田海英 ,羅真真 ,汪琳琳 ,張 紅 ,劉慶華△

山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院:1.檢驗(yàn)科;2.血液科,山東泰安 271000

染色體作為人類的遺傳物質(zhì),是導(dǎo)致人類出生缺陷的重要原因之一,且目前尚無有效的治療方法,只能依靠產(chǎn)前診斷達(dá)到預(yù)防染色體疾病的目的[1]。染色體微陣列技術(shù)(CMA)可實(shí)現(xiàn)全基因組水平檢測(cè)染色體不平衡的拷貝數(shù)變異(CNV),尤其是對(duì)于染色體微缺失、微重復(fù)有更高的檢出率,是染色體核型分析的有效補(bǔ)充[2]。已經(jīng)有大量的研究證實(shí),CNV 與許多疾病相關(guān),包括數(shù)百種染色體的微缺失、微重復(fù)綜合征,并且是先天性發(fā)育障礙的主要病因,包括自閉癥[3]、智力障礙[4]、行為異常、肌張力減退等,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,給患者家庭帶來沉重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。CMA 在產(chǎn)前診斷領(lǐng)域應(yīng)用的臨床指征主要有高齡、無創(chuàng)DNA 檢測(cè)(NIPT)高風(fēng)險(xiǎn)、夫妻一方染色體異常、B 超異常、不良孕育史等[5]。本研究分析CMA 在異常臨床表現(xiàn)患者中的檢測(cè)情況,為臨床醫(yī)生提供參考依據(jù),從而降低出生缺陷,提高人口素質(zhì)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2015年2月至2020年12月在泰安地區(qū)部分醫(yī)院產(chǎn)科、生殖醫(yī)學(xué)中心、優(yōu)生優(yōu)育門診就診的287例孕婦為研究對(duì)象,年齡18～45歲,中位年齡31歲。孕婦均已簽署知情同意書。因單純高齡(≥35歲)、高齡合并NIPT 高風(fēng)險(xiǎn)、高齡合并超聲異常以及高齡合并不良孕育史而進(jìn)行羊水穿刺產(chǎn)前診斷的孕婦63例;因NIPT 高風(fēng)險(xiǎn)而進(jìn)行羊水穿刺產(chǎn)前診斷的孕婦110例;因超聲發(fā)現(xiàn)胎兒結(jié)構(gòu)異常而進(jìn)行產(chǎn)前診斷的孕婦47例;因不良孕育史而進(jìn)行產(chǎn)前診斷的孕婦22例;因夫妻一方染色體異常而進(jìn)行羊水穿刺產(chǎn)前診斷的孕婦18例;孕期服藥、促排卵助孕、接觸射線等其他原因進(jìn)行羊水穿刺產(chǎn)前診斷的孕婦18例;因胚胎停育、B超確診異常等原因?qū)е铝鳟a(chǎn)進(jìn)行流產(chǎn)組織CMA 檢測(cè)的孕婦17例。同時(shí)選擇兒科、康復(fù)科及新生兒科就診的早產(chǎn)兒、高危兒、先天畸形及不明原因發(fā)育遲緩患兒共118 例為研究對(duì)象?；純耗挲g4 h至15歲,所有患兒均抽取外周血進(jìn)行CMA 檢測(cè),由其父母或監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。并進(jìn)一步收集25例檢測(cè)到致病位點(diǎn)的患兒父母外周血標(biāo)本,進(jìn)行CMA 檢測(cè),判斷患兒的染色體異常片段是否來源于父母。

1.2 方法 排除介入性穿刺禁忌證后,在超聲引導(dǎo)下進(jìn)行羊膜腔穿刺術(shù)抽取30 mL左右的羊水,取適量用于CMA 檢測(cè)。采集118例患兒的外周血2 mL,枸櫞酸鈉抗凝,應(yīng)用QIAGEN 試劑盒提取基因組DNA。應(yīng)用美國(guó)Affymetrix公司生產(chǎn)的CytoScan-HD(195萬CNV 探針+75萬SNP探針)芯片對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)。取流產(chǎn)組織絨毛或流產(chǎn)組織,檢測(cè)前,流產(chǎn)物DNA 均經(jīng)過與母血DNA的連鎖分析排除母體細(xì)胞污染。

3種標(biāo)本均采用Affymetrix公司配套檢測(cè)試劑盒及優(yōu)化的標(biāo)準(zhǔn)操作流程,使用CytoScanHD/Cyto-Scan750K 進(jìn)行全基因組范圍掃描。具體流程如下:(1)嚴(yán)格按照質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行DNA 提取、酶切、連接、PCR、PCR 產(chǎn)物純化、片段化、標(biāo)記,再以染色體DNA探針實(shí)施全面覆蓋,使之與支持物固定在一起后與標(biāo)記分子進(jìn)行雜交;(2)對(duì)DNA 雜交信號(hào)進(jìn)行監(jiān)測(cè),通過相應(yīng)的信息技術(shù)、CHAS軟件對(duì)收集樣本分子的數(shù)量以及序列信息進(jìn)行檢測(cè);(3)得到的數(shù)據(jù)應(yīng)用軟件Affymetrix Chromosome Analysis Suite Software進(jìn)行分析結(jié)果,最終通過查閱DECIPHER、ISCA、OMIM、NCBI PubMed等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行結(jié)果判讀,評(píng)估染色體是否存在非整倍體異常、整倍體異常、微缺失、雜合性缺失異常等。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理。計(jì)數(shù)資料采用百分?jǐn)?shù)表示。

2 結(jié)果

2.1 CMA 檢出的染色體異常類型分析 287例不同產(chǎn)前診斷指征的標(biāo)本包括270例羊水穿刺標(biāo)本和17例流產(chǎn)組織標(biāo)本,CMA 共檢出73 例明確致病的病例,包括64例羊水穿刺標(biāo)本和9例流產(chǎn)組織標(biāo)本;其中常染色體數(shù)目異常病例18例,常染色體致病性片段異常病例14例;性染色體數(shù)目異常病例29例,性染色體致病性片段異常病例11例;三倍體1例。在致病性片段異常病例中,小片段異常(1～10 Mb)病例12例,微小片段(<1 Mb)2 例,占比為19.2%(14/73),見表1。25例染色體異常但意義不明確的病例(VOUS),所占比例為8.71%(25/287),包括20例羊水穿刺標(biāo)本和5例流產(chǎn)組織標(biāo)本。

表1 CMA 檢出的染色體異常類型分析(n=73)

2.2 CMA 在不同產(chǎn)前診斷指征中檢出確診病例的分析 根據(jù)羊水穿刺指征可以分為高齡、NIPT 高風(fēng)險(xiǎn)、夫妻一方染色體異常、B 超異常、不良孕育史、血清學(xué)篩查風(fēng)險(xiǎn)、高齡合并NIPT 高風(fēng)險(xiǎn)、高齡合并不良孕史和其他(包括孕期用藥、接觸射線等)等。經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),CMA 檢出確診病例最多的產(chǎn)前指征為NIPT高風(fēng)險(xiǎn),共檢出異常病例45例,檢出率為40.91%;其次為高齡合并NIPT 高風(fēng)險(xiǎn),共檢出確診病例10例,檢出率為76.92%。見表2。

表2 CMA 在不同產(chǎn)前診斷指征中檢出確診病例的分析

2.3 CMA 對(duì)不同類型CNV 患兒檢測(cè)能力 對(duì)118例患兒進(jìn)行CMA 檢測(cè),明確致病的病例有58例,檢出率為49.15%;VOUS 共8 例,檢出率為6.78%。所有陽(yáng)性標(biāo)本檢測(cè)的CNV 類型分為染色體缺失(≥50 Kb)、染色體重復(fù)(≥10 Kb)、單親二倍體(包括印跡染色體:染色體末端純合片段>5 Mb或染色體中間純合片段>15 Mb;非印跡染色體:染色體末端純合片段>10 Mb或染色體中間純合片段>20 Mb)、染色體缺失合并重復(fù)、非整倍體和嵌合體6類,見表3。在檢測(cè)出染色體的片段中重復(fù)(≥10 Kb)的病例為18例,異常片段(1～10 Mb)的病例有30例,小片段(≤1 Mb)的病例有10例,檢出率為17.2%。

表3 CMA 檢測(cè)58例明確致病病例CNV 類型

2.4 118例患兒的臨床表型及CMA 檢測(cè)情況 按照臨床表型分類進(jìn)行陽(yáng)性率的分析,結(jié)果顯示,多表型患兒陽(yáng)性率要高于單一表型患兒的陽(yáng)性率,見表4。

表4 118例患兒的臨床表型及CMA 檢測(cè)結(jié)果

2.5 CMA 對(duì)25例染色體異常標(biāo)本的遺傳方式的檢測(cè)情況 有25例檢測(cè)到致病位點(diǎn)的患兒父母,通過采集患兒父母外周血標(biāo)本進(jìn)行CMA 檢測(cè),其中8例與患兒在相同區(qū)域發(fā)現(xiàn)染色體異常,為其再次生育提供了遺傳風(fēng)險(xiǎn)咨詢,以避免再次生育類似的患兒。有2例因CMA 不能檢測(cè)平衡易位,故建議應(yīng)用FISH或高分辨率染色體核型分析來確認(rèn)患兒是否遺傳自父母。見表5。

表5 25例染色體異常標(biāo)本的遺傳方式分類

3 討論

在產(chǎn)前診斷和產(chǎn)后遺傳病的檢測(cè)中,CMA 具有分辨率較高的優(yōu)勢(shì),而且相比于傳統(tǒng)的染色體核型分析技術(shù),優(yōu)化了檢測(cè)流程,不需要費(fèi)時(shí)費(fèi)力培養(yǎng)細(xì)胞,檢測(cè)出微小片段的缺失和重復(fù)的概率較高[6]。然而,CMA 因無法檢測(cè)出平衡性染色體重排,如易位等、倒位等具有一定限制[7],從而無法完全替代傳統(tǒng)的染色體核型分析[8]。染色體異常不僅有數(shù)目的異常還有結(jié)構(gòu)的異常,CMA 可檢測(cè)出1～10 Mb的小片段以及小于1 Mb的微小片段CNV[9],是核型分析的有效補(bǔ)充,既可以提高染色體異常的檢出率,避免缺陷兒的出生,又可以對(duì)再次生育進(jìn)行遺傳風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

本研究結(jié)果顯示,CMA 在羊水穿刺標(biāo)本、流產(chǎn)組織標(biāo)本以及外周血標(biāo)本中,片段≤10 Mb的檢出率較高,更能檢測(cè)出微小片段的缺失和重復(fù)。本研究納入的NIPT高風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)本數(shù)量占比最高,達(dá)到38.3%(110/287),且CMA檢測(cè)出的確診病例達(dá)到40.91%,尤其是高齡合并NIPT 高風(fēng)險(xiǎn)的檢出率達(dá)到76.92%;其他臨床指征中B超異常的確診病例檢出率為19.15%,對(duì)于發(fā)現(xiàn)異常胎兒或于孕期發(fā)現(xiàn)并明確診斷NIPT高風(fēng)險(xiǎn)病例具有重要的臨床意義[10]。CNV 在其他研究中又被分為致病性CNV、可能致病性CNV 和VOUS[11]。VOUS是指不能明確該異常CNV的致病性[12],本研究中羊水標(biāo)本VOUS總占比為8.71%,患兒外周血標(biāo)本VOUS總占比為6.78%。國(guó)內(nèi)相關(guān)的臨床數(shù)據(jù)不足,需要更多的積累完善數(shù)據(jù)信息庫(kù)調(diào)整報(bào)告閾值標(biāo)準(zhǔn)等方式來降低VOUS的比例[13]。隨著芯片技術(shù)的不斷發(fā)展,相信會(huì)有更多CNV的臨床意義被明確。

自然流產(chǎn)大多是由于染色體異常所致[14],傳統(tǒng)的檢測(cè)手段如核型分析只能檢測(cè)≥5 Mb的染色體異常,熒光原位雜交雖然不需要培養(yǎng),但僅對(duì)特定的目標(biāo)染色體的數(shù)目異常進(jìn)行檢測(cè),全部的染色體難以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)定位。本研究共收集了17例流產(chǎn)組織標(biāo)本,成功檢測(cè)出明確致病標(biāo)本9例,檢出率達(dá)52.9%,其中染色體數(shù)目異常的有7例,包括1例22-三體、1例18-三體、1例16-三體等以及1例三倍體(69,XXY)。通過對(duì)流產(chǎn)組織標(biāo)本進(jìn)行相關(guān)檢測(cè),有利于尋找流產(chǎn)的原因,進(jìn)而指導(dǎo)下一次的妊娠[15]。

CMA 檢測(cè)適應(yīng)證較為廣泛,發(fā)育遲緩、智力低下,先天性畸形以及兒童孤獨(dú)癥等均適用于CMA 檢測(cè)[16]。隨著CNV的不斷發(fā)展,越來越多的疾病,如癲癇、新生兒腦病、先天性心臟病等也被推薦為CMA檢測(cè)的適應(yīng)證[17-18]。

CMA 發(fā)展較快,它為研究基因復(fù)雜性提供了強(qiáng)有力的手段,結(jié)合傳統(tǒng)的染色體分析技術(shù),在臨床診斷中的作用不斷增強(qiáng),值得推廣應(yīng)用。