張 激 ,譚興民

四川省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院:1.腫瘤科;2.婦科,四川成都 610041

宮頸癌是最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一,其發(fā)病率及病死率在女性惡性腫瘤中均高居第四位,僅2020年全球新增宮頸癌患者60余萬(wàn)例,新增死亡患者30余萬(wàn)例,且發(fā)病呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)[1]。研究表明人乳頭瘤病毒(HPV)的感染與多數(shù)宮頸癌病例的發(fā)生密切相關(guān),但環(huán)境因素及基因突變均可能誘導(dǎo)宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展[2-3]。近年來(lái),基因異常表達(dá)與宮頸癌發(fā)生的關(guān)系正在成為臨床關(guān)注和研究的熱點(diǎn),探討具有價(jià)值的宮頸癌治療靶點(diǎn),對(duì)于臨床治療,提升女性健康具有十分重要的意義。

含鉀通道四聚結(jié)構(gòu)域蛋白11(KCTD11)能夠參與多種細(xì)胞生理活動(dòng),如細(xì)胞轉(zhuǎn)移及凋亡等[4-5]。研究表明,KCTD11的表達(dá)與前列腺癌、肝癌及神經(jīng)管細(xì)胞瘤的發(fā)生密切相關(guān)[6-7],但其在宮頸癌中的作用及機(jī)制尚不明確。本研究分析了KCTD11在宮頸癌中的表達(dá)情況,探討KCTD11對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制,旨在為宮頸癌的基因治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 宮頸癌HeLa 細(xì)胞與人胚腎細(xì)胞系HEK293FT 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院。DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素/鏈霉素、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。細(xì)胞總RNA 提取試劑Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及定量試劑購(gòu)自日本Takara公司。MG132 購(gòu)自MCE公司。KCTD11抗體及Tubulin抗體購(gòu)自北京博奧森公司,Flag、Myc、CDK2、CDK4、CDK6、CCND3及CCNE2 抗體購(gòu)自美國(guó)CST 公司。Myc、CDK2、CDK4、CDK6、CCND3、CCNE2、KCTD11 及GAPDH 定量引物購(gòu)自華大基因。慢病毒包裝質(zhì)粒pLP1、pLP2及VSVG,染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(ChIP)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自賽默飛生命科學(xué)公司。RIPA 裂解液、蛋白酶體抑制劑PMSF等常規(guī)生化試劑購(gòu)自上海生工公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT 測(cè)定 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞,經(jīng)過(guò)胰酶消化后添加培養(yǎng)基重新成懸,并利用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)處理后,將細(xì)胞加入96孔板,每孔1 000個(gè)細(xì)胞。放置培養(yǎng)箱中24 h后,每孔添加MTT 溶液25 μL,培養(yǎng)2 h后,移除培養(yǎng)基,每孔添加200 μL DMSO,水平搖床孵育10 min后,于560 nm 波長(zhǎng)條件下測(cè)定各組細(xì)胞吸光度(A560),共測(cè)定7 d,繪制成生長(zhǎng)曲線。

1.2.2 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 取所需測(cè)定細(xì)胞,經(jīng)過(guò)胰酶消化,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后,收集細(xì)胞沉淀,并添加適量的含蛋白酶體抑制劑的RIPA裂解液,冰上裂解30 min后,離心收集上清液。利用BCA 試劑盒測(cè)定各組蛋白濃度,根據(jù)濃度計(jì)算上樣量,每組上樣50 μg蛋白。各組蛋白經(jīng)高溫變性后,于10% PAGE 膠中進(jìn)行電泳,并將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。使用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后,孵育一抗(4 ℃過(guò)夜),次日回收一抗,TBST 清洗后,室溫孵育二抗2 h。使用TBST 清洗,利用化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)相關(guān)蛋白信號(hào)。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR) 經(jīng)胰酶消化,PBS清洗后的細(xì)胞沉淀,依據(jù)RNA 提取試劑盒步驟提取總RNA(默克生物,貨號(hào):12183018A),經(jīng)過(guò)質(zhì)量檢測(cè)及濃度測(cè)定后,將其反轉(zhuǎn)為cDNA。后采用RT-qPCR 進(jìn)行檢測(cè),每組3 個(gè)復(fù)孔。引物序列見(jiàn)表1。

表1 定量引物序列

1.2.4 ChIP分析 過(guò)表達(dá)融合Flag標(biāo)簽KCTD11蛋白的HeLa細(xì)胞經(jīng)過(guò)1%甲醛溶液固定后,利用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞沉淀,并加入裂解液,于適合的超聲條件下,將其染色質(zhì)打斷到200～1 000 bp。離心取上清液,并加入Flag抗體或IgG,4 ℃旋轉(zhuǎn)過(guò)夜。次日,加入磁珠,并依照試驗(yàn)步驟,添加緩沖液進(jìn)行清洗純化。清洗純化后的磁珠-抗體-染色質(zhì)片段,經(jīng)過(guò)剝離液處理后,利用核酸回收試劑盒進(jìn)行純化回收后,利用Myc啟動(dòng)子引物進(jìn)行RT-qPCR,并分析試驗(yàn)結(jié)果,具體試驗(yàn)步驟參照碧云天ChIP 分析試劑盒,貨號(hào):P2078。

1.2.5 細(xì)胞周期檢測(cè) 取各組細(xì)胞經(jīng)過(guò)胰酶消化后,使用PBS清洗兩次,收集細(xì)胞沉淀。使用75%乙醇重新成懸細(xì)胞,直至完全成懸成單個(gè)細(xì)胞,放置于-20 ℃冰箱,固定24 h。固定完成后,離心收集細(xì)胞沉淀,使用預(yù)冷PBS清洗3次,用PBS重新成懸,加核糖核酸酶(RNAase)37 ℃處理30 min,加入500 μL PI常溫避光染色30 min,使用流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞的細(xì)胞周期分布情況。

1.2.6 數(shù)據(jù)庫(kù)分析 本研究使用UALCAN 數(shù)據(jù)庫(kù)(網(wǎng)址:http://ualcan.path.uab.edu/index.html)分析KCTD11在宮頸癌中的表達(dá)及與宮頸癌分級(jí)間的關(guān)系,首先選定“TCGA analysis”欄,于“Enter gene symbol”中輸入“KCTD11”,在“TCGA dataset”中選定宮頸癌后,點(diǎn)擊“Explore”即可得到分析結(jié)果。

本研究使用GEPIA 2 數(shù)據(jù)庫(kù)(網(wǎng)址:http://gepia2.cancer-pku.cn/#survival)分 析KCTD11 與 細(xì)胞周期蛋白表達(dá)相關(guān)性,選擇“Expression analysis”中“Correlation analysis”,在gene欄中輸入需要分析的兩個(gè)基因名,腫瘤類型中選擇宮頸癌,并點(diǎn)擊“Plot”即可得到分析結(jié)果,根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分組,分為正常組織(n=3)和宮頸癌組織(n=305)。

1.2.7 短發(fā)夾RNA(shRNA)載體構(gòu)建 取shRNA上游和下游各10 μL,設(shè)置一個(gè)對(duì)照(shNeg組)及兩個(gè)試驗(yàn)組,即shKCTD11-1#組與shKCTD11-2#組,加入雙蒸水80 μL于1.5 mL 離心管中。另取燒杯,裝適量沸水,將離心管放置燒杯內(nèi),使其自然退火降溫。取退火shRNA 5 μL,酶切后加入PLKO.1載體1 μL,使用T4 連接酶系統(tǒng)室溫連接過(guò)夜后,轉(zhuǎn)化涂板,挑取單克隆進(jìn)行測(cè)序。收到測(cè)序結(jié)果后,與shRNA 序列進(jìn)行比對(duì),選取100%匹配的菌株提取質(zhì)粒,即得到構(gòu)建好的shRNA 載體。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS20.0 和Graphpad Prism 5.0軟件進(jìn)行分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示,多組間比較使用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KCTD11在宮頸癌中的表達(dá) 利用在線數(shù)據(jù)庫(kù)(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)比較KCTD11在宮頸癌組織和正常組織中的表達(dá)情況,結(jié)果表明KCTD11在宮頸癌組織中的表達(dá)水平顯著高于其在正常組織中的表達(dá)水平(P<0.05),見(jiàn)圖1。

圖1 KCTD11在宮頸癌中的表達(dá)分析

2.2 敲低KCTD11對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖情況的影響shKCTD11-1#組及shKCTD11-2#組細(xì)胞中KCTD11的mRNA 和蛋白表達(dá)水平顯著低于shNeg組(P<0.001),見(jiàn)圖2。與shNeg組相比,shKCTD11-1#組及shKCTD11-2#組細(xì)胞增殖能力顯著降低(P<0.001),見(jiàn)圖3。同時(shí)下調(diào)KCTD11,會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期(P<0.05),見(jiàn)圖3。

圖2 RT-qPCR 和Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中KCTD11的表達(dá)

圖3 KCTD11對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響

2.3 KCTD11的表達(dá)與多種周期蛋白表達(dá)的關(guān)系 分析數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)(http://gepia2.cancer-pku.cn/#index)發(fā)現(xiàn),KCTD11的表達(dá)與原癌基因Myc及多種細(xì)胞周期蛋白(CDK2、CDK4、CDK6、CCND3及CCNE2)表達(dá)呈正相關(guān),見(jiàn)圖4。

圖4 KCTD11與Myc、CDK2、CDK4、CDK6、CCND3和CCNE2表達(dá)量的關(guān)系

2.4 抑制KCTD11 對(duì)細(xì)胞周期蛋白表達(dá)水平的影響抑制 KCTD11 后,shKCTD11-1# 組及sh-KCTD11-2#組細(xì)胞中原癌基因Myc及多種細(xì)胞周期蛋白(CDK2、CDK4、CDK6、CCND3及CCNE2)的mRNA 及蛋白表達(dá)水平顯著低于shNeg 組(P<0.001),見(jiàn)圖5。

圖5 KCTD11對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.5 KCTD11轉(zhuǎn)錄激活Myc 在宮頸癌細(xì)胞周過(guò)表達(dá)融合Flag標(biāo)簽的KCTD11蛋白,利用Flag抗體進(jìn)行ChIP 分析。結(jié)果表明,KCTD11能夠結(jié)合到原癌基因Myc的啟動(dòng)子上,從而激活Myc的表達(dá),見(jiàn)圖6。

圖6 KCTD11對(duì)Myc表達(dá)的影響

3 討論

KCTD11是KCTD 家族成員之一。KCTD 蛋白家族在細(xì)胞內(nèi),往往與Cullin3蛋白相互結(jié)合[8],參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控或泛素化調(diào)控過(guò)程,與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[9]。KCTD11作為該家族蛋白成員之一,早期研究主要著重于其與Hedgehog信號(hào)通路的關(guān)系,在細(xì)胞和生物體發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著十分重要的作用[10]。近年來(lái),有研究表明KCTD11的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān),如前列腺癌、肝癌及神經(jīng)管細(xì)胞瘤等,并發(fā)現(xiàn)其能直接激活Hippo信號(hào)通路[6-7]。

本研究由分析KCTD11在宮頸癌中的表達(dá)及其與宮頸癌級(jí)別的關(guān)系入手,發(fā)現(xiàn)KCTD11在宮頸癌組織中表達(dá)顯著升高,KCTD11可能與宮頸癌的發(fā)展密切相關(guān)。為進(jìn)一步探究KCTD11在宮頸癌中的作用,本研究在宮頸癌細(xì)胞中對(duì)KCTD11進(jìn)行了敲低處理,結(jié)果表明敲低KCTD11能夠阻滯宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞周期,進(jìn)而抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖。分析數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),KCTD11的表達(dá)與包含原癌基因Myc在內(nèi)的多種細(xì)胞周期蛋白呈正相關(guān),同時(shí)Western blot及RT-qPCR 結(jié)果表明,下調(diào)KCTD11 會(huì)導(dǎo)致Myc、CDK2、CDK4、CDK6、CCND3 及CCNE2等多個(gè)基因的mRNA 及蛋白表達(dá)顯著下調(diào)。

Myc作為目前研究最為廣泛的原癌基因之一,參與腫瘤細(xì)胞的增殖、代謝重編程、遷移和侵襲等多種生理過(guò)程,與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[11-14]。作為轉(zhuǎn)錄因子,其能夠直接轉(zhuǎn)錄激活多種細(xì)胞周期蛋白的表達(dá),如CDK2、CDK4、CDK6 及CCND3 等[15-17]。本研究發(fā)現(xiàn),敲低KCTD11,會(huì)抑制Myc及多個(gè)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá),且數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)表明KCTD11的表達(dá)與Myc表達(dá)呈正相關(guān)。因此,推測(cè)KCTD11可能通過(guò)調(diào)控Myc的表達(dá),進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)。為驗(yàn)證這一假設(shè),本研究在HeLa細(xì)胞中過(guò)表達(dá)融合Flag標(biāo)簽的KCTD11蛋白,并利用Flag標(biāo)簽抗體進(jìn)行ChIP分析。結(jié)果表明KCTD11 能夠結(jié)合到Myc的啟動(dòng)子上,從而激活Myc的表達(dá)。

綜上所述,本研究表明KCTD11能夠通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活Myc的表達(dá),上調(diào)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá),從而促進(jìn)宮頸癌的進(jìn)展,抑制KCTD11的表達(dá)可作為宮頸癌治療的潛在靶點(diǎn)。