管詠梅，楊麗娜，胡育森，李哲，陳麗華，朱衛(wèi)豐，吳文婷，臧振中（江西中醫(yī)藥大學，現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室，南昌 330004）

雷公藤甲素（triptolide，TP）是從傳統(tǒng)中藥雷公藤中提取出的環(huán)氧二萜內(nèi)酯類化合物，具有顯著的免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗生育及抗腫瘤等作用，但嚴重的毒副反應，尤其是肝腎毒性，限制了其臨床應用。研究發(fā)現(xiàn)，TP經(jīng)皮給藥，既可減少消化道毒性，避免首過效應，又可透過皮膚緩慢、持續(xù)地發(fā)揮療效。醇質(zhì)體（ethosome）作為新一代脂質(zhì)體，是由磷脂、高體積分數(shù)乙醇（或丙二醇等）和水組成的具囊泡結(jié)構(gòu)的給藥載體。與普通脂質(zhì)體相比，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、包封率較高、粒徑較小，有更好的膜流動性，可使藥物透過皮膚角質(zhì)層或黏膜細胞，使其在皮膚真皮層上滯留量更多，是良好的皮膚與黏膜給藥載體，在局部和全身治療方面均具有較好的應用前景。二元醇質(zhì)體（binary ethosome）是在醇質(zhì)體的基礎(chǔ)上進一步改進而得的，具有制備簡單、性質(zhì)更穩(wěn)定、生物利用度更高及緩釋藥物等特點。同時，卵磷脂作為醇質(zhì)體的必備成分，具有一定的抗氧化效果，也可在一定程度上減少皮膚毒性，增強患者的順應性。因此，本試驗擬將TP制備成二元醇質(zhì)體，以增加其皮膚滲透量，縮短起效時間，提高TP的療效，為TP經(jīng)皮給藥方式提供新的參考。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；TP-6智能透皮試驗儀（天津正通科技有限公司）；Malwern Nano-S納米粒度儀（英國馬爾文公司）；超聲波細胞粉碎儀（上海五相儀器有限公司，型號：JY92-IIDN）；SIGMA3-18K高速冷凍離心機（美國SIGMA公司）；透射電子顯微鏡（TEM）（FEI TeenaiTM Spirit TEM 120KV）；ZNCL-BS智能磁力攪拌器（西安安泰儀器科技有限公司）；BS124S 電子分析天平（北京Sartorius儀器系統(tǒng)有限公司）；EPED-ESL-10TH試驗室級超純水器（南京易普易達科技發(fā)展有限公司）；KQ3200E型超聲波清洗器（昆明市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

大豆卵磷脂（LipoidS100，德國Lipoid公司，批號：8030760）；膽固醇（北京索萊寶生物有限公司，批號：527G035）；TP對照品（質(zhì)量分數(shù)≥98%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號：200724）；丙二醇、無水乙醇（分析純，西隴科學股份有限公司）；甲醇（色譜級，美國Tedia公司）；超純水（南京易普達科技發(fā)展有限公司）。

1.3 動物

SPF級健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，購自江西中醫(yī)藥大學試驗動物中心，許可證號SCXK（贛）2018-0003。

2 方法與結(jié)果

2.1 TP二元醇質(zhì)體的制備[16]

稱取適量大豆卵磷脂、膽固醇及丙二醇于燒杯中，加入TP乙醇水溶液，置磁力攪拌器（30℃，500 r·min）上混合均勻，作為醇相，吸取于注射器中；另取含一定量超純水的燒杯置于磁力攪拌器中，將注射器中醇相緩慢滴加于水相，水合30 min，冰浴探頭式超聲（200 W，超聲5 s，間隙5 s）5 min，混懸液用0.22 μm濾膜濾過，即得TP二元醇質(zhì)體?？瞻锥假|(zhì)體同法制得。

2.2 TP含量測定

2.2.1 HPLC條件 色譜柱：Gemini-NX C110A（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流 動 相：甲 醇-水（50∶50，

V/V

），檢測波長：218 nm，柱溫：30℃，流速：1.0 mL·min，進樣量：10 μL。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取TP二元醇質(zhì)體0.4 mL，甲醇破乳定容于5 mL量瓶中，超聲10 min，0.22 μm濾膜濾過，即得TP二元醇質(zhì)體供試品溶液?？瞻讓φ杖芤撼患铀幬锿馔芍频?。

2.2.3 方法學考察

① 線性試驗：精密稱取TP對照品5.0 mg置10 mL量瓶中，甲醇定容，即得質(zhì)量濃度為500 μg·mL的TP對照品儲備液，用甲醇分別稀釋為20、50、100、125、250、400 μg·mL的系列對照品溶液，HPLC分別測定峰面積，以TP質(zhì)量濃度（

x

，μg·mL）對峰面積（

y

）作線性回歸，得方程為：

y

＝19.13

x

－178.6，

r

＝0.9993，線性濃度范圍為20～400 μg·mL。

② 專屬性試驗：將空白對照溶液、對照品溶液及TP二元醇質(zhì)體供試品溶液，按照“2.2.1”項下條件檢測，結(jié)果顯示TP對照品溶液與TP二元醇質(zhì)體供試品溶液出峰時間相同，且空白對照溶液在相應位置無干擾峰，表明專屬性良好。

③ 精密度試驗：分別取低、中、高3個質(zhì)量濃度（20、100、250 μg·mL）的TP對照品溶液連續(xù)進樣6次，結(jié)果得日內(nèi)

RSD

分別為0.79%、0.66%、1.1%；連續(xù)測定3日，得日間

RSD

分別為0.85%、0.80%、0.88%，表明儀器精密性良好。④ 穩(wěn)定性試驗：供試品溶液于0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣檢測，結(jié)果24 h內(nèi)樣品的

RSD

為0.69%，表明樣品穩(wěn)定性良好。⑤ 重復性和回收率試驗：制備6份相同質(zhì)量濃度（40 μg·mL）對照品溶液，進樣檢測，

RSD

為1.6%，表明重復性良好。取空白二元醇質(zhì)體溶液1 mL共9份，加入同體積20、100、250 μg·mL的對照品溶液（

n

＝3），渦旋震蕩，超聲，進樣測定，結(jié)果表明低、中、高質(zhì)量濃度的TP加樣回收率均在95%～105%，

RSD

分別為2.5%、1.9%、0.25%，符合要求。

2.3 包封率的測定

考察超濾離心法測定包封率的條件，向Nanosep 10 kDa 超濾管加入400 μL醇質(zhì)體，分別以不同轉(zhuǎn)速（4000、8000、12 000、16 000、20 000 r·min）和時間（5、10、15、20、25 min）離心，取續(xù)濾液，甲醇定容至5 mL量瓶，進樣檢測。結(jié)果離心轉(zhuǎn)速為16 000 r·min、離心時間為15 min，組內(nèi)樣品濃度

RSD

均小于5%，重現(xiàn)性高。設(shè)超濾離心后定容的溶液中TP濃度為

C

，取等量（400 μL）TP二元醇質(zhì)體加甲醇破乳定容至5 mL，測得TP濃度為

C

，包封率EE（%）＝（1－

C

/

C

）×100%，其中

C

表示游離藥物的量；

C

為TP二元醇質(zhì)體懸液中藥物的總量。

2.4 單因素考察

參考相關(guān)文獻，可知制備溫度、磁力攪拌器轉(zhuǎn)速、水合時間、超聲功率、膽卵比（膽固醇∶卵磷脂）、二元醇比例、TP投藥量、卵磷脂、醇相用量等9個因素對二元醇質(zhì)體的制備工藝有較大影響，因此需考察各因素對包封率和粒徑的影響，明確制備工藝參數(shù)。

考察不同制備溫度（25、35、45、55、65℃）、不同轉(zhuǎn)速（300、400、500、600、700 r·min）、不同水合時間（10、20、30、40、50 min）、不同超聲功率（100、150、200、250、300 W）、膽卵比（1∶10、2∶10、3∶10、4∶10、5∶10）、二元醇（乙醇∶丙二醇）比例（9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5）、TP投藥量（2、4、6、8、10 mg）、卵磷脂用量（0.25%、0.50%、1.0%、1.50%、2.0%、2.50%、3.0%）、醇相用量（20%、30%、40%、50%、60%）的影響，從粒徑和包封率的變化趨勢可確定TP二元醇質(zhì)體的制備溫度為35℃、轉(zhuǎn)速為600 r·min、水合時間為30 min、超聲功率為300 W、二元醇比例為7∶3、膽卵比為1∶5；而在試驗中發(fā)現(xiàn)投藥量、卵磷脂用量及醇相用量三個因素對制劑穩(wěn)定性影響較大，因此需進一步優(yōu)化工藝參數(shù)（見圖1）。

圖1 單因素試驗考察各因素對二元醇質(zhì)體制備工藝的影響Fig 1 Effect of various factors on the preparation of binary ethosomes by single factor test

2.5 Box-Behnken響應面法優(yōu)化處方

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇投藥量、卵磷脂用量及醇相用量作為研究因素，運用Design Expert 8.0.6軟件優(yōu)化處方，以粒徑和包封率為評價指標，因素水平表和試驗組設(shè)計分別見表1和表2。

表1 因素水平表Tab 1 Factor and level

水平 因素A.投藥量/mgB.卵磷脂用量/（mg·mL－1）C.醇相用量/%－1 6 2 30 0 8 6 40 1 10 10 50

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計表
Tab 2 Box-Behnken experimental design table

No. A. 投藥量/mg B. 卵磷脂用量/（mg·mL－1）C. 醇相用量/% 粒徑/nm 包封率/%1 8.00 6.00 40.00 127.80 61.47 2 8.00 10.00 50.00 222.80 64.60 3 6.00 6.00 50.00 227.80 62.98 4 8.00 6.00 40.00 132.10 75.34 5 8.00 2.00 50.00 214.30 70.17 6 8.00 6.00 40.00 123.80 72.14 7 8.00 10.00 30.00 151.20 55.62 8 10.00 6.00 30.00 161.60 59.81 9 6.00 10.00 40.00 118.40 52.96 10 8.00 6.00 40.00 128.20 66.24 11 8.00 6.00 40.00 133.20 66.78 12 10.00 6.00 50.00 235.80 70.61 13 6.00 2.00 40.00 126.30 36.95 14 10.00 10.00 40.00 126.50 60.54 15 10.00 2.00 40.00 130.10 53.88 16 6.00 6.00 30.00 145.40 58.32 17 8.00 2.00 30.00 127.80 37.49

2.5.1 粒徑模型方程擬合 通過各項結(jié)果得回歸方程為：

Y

＝129.02＋4.51

A

＋2.55

B

＋39.34

C

＋1.08

AB

－2.05

AC

－3.72

BC

＋4.97

A

－8.66

B

＋58.67

C

?？芍谠摋l件下，對TP二元醇質(zhì)體粒徑影響因素由大到小為C＞A＞B，即醇相用量＞投藥量＞卵磷脂用量，且各因素存在交互作用，方程

R

＝0.9888，失擬項為0.0577，表明相對于純誤差沒有顯著性差異，證明回歸方程擬合成功。顯著性檢驗結(jié)果顯示

C

＜0.0001，為極其顯著。采用二次多項回歸方程對試驗數(shù)據(jù)擬合，以粒徑為中心，繪制等高線和三維曲面圖，預測TP二元醇質(zhì)體的最佳處方，結(jié)果見圖2。

圖2 粒徑的效應值與各因素的三維曲面圖和等高線圖Fig 2 Three-dimensional surface plot and contour plot of the effect value of particle size and factors

2.5.2 包封率模型方程擬合 通過各項結(jié)果得回歸方程為：

Y

＝68.39＋4.20

A

＋4.40

B

＋7.14

C

－2.34

AB

＋1.54

AC

－5.92

BC

－5.68

A

－11.64

B

＋0.21

C

?？芍谠摋l件下，對TP二元醇質(zhì)體包封率影響因素由大到小為C＞B＞A，即醇相用量＞卵磷脂用量＞投藥量，且各因素存在交互作用，方程

R

＝0.8680，失擬項為0.3527，表明相對于純誤差沒有顯著性差異，證明回歸方程擬合成功。顯著性檢驗結(jié)果顯示

B

＜0.005，較為顯著。采用二次多項回歸方程對試驗數(shù)據(jù)擬合，以包封率為中心，繪制等高線和三維曲面圖，預測TP二元醇質(zhì)體的最佳處方，結(jié)果見圖3。

圖3 包封率的效應值與各因素的三維曲面圖和等高線圖Fig 3 Three-dimensional surface plot and contour plot of the effect value of the encapsulation rate and factors

2.5.3 最優(yōu)處方及驗證試驗 由響應面優(yōu)化的結(jié)果可知，最終確定處方方案：TP投藥量為8.3 mg，卵磷脂濃度為6.9 mg·mL，醇相用量為38.5%。進行3次平行試驗，粒徑的預測值為125.634 nm，實際值為（124.7±0.46）nm，

RSD

為0.37%，包封率的預測值為68.3377 nm，實際值為（67.26±1.33）nm，

RSD

為2.0%，表明預測值與實際值無顯著性差異，建立的模型預測性良好。

2.6 TP二元醇質(zhì)體質(zhì)量評價

2.6.1 外觀評價 制備最優(yōu)處方的醇質(zhì)體，觀察其外觀澄清透明，有淡藍色乳光。

2.6.2 粒徑、PDI與電位分布 按最優(yōu)處方平行制備TP二元醇質(zhì)體3份，使用27%乙醇生理鹽水稀釋10倍，測定最優(yōu)處方的二元醇質(zhì)體（

n

＝3）平均粒徑為（124.7±0.46）nm，PDI為（0.166±0.02），Zeta電位為（－14.7±0.47）mV，如圖4。

圖4 二元醇質(zhì)體粒徑與Zeta電位分布Fig 4 Particle size and Zeta potential distribution of binary ethosomes A.粒徑（particle size）；B.電位（Zeta potential）

2.6.3 形態(tài)觀察 吸取TP二元醇質(zhì)體20 μL滴加于銅網(wǎng)上，5%磷鎢酸負染，干燥后置于透射電鏡下觀察TP二元醇質(zhì)體為類球囊狀，如圖5。

圖5 二元醇質(zhì)體透射電鏡圖（×40 000）Fig 5 Transmission electron microscopy of the binary ethosomes（×40 000）

2.6.4 穩(wěn)定性考察 將3份TP二元醇質(zhì)體分別放置于4℃冰箱及25℃恒溫箱中保存7 d，測定包封率、粒徑和PDI，結(jié)果見表3，可知4℃各項指標均優(yōu)于25℃，可能是4℃下乙醇揮發(fā)減少，卵磷脂穩(wěn)定性較好，因此選擇在低溫條件4℃下進行保存。

表3 二元醇質(zhì)體穩(wěn)定性試驗(＝3)
Tab 3 Stability test of binary ethosomes (＝3)

時間/d 粒徑/nm PDI 包封率/%4℃ 25℃ 4℃ 25℃ 4℃ 25℃0 125.3±0.46 125.3±0.46 0.173±0.004 0.173±0.004 68.28±1.33 66.35±1.45 3 126.2±1.28 127.93±1.10 0.195±0.018 0.198±0.012 66.74±1.63 66.74±1.63 7 130.6±2.11 149.26.6±5.61 0.226±0.014 0.278±0.010 63.31±2.29 53.11±2.74

2.7 體外透皮研究

2.7.1 供試液的制備 按照“2.1”項下制備TP二元醇質(zhì)體溶液；將丙二醇換為乙醇同“2.1”項下方法制得TP普通醇質(zhì)體和TP乙醇水溶液。

2.7.2 Franz擴散池體外透皮試驗 大鼠麻醉后除去腹部粗毛和絨毛，剪下腹部皮膚后頸椎脫臼處死，去除腹部皮膚下多余的脂肪和組織用生理鹽水并清洗干凈，濾紙擦干。取30%乙醇生理鹽水15 mL為接收液，大鼠皮平鋪在改良的Franz擴散池上，角質(zhì)層朝上，真皮層朝下，排出裝置內(nèi)氣泡，封口后置于池中[水?。?7±0.2）℃，300 r·min]，活化皮膚30 min以上，TP乙醇水溶液、TP普通醇質(zhì)體、TP二元醇質(zhì)體溶液分別給藥1 mL，于2、4、6、8、10、12、24 h取 樣1 mL，同時補充等量的37℃接收液，測定樣品含量。

2.7.3 標準曲線的建立 精密量取質(zhì)量濃度為500 μg·mL的TP對照品儲備液1.6 mL置10 mL量瓶中，用30%乙醇生理鹽水定容，即得80 μg·mL的TP稀釋對照品溶液，逐級對半稀釋，得到40、20、10、5、2.5、1.25 μg·mL的對照品溶液，0.22 μm濾膜濾過，進樣測定峰面積，以TP質(zhì)量濃度（

x

，μg·mL）對峰面積（

y

）作線性回歸得方程為：

y

＝19.45

x

＋2.198，

r

＝0.9999，線性范圍為1.25～80 μg·mL。2.7.4 方法學考察 方法同“2.2.3”項下，結(jié)果日內(nèi)，日間精密度

RSD

均小于0.76%，24 h樣品穩(wěn)定性

RSD

為0.35%，重復性

RSD

為1.1%，均符合要求。取某給藥組24 h接收液0.5 mL共9份，加入同體積2.5、10、40 μg·mL的對照品溶液（

n

＝3），渦旋震蕩，超聲，按照“2.2.1”項下條件檢測，結(jié)果表明回收率均在95%～105%，

RSD

分別為3.8%、4.1%、1.4%，符合要求。

取最低質(zhì)量濃度1.25 μg·mL的對照品溶液，按照“2.2.1”項下條件檢測，信噪比大于10，定量限檢驗符合要求。

2.7.5 單位面積累積透過量 利用體外透皮試驗中TP普通醇質(zhì)體、TP二元醇質(zhì)體和TP乙醇水溶液的累積透過量與時間的關(guān)系進行釋放特性研究，根據(jù)擬合方程結(jié)果及滲透動力學參數(shù)表示TP二元醇質(zhì)體的體外透皮效果。公式如下：

上式中

Q

為第

n

各時間點的單位面積累積透過量，

A

表示有效透皮面積，

C

為第

n

個點測得的藥物濃度，

V

為接收池體積，

V

為每次取樣體積。計算TP普通醇質(zhì)體、TP二元醇質(zhì)體和TP乙醇水溶液各個時間點的單位面積累積透過量，繪制透過量（

Q

，μg·cm）-時間（

t

，h）曲線，結(jié)果見圖6，表明TP普通醇質(zhì)體、TP二元醇質(zhì)體和TP乙醇水溶液中TP 在24 h單位面積累積透過量分別為（549.99±47.97）、（751.62±27.38）、（957.71±40.20）μg·cm。將數(shù)據(jù)進行零級動力學方程、一級動力學方程和Higuchi 方程模型擬合，結(jié)果見表4，根據(jù)

R

可知，TP二元醇質(zhì)體符合Higuchi方程，對

Q

（μg·cm）-

t

（h）進行線性回歸分析，得直線斜率即為穩(wěn)態(tài)透皮速率（

J

），滲透動力學參數(shù)以擬合度最高的方程為準，見表5。

圖6 普通醇質(zhì)體、二元醇質(zhì)體和TP乙醇水溶液的Qn（n＝3）Fig 6 Qn of ethosomes，binary ethosomes and ethanol-water solution of triptolide（n＝3）

表4 TP普通醇質(zhì)體、TP二元醇質(zhì)體和TP乙醇水溶液的體外透皮量-時間模型擬合
Tab 4 Model fitting equation of in vitro transdermal volume-time of ethosomes，binary ethosomes and ethanol-water solution of triptolide

制劑 模型 擬合結(jié)果 擬合優(yōu)度（R2）TP普通醇質(zhì)體零級動力學模型Q＝25.406t－13.209 0.9363一級動力學模型lgQ＝0.0598t＋1.5894 0.6935 Higuchi模型 Q＝166.55t1/2－254.70 0.9635 TP二元醇質(zhì)體零級動力學模型Q＝33.964t＋18.784 0.9038一級動力學模型lgQ＝0.0535t＋1.8577 0.6719 Higuchi模型 Q＝255.79t1/2－313.12 0.9565 TP乙醇水溶液零級動力學模型Q＝43.162t＋33.698 0.8934一級動力學模型lgQ＝0.053t＋1.9791 0.6613 Higuchi模型 Q＝288.11t1/2－391.47 0.9531

表5 TP普通醇質(zhì)體、TP二元醇質(zhì)體和TP乙醇水溶液的滲透動力學參數(shù)
Tab 5 Osmotic kinetic parameters of ethosomes，binary ethosomes and ethanol-water solution of triptolide

制劑 Q-t方程 R2 Q24/（μg·cm－2） Js/（μg·cm－2·h）TP普通醇質(zhì)體 Q＝166.55t1/2－254.70 0.9635 549.99±47.97 166.55 TP二元醇質(zhì)體 Q＝255.79t1/2－313.12 0.9565 751.62±27.38 255.79 TP乙醇水溶液 Q＝288.11t1/2－391.47 0.9531 957.71±40.20 288.11

體外透皮給藥研究發(fā)現(xiàn)，TP二元醇質(zhì)體的釋藥速率和累積釋放量要明顯高于普通醇質(zhì)體，且相較于TP乙醇水溶液，TP二元醇質(zhì)體的TP釋放與Higuchi模型擬合度較高，表明TP二元醇質(zhì)體具有較好的皮膚穿透力。

3 討論

近年來，外用制劑的開發(fā)為有毒中藥的臨床應用帶來更廣闊的前景，尤其是在提高藥物滲透、安全無毒等理念的研究環(huán)境下，柔性脂質(zhì)體一出現(xiàn)就備受關(guān)注。二元醇質(zhì)體在其制備方式上打破了傳統(tǒng)醇質(zhì)體的束縛，提示更多元化醇質(zhì)體開發(fā)的可能性。

TP作為雷公藤的主要活性成分，能對關(guān)節(jié)炎等疾病起到良好的治療作用，且經(jīng)皮給藥制劑是關(guān)節(jié)炎治療中常用的給藥方式，具有能直接作用于病灶部位、起效速度快及毒副作用小等優(yōu)點，故本研究將TP制成二元醇質(zhì)體并對其進行質(zhì)量評價。參考醇質(zhì)體制備工藝，以粒徑和包封率作為重要的評價指標，選取對二元醇質(zhì)體影響較大的投藥量、卵磷脂用量、醇相用量三個因素進行Box-Behnken設(shè)計，優(yōu)化處方，最終確定TP二元醇質(zhì)體制備工藝為制備溫度35℃、轉(zhuǎn)速600 r·min、水合時間30 min、超聲功率300 W、二元醇比為7∶3、 膽卵比為1∶5，TP投藥量8.3 mg，卵磷脂濃度6.9 mg·mL，醇相用量38.5%，并加以驗證。經(jīng)過外觀、粒徑、PDI與電位、形態(tài)、穩(wěn)定性的檢測，證明制得的TP二元醇質(zhì)體分布均勻，穩(wěn)定性較好，且釋藥速率和累積釋放量均高于普通醇質(zhì)體，相較于TP乙醇水溶液，與Higuchi模型擬合度較高，具有較好的皮膚穿透力，可為TP經(jīng)皮給藥劑型提供參考。接下來課題組會將其制備成凝膠劑，并對其進行評價，旨在為TP臨床應用提供一種更為安全、有效的藥物制劑。