焦 娟 ,姜海明 ,李姍珊 ,張立新 ,劉 杰△

1.中國人民解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心檢驗科,北京 100700;2.濱州醫(yī)學(xué)院煙臺附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,山東煙臺 264100

冠狀病毒是一類RNA 病毒,通過人的呼吸道或接觸傳播,感染該病毒后常見臨床表現(xiàn)有發(fā)熱,以及咳嗽、氣促和呼吸困難等呼吸道癥狀,嚴重者可導(dǎo)致肺炎、嚴重急性呼吸綜合征、腎衰竭,甚至死亡。

近期,新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)疫苗相繼問世(滅活疫苗、腺病毒載體疫苗和mRNA 疫苗等),其作用機制即通過激活人自身的免疫系統(tǒng)來對抗病毒,其主要的作用靶點為分布于病毒表面的突刺糖蛋白(Spike蛋白)。部分學(xué)者在SARS-CoV-2致病機制方面的基礎(chǔ)研究也做出了巨大的努力,從最初的SARSCoV-2基因組的測定完成[1],到SARS-CoV-2全病毒三維結(jié)構(gòu)的解析[2],都顯示Spike蛋白是SARS-CoV-2的主要致病因素:Spike蛋白與人體細胞表面血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)的結(jié)合介導(dǎo)了SARS-CoV-2對人體細胞的入侵[3-4]。因此SARS-CoV-2的Spike蛋白已經(jīng)成為人們診斷、治療、預(yù)防SARS-CoV-2感染的主要靶點。本研究擬通過生物信息學(xué)軟件,通過橫向比較和分析SARS-CoV-2的Spike蛋白的二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)和B 細胞表位,探討Spike蛋白潛在的高效免疫表位,為SARS-CoV-2檢測試劑盒、疫苗制備、治療藥物的研發(fā)提供可靠的生物學(xué)信息和實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蛋白結(jié)構(gòu)和序列的選擇 根據(jù)已公布的蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/),比對Spike蛋白相關(guān)的結(jié)構(gòu)信息,下載對應(yīng)的結(jié)構(gòu)信息文件(pdb文件),其登錄號為6XR8/6XRA(SARS-CoV-2),5X58(SARS-CoV),5X59(MERS);同時,下載相對應(yīng)的氨基酸序列。結(jié)合下載的序列,比對GenBank數(shù)據(jù)庫,分別下載各蛋白的完整蛋白序列,其登錄號分別為YP_009724390,P59594.1,AGN70929.1。

1.2 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 抗原免疫表位主要位于蛋白質(zhì)表面,具有較強的親水性,含有或鄰近柔性區(qū)域,易于形成典型的二級結(jié)構(gòu)等。因此分析目的蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu),對了解其免疫表位分布具有重要的參考作用。本研究應(yīng)用PHD(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl? page=/NPSA/npsa_phd.html)和Jpred4(http://www.compbio.dundee.ac.uk/jpred/)等在線軟件分別預(yù)測目的蛋白質(zhì)的α螺旋、β折疊、轉(zhuǎn)角以及卷曲等二級結(jié)構(gòu)的組成。

1.3 B細胞表位預(yù)測 根據(jù)目的蛋白的蛋白序列應(yīng)用在線軟件Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0(http://tools.iedb.org/bcell/)分別預(yù)測目的蛋白的B細胞表位,該軟件運用隨機森林算法對目的蛋白的表位和非表位氨基酸進行預(yù)測,同時利用自身表位數(shù)據(jù)庫對預(yù)測序列進行多重優(yōu)化[5]。本研究同時比對目的蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù),進一步篩選優(yōu)勢抗原表位區(qū)段,得出Spike蛋白的優(yōu)勢B細胞免疫表位。

2 結(jié)果

2.1 氨基酸序列分析 Spike蛋白的結(jié)構(gòu)信息非常豐富:目前在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中,Spike蛋白的高分辨結(jié)構(gòu)有上百個,均為冷凍電子顯微解析的結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)信息顯示,Spike蛋白有多種構(gòu)象形式:侵染細胞前狀態(tài)、侵染細胞后狀態(tài)和與中和抗體結(jié)合狀態(tài)等,這些狀態(tài)為分析Spike蛋白的免疫表位提供了豐富的分析線索。本文以Spike蛋白三維結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)模型,以多種預(yù)測軟件為輔助,分析和研究嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)、SARS-CoV-2 和中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)共3種冠狀病毒Spike蛋白的B細胞表位信息。首先在GeneBank數(shù)據(jù)庫中下載相關(guān)蛋白的一級序列信息:SARS-CoV的Spike蛋白序列(YP_009724390)與SARS-CoV-2的Spike 蛋白(P59594.1)具有76% 同一性,與MERS-CoV的Spike 蛋白具有35%的同一性(AGN70929.1)。

2.2 Spike蛋白二級結(jié)構(gòu)分析 運用PHD 和Jpred4兩種在線軟件,對SARS-CoV、SARS-CoV-2、MERSCoV的Spike蛋白二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測。SARS-CoV的Spike 蛋白α 螺旋主要分布于5～11、51～56、409～419、729～769、797～805、849～861、871～1 018、1 129～1 140、1 151～1 184、1 195～1 213等肽段。β折疊分布于146～166、173～178、181～190、198～230、241～258、277～279、309～377、421～428、442～450、465～484、552～582、584～601、610～646、693～724、1 032～1 058、1 075～1 087、1 100～1 115、1 213～1 219、1 247～1 255等肽段。自由卷曲位于α螺旋和β折疊之間。見表1。

表1 3種病毒Spike蛋白二級結(jié)構(gòu)組成(%)

SARS-CoV-2的Spike蛋白α螺旋主要分布于361～371、747～788、815～823、867～879、887～1 035、1 147～1 159、1 175～1 123、1 134～1 151等肽段。β折疊分布于2～8、36～50、61～77、90～108、116～145、167～177、190～206、262～288、298～329、376～381、395～403、418～425、432～437、450～455、507～517、538～577、583～588、595～600、608～613、589～695、711～729、1 048～1 075、1 093～1 105、1 120～1 132、1 151～1 156、1 190～1 195 等肽段。自由卷曲位于α螺旋和β折疊之間。

MERS-CoV的Spike 蛋白α 螺旋主要分布于107～112、225～231、277～281、304～318、405～418、430～436、806～837、846～856、887～895、908～912、941～954、963～1 110、1 230～1 241、1 262～1 285、1 297～1 316等肽段。β折疊分布于2～10、30～35、64～70、84～89、98～104、116～123、129～131、162～172、179～188、202～206、236～242、262～271、287～296、321～337、360～377、399～405、440～449、464～471、478～483、567～576、603～664、670～676、713～718、754～765、779～804、1 121～1 127、1 134～1 151、1 202～1 213、1 317～1 320等肽段。自由卷曲位于α螺旋和β折疊之間。

2.3 B細胞表位預(yù)測 運用Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0在線軟件,對上述病毒Spike蛋白B細胞表位完成預(yù)測,閾值設(shè)定為0.5。SARS-CoV的Spike蛋白B 細胞表位區(qū)段分布于16～38、60～84、134～148、173～181、203～212、236～249、317～351、355～412、427～473、505～519、602～630、642～651、663～689、768～796、811～827、1 089～1 100、1 115～1 156、1 234～1 248 等肽段。SARS-CoV-2的Spike蛋白B細胞表位區(qū)段分布于13～37、59～81、138～156、177～189、206～221、250～260、306～322、370～393、409～425、440～450、458～501、516～536、617～632、634～644、656～666、672～690、695～710、786～800、806～816、828～842、1 108～1 118、1 133～1 172、1 198～1 206、1 252～1 263、1 275～1 306等肽段。MERS-CoV的Spike蛋白B 細胞表位區(qū)段分布于16～38、60～84、134～148、173～181、203～212、236～249、317～351、355～412、427～473、505～519、602～630、642～651、663～689、768～796、811～827、1 089～1 100、1 115～1 156、1 234～1 248等肽段。

2.4 結(jié)合蛋白三維結(jié)構(gòu)的B細胞表位區(qū)段的篩選以上的表位信息結(jié)果均源于軟件的預(yù)測,這些結(jié)果很可能與實際情況差異較大,因此本研究將以上B細胞表位區(qū)段預(yù)測信息,在高分辨的蛋白三維結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上,同時結(jié)合B細胞抗原表位結(jié)構(gòu)和生化特點,進一步人工篩選SARS-CoV(5X59)[6]、SARSCoV-2(6XR8)[3]、MERS-CoV(5X58)[6]Spike蛋白的B細胞表位區(qū)段,見表2～4。

表2 SARS-CoV(5X59)Spike蛋白的B細胞表位區(qū)段

表3 SARS-CoV-2(6XR8)Spike蛋白的B細胞表位區(qū)段

續(xù)表3 SARS-CoV-2(6XR8)Spike蛋白的B細胞表位區(qū)段

表4 MERS-CoV(5X58)Spike蛋白的B細胞表位區(qū)段

由于蛋白三維結(jié)構(gòu)信息來自于蛋白晶體衍射數(shù)據(jù),因此存在結(jié)構(gòu)密度信息的部分缺失,另一方面,結(jié)構(gòu)密度信息的缺失一般意味著蛋白這部分區(qū)域處于無序排列的狀態(tài),即在周邊的環(huán)境中可以自由擺動或存在結(jié)構(gòu)變化,說明該區(qū)域親水性較強并位于蛋白三維結(jié)構(gòu)的表面。

將B 細胞表位信息,SARS-CoV、SARS-CoV-2、MERS-CoV 3種病毒Spike蛋白的二級結(jié)構(gòu)信息和三級結(jié)構(gòu)信息整合在一起篩選,可提高數(shù)據(jù)分析的可信性。蛋白抗原表位區(qū)段基本分布于蛋白三維結(jié)構(gòu)的表面,與二級結(jié)構(gòu)有所差別。SARS-CoV Spike蛋白抗原表位區(qū)段中卷曲-螺旋占17.0%,卷曲-延伸占50.0%,卷曲占33.0%。SARS-CoV-2 Spike蛋白抗原表位區(qū)段中卷曲-螺旋占22.0%,卷曲-延伸占59.0%,卷曲占19.0%。MERS-CoV Spike蛋白抗原表位區(qū)段中卷曲-螺旋占25%,卷曲-延伸占37.5%,卷曲占37.5%。

綜合分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),具有優(yōu)勢B細胞表位區(qū)段中存在一定二級結(jié)構(gòu)和一定柔韌性結(jié)構(gòu)組合的占比較高,比如β折疊。這一特點完全符合抗原蛋白B細胞表位的基本特征。

3 討論

Spike蛋白是SARS-CoV、SARS-CoV-2、MERSCoV 等冠狀病毒關(guān)鍵性致病因子。Spike蛋白的結(jié)構(gòu)已經(jīng)較為清晰,其致病的分子機制已較為明了[3-4]:首先,Spike蛋白的受體結(jié)合域(RBD)向外伸展與人體細胞表面的ACE2受體結(jié)合;其次,RBD 與ACE2的結(jié)合啟動了Spike蛋白自身在S位點的剪切作用,使Spike蛋白發(fā)生“脫冠”變化;最后,“脫冠”的Spike蛋白HR 結(jié)構(gòu)域得以暴露出來,在HR 結(jié)構(gòu)域輔助下,病毒完成和人體細胞的融合和遺傳物質(zhì)的注入過程。因此,Spike蛋白RBD 和ACE2識別和結(jié)合,是冠狀病毒侵染細胞的最關(guān)鍵環(huán)節(jié),從目前已有的 Spike蛋白-中和抗體的三維結(jié)構(gòu)中,也可以證明這一結(jié)論。

在蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中,SARS-CoV、SARS-CoV-2、MERS-CoV 等病毒的 Spike蛋白和其中和抗體的結(jié)構(gòu)較多,如6NB6/7(SARS-CoV)、6WPT(SARSCoV-2)、7K4N (SARS-CoV-2)、6NB3/4(MERSCoV)等[7-9]。對這些復(fù)合體的結(jié)構(gòu)分析后發(fā)現(xiàn),中和抗體與 Spike蛋白表面結(jié)合位點主要集中于RBD 結(jié)構(gòu)域和CTD 結(jié)構(gòu)域。同時本研究發(fā)現(xiàn)ACE2 與Spike蛋白結(jié)合位點也位于RBD 結(jié)構(gòu),且與中和抗體的結(jié)合位點重疊,這進一步證明了中和抗體在抗病毒時的作用機制。以SARS-CoV-2 Spike蛋白為例,在7KNB結(jié)構(gòu)中,ACE2 結(jié)合于449～502aa[10];7K8W結(jié)構(gòu)中,中和抗體結(jié)合于444～501aa[11];本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相似,表明本研究分析結(jié)果具有一定的可靠性和前瞻性。

本研究同時發(fā)現(xiàn) Spike蛋白RBD 和CTD 結(jié)構(gòu)中,含有多個優(yōu)勢B 細胞表面抗原表位的多肽區(qū)段,這為檢測試劑、抗體藥物的開發(fā)等提供了較好的作用靶點。然而,冠狀病毒的RBD 結(jié)構(gòu)域、三維結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜,主要由內(nèi)部的β折疊和外圍的無規(guī)則卷曲所構(gòu)成,說明RBD 結(jié)構(gòu)域外圍表面結(jié)構(gòu)十分靈活,RBD 在與ACE2或中和抗體結(jié)合時,可能存在局部的構(gòu)象重建;同時在病毒侵染過程中RBD 本身還會存在巨大的結(jié)構(gòu)變化,使基礎(chǔ)和臨床研究難度大大增加,因此更多的結(jié)構(gòu)和B 細胞表面抗原表位信息將提供更多的研究思路和實驗基礎(chǔ)。