鮑倩倩，王強(qiáng)，桑冉，王雷*，陳衛(wèi)東*（1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，合肥 230012；2.中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230012；3. 藥物制劑技術(shù)與應(yīng)用安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230012；4. 蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，安徽 蚌埠 233000；5. 蚌埠醫(yī)學(xué)院，安徽 蚌埠 233030）

外泌體（exosomes，Exos）是一種幾乎所有類型的細(xì)胞都會(huì)分泌的細(xì)胞外囊泡，其直徑約為100 nm。近年來(lái)，Exos作為載藥體系受到了越來(lái)越廣泛的關(guān)注，與其他載藥系統(tǒng)相比，Exos因源于自體而具有免疫原性低、生物相容性高等特點(diǎn)；更重要的是，Exos具有潛在的靶向能力，有助于提高藥物的靶向能力。但載藥量較低、修飾的靈活性低，且穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)極大地制約了Exos作為藥物載體的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用。

脂質(zhì)體（liposomes，Lips）是磷脂在水中形成的一種具有磷脂雙分子層的囊泡，粒徑一般在40～200 nm。Lips因其載藥性能良好、易于制備和修飾靈活而被作為藥物載體廣泛應(yīng)用，但Lips屬于外源性物質(zhì)，易被單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)快速清除且靶向性較差。Exos與Lips在結(jié)構(gòu)上相似，都具有脂質(zhì)雙分子層，粒徑相近；在生理功能上，兩者具有良好的互補(bǔ)性。因此，將這兩種納米囊泡融合形成一個(gè)新的雜化納米囊泡可以保留兩者的優(yōu)點(diǎn)。這種巨噬細(xì)胞外泌體-脂質(zhì)體雜化納米粒（macrophages derived exosomes-liposomes hybrid nanoparticles，MEL NPs）同時(shí)具有Exos的內(nèi)源性和Lips修飾的靈活性，還能提高Exos的穩(wěn)定性?；诖?，本研究采用超聲法融合Exos與Lips，并對(duì)融合后的MEL NPs進(jìn)行表征，為MEL NPs作為藥物載體的后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；Tecnai G2 SpirtBiotwin透射電子顯微鏡（美國(guó)賽默飛公司）；Nano ZS90馬爾文粒度分析儀（美國(guó)馬爾文公司）；anti-JP-1高速低溫離心機(jī)、L-90K超高速低溫離心機(jī)、CYTOMICS FC 500流式細(xì)胞儀（美國(guó)貝克曼公司）；F-4600熒光分光光度計(jì)（日本Hitachi公司）；THUNDER 倒置熒光顯微鏡（德國(guó)徠卡公司）；JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 試藥

DMEM高糖培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素、胎牛血清（美國(guó)Hyclone公司）；細(xì)胞膜橙色熒光探針（DiI）染料（大連美侖生物技術(shù)有限公司）；細(xì)胞膜紅色熒光探針（DiD）、細(xì)胞膜綠色熒光探針（DiO）染料（上海碧云天試劑公司）；3%醋酸雙氧鈾染液（河南銳欣實(shí)驗(yàn)用品有限公司）；膽固醇、蛋黃卵磷脂（上海源葉生物科技有限公司）；泊洛沙姆188（北京金克隆生物技術(shù)有限公司）；多聚甲醛、DAPI、抗熒光淬滅劑（安徽Biosharp公司）；一抗稀釋液、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG、ECL發(fā) 光 液（山 東SparkJade公 司）；TSG101、Alix抗體（成都正能生物公司）。

1.3 細(xì)胞

小鼠腹腔巨噬細(xì)胞Raw 264.7和肝癌細(xì)胞Hepa 1-6購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠腹腔巨噬細(xì)胞Raw 264.7在37℃、5% CO恒溫培養(yǎng)箱中，采用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度到80%左右，用不完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞上清液。

2.2 Exos提取

采用超高速離心法提取Exos，細(xì)胞上清液4℃、300 g離心10 min去除細(xì)胞，然后4℃、2000 g離心10 min去除死細(xì)胞，4℃、10 000 g離心30 min去除細(xì)胞碎片。取上清液4℃、100 000 g離心70 min，所得沉淀即為Exos粗提物。沉淀用PBS重懸后，于4℃、100 000 g離心70 min，所得沉淀用PBS重懸后保存在－80℃?zhèn)溆谩?/p>

2.3 Lips制備

精密稱取處方量的蛋黃卵磷脂、膽固醇，溶于3 mL無(wú)水乙醇中，處方量的泊洛沙姆188溶于50℃預(yù)熱的20 mL ddHO中，用1 mL注射器在液面下將溶解完全的有機(jī)相緩慢注入至水相中，50℃，1000 r·min攪拌2 h使有機(jī)溶劑揮發(fā)，即得Lips。

2.4 MEL NPs的制備

采用超聲孵育法制備MEL NPs：取4份Exos（200 μg蛋白）分別與200、1000、2000、4000 μg的Lips混合均勻后用PBS定容至500 μL，80 W超聲10 min（5 s開，5 s關(guān)）后，37℃孵育1 h。

2.5 MEL NPs的表征

2.5.1 形態(tài)學(xué)觀察 各取10 μL的Exos、Lips、MEL NPs稀釋液滴加在銅網(wǎng)上，用1%醋酸雙氧鈾染液進(jìn)行染色，染色完成后用濾紙吸去多余的染液，在透射電鏡下觀察其形態(tài)。

2.5.2 粒徑和Zeta電位 取Lips、Exos、MEL NPs母液，適量稀釋后測(cè)定納米囊泡的平均粒徑以及Zeta電位。

2.5.3 外泌體的標(biāo)志性蛋白檢測(cè) 使用適量的RIPA裂解液（含1%PMSF溶液）提取Raw 264.7細(xì)胞、Exos以及MEL NPs總蛋白，定量后調(diào)整蛋白濃度，100℃煮沸8 min后進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，洗滌和孵育抗體（TSG101和Alix抗體濃度為1∶1000，二抗?jié)舛葹?∶12 000），ECL發(fā)光液顯影曝光。

2.5.4 熒光共振能量轉(zhuǎn)移分析 熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）是指當(dāng)一個(gè)供體熒光基團(tuán)的發(fā)射光譜與受體熒光基團(tuán)的激發(fā)光譜有部分重疊，當(dāng)兩個(gè)基團(tuán)的距離足夠接近時(shí)，處于激發(fā)狀態(tài)的供體能將其熒光能量轉(zhuǎn)移給受體，從而激發(fā)受體的熒光。膜融合會(huì)導(dǎo)致兩個(gè)熒光基團(tuán)的距離增加，F(xiàn)RET效應(yīng)減弱，供體的熒光強(qiáng)度隨著融合的進(jìn)行而恢復(fù)，相反，受體的熒光強(qiáng)度降低。本研究以DiI作為熒光供體，DiD作為熒光受體，兩者按摩爾比1∶7加至脂質(zhì)體中得到FRET脂質(zhì)體，去除游離染料后與Exos融合得到MEL NPs，測(cè)量Lips和MEL NPs在550～750 nm的熒光光譜，通過(guò)MEL NPs中DiD熒光強(qiáng)度的減弱判斷是否發(fā)生融合。

2.6 MEL NPs 的細(xì)胞攝取

在MEL NPs中加入適量DiO染料，37℃避光孵育15 min，10 000 g離心10 min初步去除多余的染料，然后將上清液轉(zhuǎn)移至100 kDa超濾離心管內(nèi)，10 000 g離心10 min，棄去上清液，加入200 μL PBS重懸，重復(fù)3次，即得DiO標(biāo)記的MEL NPs。

將Hepa 1-6細(xì)胞以適宜的密度接種于覆蓋有細(xì)胞爬片的12孔板中，待細(xì)胞貼壁后，加入DiO標(biāo)記的MEL NPs共孵育2 h后，4%多聚甲醛固定15 min，DAPI標(biāo)記細(xì)胞核，抗熒光淬滅劑封片，倒置熒光顯微鏡觀察。

將Hepa 1-6細(xì)胞以適宜的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，加入DiO標(biāo)記的MEL NPs共孵育2 h后，預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3遍，加入胰酶消化細(xì)胞，1200 r·min離心5 min，棄去上清液。預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，棄上清液，PBS重懸，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

3 結(jié)果

3.1 MEL NPs的制備條件優(yōu)化

以粒徑、PDI和FRET效應(yīng)作為考察指標(biāo)，考察Exos與Lips的比例對(duì)MEL NPs制備的影響，結(jié)果見表1。由表1可知，各條件下制備的MEL NPs粒徑均在100 nm左右，尺寸分布比較均勻，穩(wěn)定性良好。Exos與Lips的比例為1∶1、1∶5和1∶10時(shí)，F(xiàn)RET效應(yīng)減弱，證明Exos與Lips融合成功。研究表明，不同比例的Exos和Lips混合會(huì)改變雜化納米粒中Exos和Lips的百分比，且在一定范圍內(nèi)，隨著Lips比例的增大，雜化納米粒中Lips的比例也會(huì)隨之增大。由于MEL NPs的建立是為后期載藥奠定基礎(chǔ)，而藥物是載在Lips中，考慮到載藥量、同時(shí)保留Exos的內(nèi)源性優(yōu)勢(shì)，選擇1∶5進(jìn)行后續(xù)研究。

表1 Exos與Lips的比例對(duì)MEL NPs的影響(＝3)
Tab 1 Influence of different Exos to Lips ratios on MEL NPs (＝3)

Exo∶Lips 粒徑/nm PDI FRET效應(yīng)減弱1∶1 114.83±2.91 0.17±0.02 有1∶5 97.25±2.66 0.20±0.02 有1∶10 115.63±1.60 0.16±0.002 有1∶20 102.56±2.77 0.17±0.02 無(wú)

3.2 MEL NPs的表征

3.2.1 形態(tài)表征 納米粒的形態(tài)見圖1。Lips、Exos與MEL NPs均呈囊泡狀結(jié)構(gòu)，這些納米囊泡大小相似，形態(tài)近似球形。

圖1 透射電鏡觀察Lips、Exos和MEL NPs的形態(tài)（標(biāo)尺：200 nm）Fig 1 Morphology of Lips，Exos and MEL NPs were imaged with transmission electron microscopy（scar bar：200 nm）

3.2.2 粒徑及Zeta電位表征 結(jié)果見圖2，Lips、Exos和MEL NPs的粒徑分別為（91.79±0.31）nm（PDI＝0.16±0.003）、（127.17±0.45）nm（PDI＝0.22±0.01）和（98.20±0.45）nm（PDI＝0.17±0.02），Zeta電位分別為（－24.53±0.58）mV、（－13.13±0.34）mV和（－16.23±1.00）mV。MEL NPs的粒徑大于Lips，可能是Lips與Exos的融合增加了水分子的相互作用點(diǎn)，從而增加了水化層數(shù)。此外，相較于Exos，MEL NPs的電位和PDI有所降低，表明MEL NPs具有良好的尺寸均勻性和穩(wěn)定性。

圖2 馬爾文納米粒度儀檢測(cè)Lips、Exos和MEL NPs的粒徑（A）和Zeta電位分布（B）Fig 2 Size distribution（A）and Zeta potential（B）of Lips，Exos，and MEL NPs measured by dynamic light scattering

3.2.3 Western blot表征 結(jié)果見圖3，所提取的Exos和超聲融合后的MEL NPs均表達(dá)Alix和TSG101蛋白，且表達(dá)量顯著高于Raw 264.7細(xì)胞，表明超聲融合不影響外泌體的性質(zhì)。

圖3 Western blot檢測(cè)融合后外泌體標(biāo)志蛋白的Alix和TSG101的表達(dá)Fig 3 Exos markers Alix and TSG101 detected by Western blot after the fusion

3.2.4 FRET表征 結(jié)果見圖4，Lips光譜為融合前，MEL NPs光譜為融合后，融合后MEL NPs的DiI熒光強(qiáng)度恢復(fù)，DiD熒光強(qiáng)度降低，F(xiàn)RET效應(yīng)減弱，表明FRET熒光供體和受體之間的距離增加，Lips與Exos成功融合。

圖4 FRET驗(yàn)證Lips與Exos融合Fig 4 Verify Lips and Exos fusion through FRET

3.3 MEL NPs的細(xì)胞攝取

由圖5可知，相比Lips，Hepa 1-6細(xì)胞對(duì)于MEL NPs的攝取有所增加，表明超聲融合并未破壞Exos的體外靶向能力。

圖5 倒置熒光顯微鏡（A）和流式細(xì)胞儀（B）檢測(cè)Hepa 1-6 細(xì)胞對(duì)Lips和MEL NPs的攝取Fig 5 Inverted fluorescence microscope（A）and flow cytometry（B）recorded the uptake of Lips and MEL NPs by Hepa 1-6 cells

4 討論

巨噬細(xì)胞是先天性免疫細(xì)胞的主要組成部分，其在炎癥調(diào)節(jié)和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。Exos可以攜帶親本細(xì)胞的信息，從而具有親本細(xì)胞的功能。例如，人巨噬細(xì)胞Exos可以攜帶高水平的miR-142和miR-223，在進(jìn)入肝癌細(xì)胞后，抑制肝癌細(xì)胞的增殖。M1型巨噬細(xì)胞Exos可以誘導(dǎo)腫瘤局部炎性微環(huán)境，從而增強(qiáng)紫杉醇的體內(nèi)抗腫瘤作用。巨噬細(xì)胞Exos在腫瘤和炎癥中的重要作用以及其內(nèi)源性的優(yōu)點(diǎn)，讓其作為藥物載體受到了研究者越來(lái)越廣泛的關(guān)注。但Exos載藥量的不足可能會(huì)限制其進(jìn)一步的應(yīng)用，而Lips在載藥量方面具有顯著優(yōu)勢(shì)，將Exos和Lips融合可以將兩者的優(yōu)勢(shì)結(jié)合，同時(shí)規(guī)避各自的劣勢(shì)。這種混合膜雜化納米粒載藥系統(tǒng)近年來(lái)受到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。Rayamajhi等將巨噬細(xì)胞來(lái)源的小細(xì)胞外囊泡與負(fù)載阿霉素的Lips融合，制備出具有靶向能力且可在酸性條件下pH敏感性釋放藥物的混合膜雜化納米粒。Cheng等將過(guò)表達(dá)CD47的CT26細(xì)胞Exos與負(fù)載光熱劑的熱敏Lips融合制備混合膜雜化納米粒，該雜化納米?？梢酝ㄟ^(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合SIRP

α

來(lái)增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的吞噬，并可以通過(guò)近紅外激光照射光熱劑消融腫瘤細(xì)胞，具有優(yōu)異的體內(nèi)外抗腫瘤效果?；旌夏るs化納米粒載藥系統(tǒng)同時(shí)具有Exos和Lips的優(yōu)點(diǎn)，表現(xiàn)出優(yōu)異的靶向性，高載藥量和對(duì)單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的逃避，是一種很有應(yīng)用前景的載藥系統(tǒng)。

Exos的提取方法主要有超高速離心法、免疫親合法、PEG沉淀法、尺寸排阻色譜法和微流體技術(shù)等，其中超高速離心法因操作簡(jiǎn)單，成本相對(duì)低廉并且獲得的Exos純度較高而被廣泛使用。

MEL NPs的制備方法主要有孵育法、超聲法、反復(fù)凍融法，所有這些技術(shù)在Exos特性的保持方面各有優(yōu)劣，孵育法可能導(dǎo)致制備的MEL NPs顆粒粒徑不均一，而反復(fù)凍融過(guò)程中Exos蛋白可能遭到破壞。本研究采用超聲法制備MEL NPs，通過(guò)馬爾文粒度分析儀、透射電鏡、熒光分光光度計(jì)、Western blot、倒置熒光顯微鏡以及流式細(xì)胞儀對(duì)其進(jìn)行了一系列表征，發(fā)現(xiàn)超聲融合在未破壞Exos內(nèi)源性優(yōu)勢(shì)的同時(shí)提高其穩(wěn)定性，這為其作為藥物載體進(jìn)行進(jìn)一步研究提供了一定的基礎(chǔ)。