閆偉偉，羅慧玉，唐殿飛，丁杰，陳正源（張家口市食品藥品檢驗(yàn)中心，河北 張家口 075000）

血塞通滴丸是由三七總皂苷提取物應(yīng)用固體分散技術(shù)制成的制劑，具有活血祛瘀、通脈活絡(luò)等多種功效。臨床上多用于治療中風(fēng)偏癱、心脈腦絡(luò)癖阻、胸痹、心絞痛及腦血管病后遺癥等多種病癥。查閱資料發(fā)現(xiàn)，目前已有關(guān)于血塞通滴丸臨床應(yīng)用、制備工藝、定性鑒別及含量測定等方面的研究，但未涉及到溶出度相關(guān)報(bào)道。溶出度是模擬口服固體制劑在胃腸道中的崩解和溶出情況用來評價(jià)制劑活性成分的體內(nèi)生物利用度和藥物的內(nèi)在品質(zhì)，會(huì)影響藥物的吸收并反映制劑的工藝。本試驗(yàn)以三七總皂苷中的三七皂苷R、人參皂苷Rg、人參皂苷Re、人參皂苷Rb和人參皂苷Rd 為指標(biāo)成分，通過質(zhì)量權(quán)重系數(shù)法對皂苷組分進(jìn)行溶出度整合并以此表征其整體溶出情況，為血塞通滴丸的溶出度檢測提供準(zhǔn)確可行的檢驗(yàn)方法，為其質(zhì)量控制及評價(jià)提供參考。

1 材料

LC-2010A HT型高效液相色譜儀（島津公司）；CPA225D分析天平（德國賽多利斯集團(tuán)，感量：0.01 mg）；RCZ-8M溶出儀（天大天發(fā)科技有限公司）；Milli-Q Integral純水/超純水機(jī)（美國Millipore 公司）。血塞通滴丸信息見表1。對照品三七皂苷R（批號(hào)：110745-201921，純度：90.4%）、人參皂苷Rg（批號(hào)：110703-201530，純度：91.7%）、人參皂苷Re（批號(hào)：110754-202028，純度：93.9%）、人參皂苷Rb（批號(hào)：110704-202028，純度：93.1%）和人參皂苷Rd（批號(hào)：111818-201603，純度：92.1%）（中國食品藥品檢定研究院）。甲醇、乙腈為色譜純，磷酸、冰醋酸、磷酸二氫鉀、醋酸鈉均為分析純，水由超純水機(jī)制備。

表1 血塞通滴丸樣品信息
Tab 1 Sample information of Xuesaitong dropping pills

編號(hào) 廠家 批號(hào) 生產(chǎn)年份A-1 朗天藥業(yè) 20190401 2019 B-1 昆藥集團(tuán) 181004 2018 B-2 昆藥集團(tuán) 191243 2019 B-3 昆藥集團(tuán) 200113 2020 C-1 神威藥業(yè) 19082721 2019

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[10-11]

色譜柱：Thermo C色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水，梯度洗脫（0～21 min，22% 乙 腈；21～45 min，22%～48%乙腈；45～55 min，48%～55% 乙 腈；55～60 min，55% 乙腈；60～62 min，55%～22%乙腈；62～72 min，22% 乙腈）；流速：1.0 mL·min；檢測波長：203 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μL，記錄色譜圖（見圖1）。

圖1 混合對照品（A）和供試品溶液（B）的HPLC圖Fig 1 HPLC of mixed reference（A）and sample solution（B）

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取三七皂苷R及人參皂苷Rg、Rb、Rd對照品各22.90、23.32、22.40、21.82 mg，分別置于5 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得質(zhì)量濃度分別 為4.1403、4.2769、4.1709、4.0192 mg·mL的對照品儲(chǔ)備液；另精密稱取人參皂苷Re對照品13.37 mg置于25 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得質(zhì)量濃度為0.5022 mg·mL的人參皂苷Re對照品儲(chǔ)備液。精密量取上述各儲(chǔ)備液適量置于同一10 mL棕色量瓶中，加甲醇定容，得三七皂苷R0.041 40 mg·mL，人參皂苷Rg、Re、Rb、Rd質(zhì)量濃度分別為 0.1634、0.016 72、0.1564、0.050 24 mg·mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 以脫氣后的200 mL水為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為50 r·min，照溶出度測定法《中國藥典》2020年版四部通則0931溶出度測定方法第三法（小杯法）操作；取滴丸10粒，共6份，稱定質(zhì)量后投入溶出杯中，立即啟動(dòng)溶出儀并計(jì)時(shí)。于2、5、8、10、15、20、25、30、45 min分別取樣，每次1 mL，同時(shí)補(bǔ)充等量同溫度的水，各時(shí)間點(diǎn)溶出液置0℃以下放置30 min，待基質(zhì)析出后，迅速濾過，即得。

2.2.3 含量測定溶液的制備 取本品50 粒，精密稱定質(zhì)量，計(jì)算平均粒重，研細(xì)，取約相當(dāng)于10粒質(zhì)量的粉末，精密稱定，置于200 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，置0℃以下放置30 min，待基質(zhì)析出后，迅速濾過，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下各對照品儲(chǔ)備液適量，加甲醇分別稀釋制成不同質(zhì)量濃度的對照品溶液，進(jìn)樣測定，以峰面積為縱坐標(biāo)（

Y

），質(zhì)量濃度（mg·mL）為橫坐標(biāo)（

X

）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2。

表2 各指標(biāo)成分的線性方程和相關(guān)系數(shù)
Tab 2 Linear regression equation and related coefficient of index components

成分 線性方程 R2 線性范圍/（mg·mL－1）三七皂苷R1 Y＝6.53×106X＋1.16×104 0.9996 0.005 18～0.207人參皂苷Rg1 Y＝8.03×106X－5.18×104 0.9991 0.0107～0.534人參皂苷Re Y＝6.49×106X－3.46×103 0.9995 0.002 51～0.0502人參皂苷Rb1 Y＝4.69×106X＋1.41×104 0.9994 0.0130～1.043人參皂苷Rd Y＝5.84×106X－2.58×103 0.9997 0.003 36～0.502

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，三七皂苷R和人參皂苷Rg、Re、Rb、Rd峰面積的

RSD

分別為 0.28%、0.63%、0.56%、0.40% 和0.72%，表明儀器精密度良好。2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下的15 min溶出液（批號(hào)：200113）共6份，進(jìn)樣檢測，結(jié)果三七皂苷R和人參皂苷Rg、Re、Rb、Rd峰面積的

RSD

分 別 為1.3%、1.3%、1.8%、1.5%和1.9%，表明方法重復(fù)性良好。2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下的15 min溶出液（批號(hào)：200113），分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，結(jié)果三七皂苷R和人參皂苷Rg、Re、Rb、Rd峰面積的

RSD

分別為0.86%、0.62%、1.1%、1.1% 和0.91%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。2.3.5 加樣回收試驗(yàn) 取批號(hào)為200113樣品，精密稱定6份，每份約0.2447 g，分別置于25 mL量瓶中，按大致1∶1比例進(jìn)行加樣，用甲醇稀釋至刻度，濾過，精密量取5 mL置于25 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，0℃以下放置30 min，待基質(zhì)析出后，濾過，進(jìn)樣，記錄色譜峰并計(jì)算回收率。結(jié)果三七皂苷R和人參皂苷Rg、Re、Rb、Rd的平均回收率分別為99.68%、99.60%、98.36%、97.60%、97.99%，

RSD

分別為0.69%、0.62%、0.64%、0.46%、0.73%。

2.4 溶出度計(jì)算

2.4.1 溶出度計(jì)算 以各時(shí)間點(diǎn)溶出液的色譜峰面積按線性方程計(jì)算該成分的溶出量（

M

），公式中

C

為某時(shí)間點(diǎn)的質(zhì)量濃度（mg·mL），

V

為溶出介質(zhì)體積（mL），

V

為取出液體積（mL）。取“2.2.3”項(xiàng)下溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定樣品峰面積，計(jì)算各指標(biāo)成分的含量（以mg·g計(jì)），含量乘以溶出樣品的質(zhì)量計(jì)算該成分的累計(jì)溶出量（

M

）。溶出度公式為：

Q

＝

M/M

×100%，

Q

為

t

時(shí)間某成分的溶出度。

2.4.2 整合溶出度計(jì)算 中藥具有多組分、整體論治的特點(diǎn)，僅靠對單一活性藥物成分進(jìn)行溶出行為的考察指標(biāo)評價(jià)其質(zhì)量，不能全面體現(xiàn)中藥多成分協(xié)同作用的特點(diǎn)。本試驗(yàn)參考文獻(xiàn)，通過引入質(zhì)量權(quán)重系數(shù)，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為各指標(biāo)項(xiàng)的權(quán)重系數(shù)（即質(zhì)量分?jǐn)?shù)權(quán)重系數(shù)）綜合表征血塞通滴丸皂苷組分的溶出度，以客觀真實(shí)地反映血塞通滴丸皂苷組分的整體溶出情況。其中，以皂苷組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為整體單位，即為質(zhì)量權(quán)重系數(shù)參照，各指標(biāo)成分質(zhì)量權(quán)重系數(shù)為該成分與組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)之比。各成分質(zhì)量權(quán)重系數(shù)公式如下：

φ

=（933.13/4737.72）×100%＝19.70%，

φ

=（801.01/4737.72）×100%＝16.91%，

φ

=（917.14/4737.72）×100%＝19.99%，

φ

=（1109.29/4737.72）×100%＝23.41%，

φ

=（947.15/4737.72）×100%＝19.99%。根據(jù)每一時(shí)間點(diǎn)下5種指標(biāo)成分的溶出度（

Q

）與各自的權(quán)重系數(shù)，計(jì)算血塞通滴丸在該時(shí)間點(diǎn)下的整合溶出度，則

Q

＝

φ

×

Q

＋

φ

×

Q

＋

φ

×

Q

＋

φ

×

Q

＋

φ

×

Q

。

2.5 溶出條件的選擇

2.5.1 溶出介質(zhì)的選擇 以批號(hào)為200113的血塞通滴丸為研究對象，采用小杯法測定，固定其他條件不變，分別考察了水、pH 4.5醋酸鹽緩沖液、pH 6.8磷酸鹽緩沖液為溶出介質(zhì)時(shí)的整合溶出度，以該樣品在3種溶出介質(zhì)中的整合溶出度為縱坐標(biāo)、溶出時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制3種介質(zhì)中的整合溶出曲線，見圖2。結(jié)果表明溶出介質(zhì)的改變對整合溶出度影響較大，選擇水作為溶出介質(zhì)時(shí)，血塞通滴丸溶出迅速，在樣品達(dá)到溶出平衡后，整合溶出度最大，因此確定水作為溶出介質(zhì)。

圖2 血塞通滴丸在不同介質(zhì)中的整合溶出度Fig 2 Integrated dissolution in different dissolution media of Xuesaitong dropping pills

2.5.2 轉(zhuǎn)速的選擇 按擬定溶出條件，采用小杯法測定，固定其他條件不變，以50 r·min與75 r·min進(jìn)行轉(zhuǎn)速篩選，結(jié)果表明兩種轉(zhuǎn)速條件下的整合溶出度比較接近，且在50 r·min轉(zhuǎn)速下15 min時(shí)整合溶出度即可達(dá)85%，因此確定轉(zhuǎn)速為50 r·min。

2.5.3 限度和取樣時(shí)間的選擇 以B廠家的3批次樣品為研究對象，按擬訂條件進(jìn)行累計(jì)溶出度測定，結(jié)果見圖3。根據(jù)文獻(xiàn)確定溶出度取樣時(shí)間點(diǎn)為溶出曲線中第一次連續(xù)兩點(diǎn)平均溶出度均在85%以上，且此兩點(diǎn)溶出度的平均值之差在5% 以內(nèi)（即“平臺(tái)期”）時(shí)的第一時(shí)間點(diǎn)，并將該點(diǎn)溶出度減去15%作為溶出限度。本實(shí)驗(yàn)的3批次樣品在15 min時(shí)溶出趨于平穩(wěn)，溶出度在85%以上，故確定取樣時(shí)間點(diǎn)為15 min，同時(shí)，該點(diǎn)的溶出度減去15%為77.03%，確定溶出限度為75%。

圖3 B廠家樣品整合溶出度曲線Fig 3 Integrated dissolution curve of samples from manufacturer B

2.6 溶出曲線繪制與比較

以批號(hào)為200113的血塞通滴丸為研究對象，繪制了5種指標(biāo)成分溶出度與整合溶出度的溶出曲線，結(jié)果見圖4；以整合溶出度為參比，采用非模型依賴的相似因子（

f

）法比較各成分溶出曲線的相似性。

f

的計(jì)算公式為：

圖4 5種指標(biāo)成分與整合溶出度溶出曲線Fig 4 5 indexes and integrated dissolution curve

公式中

n

為時(shí)間點(diǎn)個(gè)數(shù)，

R

為參比樣品（或變更前樣品）在

t

時(shí)刻的溶出度值，

T

為試驗(yàn)批次（變更后樣品）在

t

時(shí)刻的溶出度值。

f

越接近100，相似度越高；當(dāng)

f

在50～100時(shí)，表示溶出行為相似，無顯著性差異。通過計(jì)算，本樣品中三七皂苷R及人參皂苷Rg、Re、Rb和Rd 的

f

因子分別為76.2389、80.3563、70.7574、80.9373和62.0467，均大于50，表明整合溶出曲線與5種指標(biāo)成分的溶出曲線相似性較好，可以反映血塞通滴丸皂苷組分的整體溶出情況。

2.7 溶出模型擬合與比較

取批號(hào)為200113血塞通滴丸，采用不同的模型進(jìn)行擬合，推測藥物溶出機(jī)制，結(jié)果見表3，以Weibull模型最好。選用Weibull模型計(jì)算該批次樣品溶出參數(shù)

T

、

T

和

T

，結(jié)果分別為3.87 min、5.19 min和12.33 min，表明血塞通滴丸在15 min內(nèi)溶出度可達(dá)到85%以上，可實(shí)現(xiàn)速效的目的。

表3 整合溶出度擬合結(jié)果
Tab 3 Fitting of integrated dissolution

模型 擬合方程 R2零級釋放方程 Q＝1.4905t＋48.5300 0.4996一級釋放方程 ln（1－Q）＝－0.0637t＋3.8157 0.6993 Weibull方程 ln[1/（1－Q）]＝1.0383lnt－5.3163 0.9267 Peppas方程 lnQ＝0.6107lnt＋2.6312 0.7680 Higuchi方程 Q＝14.3210t1/2＋19.0630 0.6826

2.8 樣品測定

按擬定溶出度測定方法對3個(gè)企業(yè)5批次血塞通滴丸樣品進(jìn)行溶出度試驗(yàn)，平均整合溶出度見表4，不同企業(yè)的血塞通滴丸樣品在15 min時(shí)溶出度均已達(dá)到所設(shè)定的限度要求。

表4 5批血塞通滴丸溶出度試驗(yàn)測定(＝6)
Tab 4 Dissolution of 5 batches of Xuesaitong dropping pills (＝6)

批號(hào) 整合溶出度/% RSD/%20190401 90.36 0.85 181004 92.06 1.26 191243 92.03 1.08 200113 92.20 1.35 19082721 86.03 0.95

3 討論

由于血塞通滴丸樣品中每粒滴丸含三七總皂苷較少，5種指標(biāo)成分含量相對較低，為提高準(zhǔn)確度，本試驗(yàn)選擇考察10粒血塞通滴丸的溶出度，同時(shí)選擇小杯法，溶出介質(zhì)體積選擇 200 mL，以降低試驗(yàn)偏差。有文獻(xiàn)報(bào)道三七總皂苷在pH 1.0鹽酸溶液中不穩(wěn)定，易發(fā)生水解而生成脂溶性苷元；在預(yù)試驗(yàn)時(shí)，課題組以pH 1.2鹽酸溶液為溶出介質(zhì)時(shí)，有部分成分色譜峰未檢測到，故本試驗(yàn)僅選用pH 4.5醋酸鹽緩沖液、pH 6.8磷酸鹽緩沖液和水進(jìn)行溶出曲線的測定及溶出介質(zhì)的篩選。

為使各色譜峰與相鄰峰分離度大于1.5，本試驗(yàn)參考文獻(xiàn)并進(jìn)行優(yōu)化，確定以乙腈-水流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，取得了滿意的分離效果，且理論板數(shù)按人參皂苷Rg計(jì)算大于6000。本試驗(yàn)同時(shí)對比了各指標(biāo)成分的含量與溶出60 min后快速攪拌30 min（250 r·min）的最大溶出量的差異以確定完全溶出點(diǎn)，結(jié)果兩種方法含量無明顯差別，故確定以制劑自身含量為完全溶出點(diǎn)，作為溶出度的計(jì)算參照，以準(zhǔn)確反映樣品的真實(shí)溶出度。

滴丸制劑在制備過程中混有不同比例的聚乙二醇等成型基質(zhì)，容易對儀器及系統(tǒng)造成嚴(yán)重?fù)p害，根據(jù)血塞通滴丸含量測定方法，將樣品溶液置于0℃以下30 min，待基質(zhì)析出后再過濾進(jìn)樣可減少對儀器的損害。