性擬合，得到GNA 線性回歸方程：

y

＝1.06×10

x

－2.64×10（

R

＝0.9997，

n

＝8），結(jié)果表明GNA在1.0～64.0 μg·mL與峰面積線性關(guān)系良好。④ 體外釋放研究：本試驗(yàn)采用透析法（21 mm，8000～14 400 Da）對(duì)等量的GNA溶液以及[Cubs-（GNA＋PLHSpT）]體外釋放性能進(jìn)行考察，以GNA溶液為對(duì)照。分別取等量的GNA溶液以及[Cubs-（GNA＋PLHSpT）]置于預(yù)先處理好的透析袋中，然后將透析袋浸入相同的釋放介質(zhì)中，在37℃下以200 r·min攪拌。在預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)各取樣1 mL，同時(shí)補(bǔ)加等量釋放介質(zhì)，12 000 r·min離心10 min，取上清液進(jìn)樣后測(cè)定，按以下公式計(jì)算累計(jì)釋藥百分比（

Q

）并繪制累計(jì)釋放曲線，如圖6所示。游離GNA在釋放介質(zhì)中釋放迅速，8 h后幾乎釋放完全，累計(jì)釋放率達(dá)99.63%；[Cubs-（GNA＋PLHSpT）]載體中藥物的釋放前12 h快速釋放，12 h后釋放趨于平緩，在24 h內(nèi)累計(jì)釋放率為72.26%。

圖6 GNA及[Cubs-（GNA＋PLHSpT）]的體外釋藥曲線Fig 6 In vitro release profile of GNA solution and [Cubs-（GNA＋PLHSpT）]

Q

＝｛

CV

＋（

C

＋

C

＋…＋

C

）

V

｝/

M

×100%其中，

C

，

C

，

C

，

C

分別為第1，2，

i

－1，

i

等時(shí)間點(diǎn)釋放介質(zhì)中GNA的濃度；

V

表示釋放介質(zhì)總體積；

V

表示所取樣品的體積。

2.4 [Cubs-（GNA＋PLHSpT）]體外抗腫瘤活性研究

2.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人乳腺癌細(xì)胞株SK-BR-3細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素混合液的DMEM（含1.5 g·LNaHCO）培養(yǎng)基的透氣培養(yǎng)瓶中，置于飽和濕度二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（37℃，5%CO），24～48 h后更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)（具體時(shí)間視細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)以及培養(yǎng)基狀態(tài)而定），待細(xì)胞密度達(dá)70%～90%（約培養(yǎng)3～5 d），即按1∶2的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

2.4.2 體外抗腫瘤評(píng)價(jià) 細(xì)胞分為調(diào)零組，對(duì)照組，空白納米立方液晶、游離GNA、游離PLHSpT、PLHSpT-Cubs、GNA-Cubs、[Cubs-（GNA＋PLHSpT）]給藥組。

將生長(zhǎng)狀態(tài)優(yōu)良的SK-BR-3細(xì)胞消化，制成單細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)以備用，以1×10個(gè)/孔，每孔懸液體積為200 μL，接種至96孔板內(nèi)，照分組及濃度梯度的數(shù)量鋪板，剩余空白孔鋪滿(mǎn)PBS（避免邊緣效應(yīng)），培養(yǎng)箱孵育24 h后，實(shí)驗(yàn)組各孔（每個(gè)藥物不同濃度各設(shè)6個(gè)復(fù)孔）加入對(duì)應(yīng)藥物，37℃孵育36 h，吸去舊培養(yǎng)基，每孔加入200 μL新鮮培養(yǎng)基及20 μL含5 mg·mLMTT的DMEM混合液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去培養(yǎng)基，每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），搖床恒溫（37℃）充分避光震蕩10 min，使反應(yīng)生成的紫藍(lán)色結(jié)晶物充分溶解，在自動(dòng)酶標(biāo)儀上以490 nm波長(zhǎng)測(cè)定實(shí)驗(yàn)孔每孔

OD

值，計(jì)算細(xì)胞存活率（%）和半抑制濃度（

IC

），結(jié)果游離GNA、游離PLHSpT、PLHSpT-Cubs、GNA-Cubs、[Cubs-（GNA＋PLHSpT）]的

IC

分別為（14.33±0.59）、（15.67±0.68）、（9.03±0.41）、（6.73±0.22）、（3.46±0.11）μg·mL，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 不同濃度制劑（A）以及游離藥物（B）對(duì)SK-BR-3 細(xì)胞存活率的影響（Mean±SD，n＝3）Fig 7 Effect of different agent concentrations（A）and different concentrations of free drugs（B）on the survival rate of SK-BR-3 cells（B）（Mean±SD，n＝3）

由圖7可知，與游離GNA和游離PLHSpT相比，空白脂質(zhì)立方液晶納米粒毒性較低，對(duì)細(xì)胞影響較小，游離GNA對(duì)SK-BR-3細(xì)胞的抑制作用優(yōu)于游離PLHSpT。與單獨(dú)載GNA或PLHSpT的納米立方液晶相比，[Cubs-（GNA＋PLHSpT）]對(duì)SKBR-3細(xì)胞的的細(xì)胞抑制效果更明顯，對(duì) SK-BR-3細(xì)胞的

IC

值最小，為（3.46±0.11）μg·mL，抑制效果是游離GNA的4.14倍，游離PLHSpT的4.52倍，GNA-Cubs的1.95倍，PLHSpT-Cubs的2.61倍。[Cubs-（GNA＋PLHSpT）]對(duì)細(xì)胞抑制率隨GNA濃度增大而增大，說(shuō)明同時(shí)包載GNA和PLHSpT的脂質(zhì)立方液晶納米粒能發(fā)揮協(xié)同作用，其體外抗腫瘤效果最好。

3 討論

本研究采用高溫乳化蒸發(fā)-低溫固化法制備了同時(shí)包裹GNA與PLHSpT的脂質(zhì)立方液晶納米粒[Cubs-（GNA＋PLHSpT）]，通過(guò)單因素與正交試驗(yàn)確定最優(yōu)處方，得到粒徑較小，分布均勻，理化特性理想的脂質(zhì)立方液晶。并通過(guò)外觀、類(lèi)型、粒徑、多分散系數(shù)、透射電鏡、DSC等方法對(duì)其進(jìn)行了系統(tǒng)的表征。結(jié)果表明，最優(yōu)處方下的[Cubs-（GNA＋PLHSpT）]平均粒徑為（133.7±0.57）nm，多分散系數(shù)PDI為（0.171±0.01），Zeta電位為（－12.40±0.41）mV；GNA和PLHSpT包封率分別為（89.70±0.39）%和（87.74±0.71）%。透射電鏡顯示[Cubs-（GNA＋PLHSpT）]呈球形或者類(lèi)球形，DSC分析結(jié)果亦驗(yàn)證了確有新的物相生成。體外釋藥曲線表明，與游離GNA相比，[Cubs-（GNA＋PLHSpT）]具有明顯的緩釋效果。MTT法檢測(cè)[Cubs-（GNA＋PLHSpT）]對(duì) SK-BR-3 細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用，初步證明了脂質(zhì)立方液晶納米?？梢栽鰪?qiáng)GNA對(duì)腫瘤的抑制作用。

對(duì)傳統(tǒng)載藥系統(tǒng)而言，本實(shí)驗(yàn)借助脂質(zhì)立方液晶納米粒同時(shí)包載PLHSpT及GNA，提高了PLHSpT的體內(nèi)穩(wěn)定性、細(xì)胞穿膜能力，同時(shí)也延長(zhǎng)了GNA體內(nèi)半衰期、增加了體內(nèi)生物利用度、減少了其對(duì)血管的刺激性。對(duì)乳腺癌而言，新型肽類(lèi)藥物PLHSpT與中藥GNA單體可通過(guò)不同作用機(jī)制實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用，兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用有望使該復(fù)方脂質(zhì)立方液晶納米粒載藥體系對(duì)乳腺癌細(xì)胞的殺傷力增加，提高抗腫瘤效果，為后續(xù)研究提供一定理論基礎(chǔ)。