陳文婷,黃麗珊,曾帶娣,陳志萍,吳志喜

南方醫(yī)科大學(xué)附屬東莞醫(yī)院/東莞市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科,廣東東莞 523000

宮頸癌是較常見的婦科癌癥之一。據(jù)統(tǒng)計(jì),全球每年有30多萬人死亡,其中85%以上發(fā)生在發(fā)展中國家,盡管近年來宮頸癌的手術(shù)、化療、放療等治療取得了很大的進(jìn)展,但宮頸癌的臨床療效仍然較差[1]。因此,尋找新的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)對(duì)提高宮頸癌的診斷和治療至關(guān)重要。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是一種轉(zhuǎn)錄本超過200個(gè)核苷酸,沒有蛋白編碼功能的特殊RNA 分子,LncRNA 與多種疾病及腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]。有報(bào)道稱,LncRNA 能夠廣泛參與生物體的各種生理及病理過程,如表觀遺傳學(xué)調(diào)控,以及神經(jīng)系統(tǒng)功能的構(gòu)建等[3]。有研究證實(shí),LncRNA MEG3 具有抗宮頸癌的作用[4];LncRNA PANDAR 表達(dá)上調(diào)預(yù)示宮頸癌預(yù)后不良并促進(jìn)細(xì)胞增殖[5]。LncRNA HOTAIR 是一種保守的LncRNA,其在不同的癌癥中發(fā)揮了重要的生物學(xué)功能。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),LncRNA HOTAIR 可增強(qiáng)雄激素受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄程序,驅(qū)動(dòng)去勢(shì)抗性前列腺癌[6]。LncRNA HOTAIR 增強(qiáng)雌激素受體信號(hào),并在乳腺癌中導(dǎo)致他莫昔芬耐藥[7]。然而,LncRNA HOTAIR在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)和生物學(xué)功能尚不清楚。本研究通過分析LncRNA HOTAIR 在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)模式,研究其生物學(xué)功能,探討宮頸癌的發(fā)病機(jī)制,為該病的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 宮頸癌細(xì)胞(Hela細(xì)胞)和人永生化宮頸上皮細(xì)胞(H8 細(xì)胞)購自上海富衡生物科技有限公司。宮頸癌組織和癌旁正常組織(各53例)均來自本院2020年2—12月確診的患者,經(jīng)過患者、家屬同意及倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后,進(jìn)行采集和保存。DMEM 培養(yǎng)基購自北京索萊寶科技有限公司。PrimeScriptTMⅣ1st Strand cDNA Synthesis Mix、SYBR Premix Ex Taq試劑盒購自武漢賽培生物科技有限公司。雙熒光素酶活性檢測試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司。HOTAIR 小干擾RNA(siRNA)、miR-20a-5p inhibitor、miR-20a-5p mimics、KIF26B siRNA 等質(zhì)粒由Genepharma公司合成。Turbofect購自美國Invitrogen公司。點(diǎn)突變?cè)噭┖匈徸蕴旄萍?北京)有限公司。Bax、Bcl-2 多克隆抗體購自美國圣克魯斯公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Hela細(xì)胞和H8 細(xì)胞在添加含10%胎牛血清和1%抗菌藥物/抗真菌溶液中培養(yǎng),放置于37 ℃,5% CO2濕潤培養(yǎng)箱中,待達(dá)到90%濃度后收集細(xì)胞,用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 用指數(shù)期Hela細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前,將細(xì)胞接種于12孔板,采用2 mL 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,直至90%的融合。用Turbofect試劑將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到Hela細(xì)胞系中,并按說明用Opti-MEM無血清培養(yǎng)基培養(yǎng),收集培養(yǎng)后細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。培養(yǎng)的Hela 細(xì)胞分為以下轉(zhuǎn)染組:(1)siRNA NC組、HOTAIR siRNA 組、KIF26B siRNA 組;(2)inhibitor NC 組、miR-20a-5p inhibitor組;(3)pcDNA-3.1(+)+mimics NC組、pcDNA-HOTAIR+mimics NC 組、pcDNA-3.1(+)+miR-20a-5p mimics 組、pcDNA-HOTAIR+miR-20a-5p mimics組;(4)HOTAIR wt+mimics NC 組、HOTAIR wt+miR-20a-5p mimics組、HOTAIR mut+mimics NC 組、HOTAIR mut+miR-20a-5p mimics 組;(5)KIF26B wt+mimics NC組、KIF26B wt+miR-20a-5p mimics組、KIF26B mut+mimics NC 組、KIF26B mut+miR-20a-5p mimics組;(6)siRNA NC+inhibitor NC組、HOTAIR siRNA+inhibitor NC組、siRNA NC+miR-20a-5p inhibitor 組、HOTAIR siRNA+miR-20a-5p inhibitor組。(1)組、(2)組、(6)組轉(zhuǎn)染組細(xì)胞用于實(shí)時(shí)定量PCR 檢測;(1)組、(2)組、(3)組轉(zhuǎn)染組細(xì)胞用于細(xì)胞活力、凋亡率和Western blot檢測;(4)組、(5)組轉(zhuǎn)染組細(xì)胞用于雙熒光素酶報(bào)告基因活性檢測。

1.2.3 細(xì)胞活力測定 將各組細(xì)胞按照一定的密度比例分別接種于96孔板,培養(yǎng)48 h后,每孔加入20 μL MTT 溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄上清液后,再向孔內(nèi)加入DMSO 150 μL,震蕩10 min,發(fā)現(xiàn)結(jié)晶充分溶解后,用酶標(biāo)儀測定波長 570 nm 處的吸光度(A)值,檢查細(xì)胞的存活率。

1.2.4 雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn) 利用軟件預(yù)測LncRNA HOTAIR 及miR-20a-5p的結(jié)合點(diǎn),將HOTAIR 結(jié)合位點(diǎn)的野生序列(LncRNA HOTAIR wt)和突變序列(LncRNA HOTAIR mut)構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告載體,并分別與miR-20a-5p mimics、mimics NC共轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞;再將KIF26B結(jié)合位點(diǎn)的野生序列(KIF26B wt)和突變序列(KIF26B mut)分別與miR-20a-5p mimics、mimics NC共轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞;48 h后,檢測細(xì)胞中熒光素酶活性。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR (RT-qPCR) 收集對(duì)數(shù)期的Hela細(xì)胞和組織,總RNA 從細(xì)胞和組織中提取(Trizol法),并檢查RNA 質(zhì)量和水平(紫外分光光度法),按照制造商的說明,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,轉(zhuǎn)化為cDNA,設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔,重復(fù)3 次,內(nèi)參為GAPDH,采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。試驗(yàn)所用的引物見表1。

表1 引物序列

1.2.6 Western blot 轉(zhuǎn)染后,用RIPA 裂解液裂解各組細(xì)胞,提取細(xì)胞蛋白,并測定所提取的蛋白水平。讓蛋白變性成蛋白凝膠后進(jìn)行電泳試驗(yàn),再將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF 膜上,利用TBST(含5%脫脂奶粉)在4 ℃下孵育12 h,在PVDF 膜上加入一抗,孵育2 h,再在PVDF膜上加入二抗,孵育1 h。采用TBST 清洗PVDF膜3次,滴入ECL 反應(yīng)液進(jìn)行ECL 顯影,進(jìn)行蛋白灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以表示,各組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA HOTAIR siRNA 抑制Hela細(xì)胞與H8細(xì)胞的作用 RT-qPCR 結(jié)果顯示,Hela細(xì)胞中的LncRNA HOTAIR 表達(dá)量(1.89±0.07)相比H8細(xì)胞(0.83±0.08)明顯上調(diào)(P<0.01),宮頸癌組織中的LncRNA HOTAIR 表達(dá)量(2.37±0.42)相比癌旁正常組織(1.15±0.11)明顯上調(diào)(P<0.01)。LncRNA HOTAIR siRNA 轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后HOTAIR表達(dá)量(0.35±0.06)顯著低于siRNA NC組(1.05±0.08),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。由圖1可知,LncRNA HOTAIR siRNA 轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后顯著下調(diào)了細(xì)胞增殖能力(P<0.05)。HOTAIR siRNA 組細(xì)胞凋亡率(9.73%±0.71%)明顯高于siRNA NC組(4.25%±0.12%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);HOTAIR siRNA 組Bax和E-cadherin表達(dá)明顯上升(P<0.01),Bcl-2 和N-cadherin 表達(dá)量明顯下降(P<0.01)。見圖1。

圖1 LncRNA HOTAIR siRNA 對(duì)Hela細(xì)胞的作用

2.2 LncRNA HOTAIR 與miR-20a-5p的關(guān)系HOTAIR 和miR-20a-5p之間具有結(jié)合位點(diǎn),當(dāng)質(zhì)粒攜帶LncRNA HOTAIR wt+miR-20a-5p mimics時(shí),熒光素酶活性顯著低于LncRNA HOTAIR wt+mimics NC(P<0.01),當(dāng)質(zhì)粒攜帶LncRNA HOTAIR mut+miR-20a-5p mimics時(shí),熒光素酶活性無變化(P>0.05)。見圖2。

圖2 LncRNA HOTAIR 與miR-20a-5p之間的靶向關(guān)系

2.3 miR-20a-5p inhibitor對(duì)Hela細(xì)胞的作用 分析RT-qPCR 結(jié)果可知,Hela 細(xì)胞中的miR-20a-5p表達(dá)量(0.35±0.09)相比H8細(xì)胞(1.06±0.10)明顯下調(diào)(P<0.01),宮頸癌組織中的miR-20a-5p表達(dá)量(0.47±0.04)相比癌旁正常組織(1.16±0.11)明顯下調(diào)(P<0.01)。miR-20a-5p inhibitor轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后miR-20a-5p表達(dá)量(0.19±0.04)顯著低于inhibitor NC組(0.87±0.13),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。同時(shí),miR-20a-5p inhibitor轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后顯著上調(diào)了細(xì)胞增殖能力(P<0.05)。miR-20a-5p inhibitor組細(xì)胞凋亡率(2.86%±0.24%)明顯低于inhibitor NC 組(5.82%±0.49%)(P<0.01),miR-20a-5p inhibitor組Bax和E-cadherin表達(dá)量明顯下降(P<0.01),Bcl-2 和N-cadherin 表達(dá)量明顯上升(P<0.01)。見圖3。

圖3 miR-20a-5p inhibitor對(duì)Hela細(xì)胞的作用

2.4 LncRNA HOTAIR 通 過miR-20a-5p 對(duì)Hela細(xì)胞的調(diào)控作用 與pcDNA-3.1(+)+mimics NC組相比,pcDNA-HOTAIR+mimics NC組Hela細(xì)胞增殖能力明顯升高(P<0.05),細(xì)胞凋亡率明顯降低(1.74%±0.11%),Bcl-2 和N-cadherin蛋白表達(dá)量明顯上升(P<0.01),Bax和E-cadherin蛋白表達(dá)量明顯下降(P<0.01),pcDNA-3.1(+)+miR-20a-5p mimics組Hela細(xì)胞增殖能力明顯降低(P<0.01),細(xì)胞凋亡率明顯上升(12.72%±1.46%),Bcl-2和Ncadherin蛋白表達(dá)量明顯降低(P<0.01),Bax和Ecadherin蛋白表達(dá)量明顯上升(P<0.01);與pcDNA-3.1(+)+miR-20a-5p mimics組相比,pcDNAHOTAIR+miR-20a-5p mimics組Hela細(xì)胞增殖能力明顯升高(P<0.01),細(xì)胞凋亡率明顯降低(5.27%±0.31%),Bcl-2 和N-cadherin 蛋白表達(dá)量明顯上升(P<0.01),Bax和E-cadherin蛋白表達(dá)量明顯下降(P<0.01)。見圖4。

圖4 LncRNA HOTAIR 通過miR-20a-5p對(duì)Hela細(xì)胞的作用

2.5 miR-20a-5p與KIF26B 之間的關(guān)系 miR-20a-5p與KIF26B 之間具有結(jié)合位點(diǎn),當(dāng)質(zhì)粒攜帶與KIF26B wt+miR-20a-5p mimics時(shí),熒光素酶活性顯著低于與KIF26B wt+mimics NC 組(P<0.01),當(dāng)質(zhì)粒攜帶KIF26B mut+miR-20a-5p mimics時(shí),熒光素酶活性無變化(P>0.05)。見圖5。

圖5 miR-20a-5p與KIF26B之間的關(guān)系

2.6 KIF26B 對(duì)Hela細(xì)胞的作用 分析RT-qPCR結(jié)果可知,Hela 細(xì)胞中的KIF26B 表達(dá)量(2.35±0.12)相比H8 細(xì)胞(1.08±0.11)明顯上調(diào)(P<0.01),宮頸癌組織中的KIF26B表達(dá)量(2.57±0.13)相比癌旁正常組織(1.15±0.08)明顯上調(diào)(P<0.01)。KIF26B siRNA 轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后KIF26B表達(dá)量(0.49±0.06)顯著低于siRNA NC 組(0.94±0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。KIF26B siRNA 轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后顯著下調(diào)了細(xì)胞增殖能力(P<0.05)。KIF26B siRNA 組細(xì)胞凋亡率(7.26%±0.61%)明顯高于siRNA NC 組(4.12%±0.13%)(P<0.01),KIF26B siRNA 組Bax和E-cadherin表達(dá)明顯上升(P<0.01),Bcl-2 和N-cadherin表達(dá)量明顯下降(P<0.01)。見圖6。

圖6 KIF26B siRNA 對(duì)Hela細(xì)胞的作用

2.7 LncRNA HOTAIR 通過miR-20a-5p對(duì)KIF26B表達(dá)的影響 RT-qPCR 結(jié)果顯示,HOTAIR siRNA+inhibitor NC組KIF26B表達(dá)量明顯低于siRNA NC+inhibitor NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。siRNA NC+miR-20a-5p inhibitor 組KIF26B表達(dá)量明顯高于siRNA NC+inhibitor NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。HOTAIR siRNA+miR-20a-5p inhibitor組KIF26B 表達(dá)量明顯低于siRNA NC+miR-20a-5p inhibitor組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3 討論

LncRNA 可以在不同水平上調(diào)控基因表達(dá),廣泛參與核導(dǎo)入、選擇性剪接和表觀遺傳學(xué)等多種生理過程。這些分子也可以作為結(jié)構(gòu)成分,比如mRNA 衰變的調(diào)節(jié)因子,或者小RNA的前體。此外,越來越多的證據(jù)表明,LncRNA 表達(dá)異?？赡苁菍m頸癌發(fā)生過程中的一個(gè)重要組成部分,例如LncRNA SNHG1可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[8]。另有研究表明,LncRNA RSU1P2作為內(nèi)源競爭RNA(ceRNA)在宮頸癌細(xì)胞中對(duì)抗let-7a,參與腫瘤發(fā)生[9]。研究還發(fā)現(xiàn),LncRNA MEG3具有抗宮頸癌作用[10]。LncRNA SNHG20通過miR-140-5p-ADAM10軸促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖和侵襲[11]。HOTAIR 在2007年被識(shí)別[12]。已有研究表明,HOTAIR 參與了多種癌癥的發(fā)展。如LncRNA HOTAIR 通過下調(diào)SETD2促進(jìn)人肝癌干細(xì)胞惡性生長[13]。另有研究表明,LncRNA HOTAIR 通過COX-2調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖與侵襲[14]。靶向LncRNA HOTAIR 通過調(diào)節(jié)EMT 抑制口腔癌干細(xì)胞的癌干性和轉(zhuǎn)移[15]。盡管HOTAIR 已被證明在胃癌、肝癌、口腔癌的進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用,但有關(guān)調(diào)控宮頸癌發(fā)展的分子機(jī)制的研究較少。本研究檢測了HOTAIR 在宮頸癌發(fā)展中的生物學(xué)功能,結(jié)果表明,過表達(dá)HOTAIR 顯著加快了細(xì)胞增殖和上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT),抑制了細(xì)胞凋亡;而下調(diào)HOTAIR 則抑制了細(xì)胞增殖,減少了細(xì)胞EMT,誘導(dǎo)了更多的細(xì)胞凋亡。由此得出,HOTAIR 可能是宮頸癌的一個(gè)潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

HOTAIR 作為內(nèi)源競爭RNA(ceRNA)在各類腫瘤中可以與不同的微小RNA(miRNA)結(jié)合并發(fā)揮重要的調(diào)控作用。在卵巢癌中,HOTAIR 可以通過競爭結(jié)合miR-148a上調(diào)人類白細(xì)胞抗原-G(HLAG)的表達(dá)促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[16]。在乳腺癌中,HOTAIR 可以通過與miR-20a-5p以及HMGA2形成的ceRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)影響乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展[17]。在肺癌中,LncRNA-HOTAIR 通過上調(diào)miR-613影響非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[18]。據(jù)此推測在宮頸癌中,HOTAIR 是否也通過miRNA 發(fā)揮作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),HOTAIR 與miR-20a-5p之間存在靶向結(jié)合位點(diǎn),HOTAIR 通過miR-20a-5p靶向調(diào)節(jié)宮頸癌進(jìn)展。為了探討miR-20a-5p的下游分子機(jī)制,本研究采用TargetScan軟件進(jìn)一步分析得出miR-20a-5p與KIF26B存在靶向結(jié)合關(guān)系。KIF26B是驅(qū)動(dòng)蛋白超家族的成員之一,在腎臟的發(fā)育過程中起到非常重要的作用[19]。近年來有研究表明,KIF26B的下調(diào)抑制了乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。KIF26B 通過FGF2/ERK 信號(hào)通路促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移。最后,本研究探討了KIF26B 在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)量及發(fā)揮的關(guān)鍵作用,結(jié)果顯示,KIF26B在宮頸癌細(xì)胞中過表達(dá),促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖和EMT,抑制癌細(xì)胞凋亡。

綜上所述,本研究闡明了HOTAIR 通過其直接靶基因miR-20a-5p/KIF26B軸抑制宮頸癌細(xì)胞凋亡,促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖和EMT。研究結(jié)果提示HOTAIR 可能作為一種潛在的生物分子標(biāo)志物在宮頸癌進(jìn)展中發(fā)揮作用。