徐 超,徐 珊,竇 燕,閆玲新,閆 茹

河北省邯鄲市中心醫(yī)院消化科,河北邯鄲 056001

食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)是食管癌最常見的組織學(xué)類型,是中國(guó)第四大惡性腫瘤,多數(shù)患者確診時(shí)已處于晚期,腫瘤惡性程度高,病死率高[1-2]。惡性腫瘤的發(fā)生與免疫失衡存在密切關(guān)系,免疫功能低下可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視和免疫細(xì)胞殺傷作用,引起腫瘤細(xì)胞惡性增殖、侵襲或轉(zhuǎn)移[3]。微小RNA(miR)是一種小型非編碼調(diào)控RNA 分子,轉(zhuǎn)錄后調(diào)控宿主基因表達(dá),參與各種生物過程,包括腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移以及腫瘤免疫調(diào)節(jié)[4]。miR-1246 是一種由突變p53衍生的外泌體,可介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之間的通信傳導(dǎo),對(duì)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞進(jìn)行免疫調(diào)節(jié),發(fā)揮免疫抑制作用和癌基因作用[5]。miR-146a是免疫反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控因子,可調(diào)節(jié)T 淋巴細(xì)胞增殖及其細(xì)胞因子表達(dá),參與癌癥發(fā)展[6]。miR-1246、miR-146a是否參與ESCC腫瘤免疫調(diào)節(jié)尚不清楚,且miR-1246、miR-146a與ESCC患者預(yù)后關(guān)系的報(bào)道并不多見。本研究以此為切入點(diǎn),擬探討血清miR-1246、miR-146a與ESCC 患者細(xì)胞免疫功能和預(yù)后的關(guān)系及其預(yù)測(cè)ESCC 患者預(yù)后的價(jià)值,旨在為臨床ESCC的個(gè)性化診療和預(yù)后評(píng)估提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017年2月至2019年1月本院收治的91例ESCC患者為ESCC組,其中男47例,女44例;年齡53～71歲,平均(66.26±4.12)歲;腫瘤最大徑2～7 cm,平均(4.62±1.36)cm;腫瘤部位:頸段及胸上段42例,胸中段49例;分化程度:低中分化53例,高分化38例;TNM 分期:Ⅰ～Ⅱ期57例,Ⅲ期34例。TNM 分期參照文獻(xiàn)[7]。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)均進(jìn)行胸腔鏡食管癌切除術(shù)和淋巴結(jié)清掃術(shù),術(shù)后組織病理學(xué)檢查證實(shí)為ESCC;(2)采集血標(biāo)本前未接受任何形式的治療;(3)臨床資料完整;(4)患者均知情且簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并其他部位惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病;(2)壞死癌灶取材標(biāo)本;(3)合并免疫系統(tǒng)疾病;(4)隨訪失訪者。另選擇同期于本院進(jìn)行健康體檢的90例體檢健康者為對(duì)照組,男49例,女41例;年齡52～71歲,平均(65.97±4.13)歲。兩組年齡、性別比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑和儀器 TRIzol試劑盒(美國(guó)Invitrogen 公司),M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(Epicentre 公司),CFX96 實(shí)時(shí)熒光PCR 儀(美國(guó)Bio-Rad 公司),RPM1-1640培養(yǎng)液(杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司),CD4單克隆抗體、CD8單克隆抗體(武漢艾美捷科技有限公司),羊抗兔IgG Alexa Fluor 488b 標(biāo)記(上海富衡生物科技有限公司),EPICS-XL 流式細(xì)胞儀(美國(guó)COULTER 公司)。

1.3 方法

1.3.1 miR-1246、miR-146a檢測(cè) ESCC 患者確診后未治療前以及對(duì)照組于體檢當(dāng)日采集肘靜脈血3 mL,自然凝固后以3 000 r/min的速度離心10 min后取上清液,加入10 cm2/mL 比例TRIzol法提取總RNA。采用M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。取2 μL cDNA 樣品加入實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)體系,采用RT-qPCR 檢測(cè)miR-1246、miR-146a表達(dá)水平,反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性10 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸10 s,40個(gè)循環(huán)。引物由金唯智生物科技有限公司設(shè)計(jì)和合成,序列如下,miR-1246 上游:5'-CCU GCU CCA AAA AUC CAU U-3';下游:5'-UUG UAC UAC ACA AAA GUA CUG-3'。miR-146a上游:5'-CGG CGG TGA GAA CTG AAT TCC A-3';下游:5'-GTG CAG GGT CCG AGG T-3'。GADPH 上游:5'-TGA CGT GCC GCC TGG AGA AAC-3';下游:5'-CCG GGC ATC GAA GGT GGA AGA G-3'。采用熔解曲線分析法進(jìn)行RT-qPCR 后產(chǎn)物分析,共做3次平行試驗(yàn)。以GADPH 為內(nèi)參,2-ΔΔCt計(jì)算miR-1246、miR-146a在各組相對(duì)表達(dá)量。

1.3.2 細(xì)胞免疫功能檢測(cè) ESCC 患者于確診后未治療前,對(duì)照組于體檢當(dāng)日采集清晨空腹靜脈血3 mL注于抗凝試管,經(jīng)EDTA 抗凝后稀釋,加入100 μL RPM1-1640培養(yǎng)液混勻,置入含5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃溫度下培養(yǎng)5 h。取出后加入CD4-PerCP單克隆抗體、CD8-PerCP單克隆抗體,室溫避光孵育30 min,加入2 mL紅細(xì)胞lysis Buffer混勻后室溫下避光孵育10 min,以3 000 r/min的速度離心5 min,棄上清液,2 mL 磷酸鹽緩沖液洗滌,再次離心洗滌,加入500 μL磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞,制成外周血單個(gè)核細(xì)胞液懸液,密度至1×104個(gè)/毫升。流式細(xì)胞儀檢測(cè)T 淋巴細(xì)胞亞群CD4+、CD8+占比,計(jì)算CD4+/CD8+比值。CD4+/CD8+參考值為1.3～2.0[8],低于參考值下限為CD4+/CD8+降低。

1.4 隨訪 所有患者定期電話或微信隨訪,中位隨訪時(shí)間為24(12～36)個(gè)月,隨訪截止時(shí)間為2020年2月,統(tǒng)計(jì)隨訪期間生存情況。生存時(shí)間定義為確診日期到死亡或隨訪結(jié)束日期。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料經(jīng)K-S檢驗(yàn)符合正態(tài)分布,以表示,兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。采用Pearson 相關(guān)分析 miR-1246、miR-146a 表達(dá)水平與CD4+/CD8+相關(guān)性,Kaplan-Meier法繪制不同miR-1246、miR-146a 表達(dá)水平下ESCC 患者生存曲線,Log-Rank 檢驗(yàn)生存率的差異。受試者工作特征(ROC)曲線分析miR-1246、miR-146a預(yù)測(cè)ESCC 患者預(yù)后的價(jià)值,預(yù)后不良定義為隨訪期間死亡。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR-1246、miR-146a表達(dá)水平對(duì)比ESCC組血清miR-1246 表達(dá)水平高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),miR-146a表達(dá)水平低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),見表1。

表1 ESCC組與對(duì)照組miR-1246、miR-146a表達(dá)水平差異()

表1 ESCC組與對(duì)照組miR-1246、miR-146a表達(dá)水平差異()

2.2 不同臨床病理特征、細(xì)胞免疫功能ESCC 患者血清miR-1246、miR-146a表達(dá)水平比較 TNM 分期為Ⅲ期、CD4+/CD8+降低患者血清miR-1246表達(dá)水平高于TNM 分期為Ⅰ～Ⅱ期、CD4+/CD8+正?；颊?差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),miR-146a表達(dá)水平低于TNM 分期為Ⅰ～Ⅱ期、CD4+/CD8+正?；颊?差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001);不同年齡、性別、腫瘤最大徑、腫瘤部位、分化程度患者miR-1246、miR-146a表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表2。

表2 不同臨床病理特征、細(xì)胞免疫功能ESCC患者血清miR-1246、miR-146a表達(dá)水平的比較()

表2 不同臨床病理特征、細(xì)胞免疫功能ESCC患者血清miR-1246、miR-146a表達(dá)水平的比較()

2.3 血清miR-1246、miR-146a表達(dá)水平與CD4+/CD8+相關(guān)性分析 miR-1246 表達(dá)水平與CD4+/CD8+呈負(fù)相關(guān)(r=-0.752,P<0.05),miR-146a表達(dá)水平與CD4+/CD8+呈正相關(guān)(r=0.775,P<0.05),miR-1246、miR-146a表達(dá)水平之間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.801,P<0.05)。

2.4 不同miR-1246、miR-146a表達(dá)水平ESCC患者預(yù)后比較 隨訪期間,ESCC 患者中43例(47.25%)存活,48 例(52.75%)死亡。根據(jù)miR-1246、miR-146a表達(dá)水平的均值將患者分為高miR-1246表達(dá)組(miR-1246≥1.52,47例)、高miR-146a表達(dá)組(miR-146a≥0.39,42 例)、低miR-1246 表達(dá)組(miR-1246<1.52,44 例)、低 miR-146a 表達(dá)組(miR-146a<0.39,49例)。Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示高miR-1246表達(dá)組、低miR-146a表達(dá)組患者生存率分別為31.91%(15/47)、36.73%(18/49),低于低 miR-1246 表達(dá)組、高 miR-146a 表達(dá)組的63.64%(28/44)、59.52%(25/42),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.683、4.384,P=0.002、0.036),見圖1。

圖1 不同miR-1246、miR-146a表達(dá)水平ESCC患者的生存曲線

2.5 miR-1246、miR-146a預(yù)測(cè)ESCC 患者預(yù)后的價(jià)值分析 ROC曲線分析miR-1246、miR-146a單獨(dú)檢測(cè)預(yù)測(cè)ESCC患者預(yù)后的截?cái)嘀禐?.12、0.49,曲線下面積(AUC)分別為0.754、0.713,靈敏度分別為75.00%、72.20%,特異度分別為76.40%、70.40%,約登指數(shù)分別為0.514 0、0.426 0,miR-1246、miR-146a聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)ESCC 患者預(yù)后的AUC 為0.824,靈敏度為81.70%,特異度為80.20%,約登指數(shù)為0.629 0,均高于miR-1246、miR-146a單獨(dú)預(yù)測(cè)。見表3和圖2。

表3 miR-1246、miR-146a單獨(dú)和聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)ESCC患者預(yù)后效能

圖2 miR-1246、miR-146a單獨(dú)和聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)ESCC患者預(yù)后的ROC曲線

3 討論

免疫系統(tǒng)是人體最重要的防御系統(tǒng),在調(diào)節(jié)腫瘤生長(zhǎng)過程中起著重要的作用,如果免疫系統(tǒng)受到抑制,腫瘤細(xì)胞可逃避免疫監(jiān)視,發(fā)生免疫逃逸,導(dǎo)致腫瘤惡性增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[9]。T 淋巴細(xì)胞是免疫細(xì)胞中最重要的組成部分,在維持機(jī)體免疫功能、殺傷腫瘤細(xì)胞方面發(fā)揮重要作用,ESCC 患者T 淋巴細(xì)胞亞群平衡存在異常[10]。miR 是一類非編碼小分子RNA,通過特異性識(shí)別靶mRNA3' 非編碼區(qū)降解靶mRNA、抑制mRNA 翻譯,在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控多種基因表達(dá),參與細(xì)胞生長(zhǎng)分化、免疫調(diào)節(jié)、腫瘤發(fā)生和進(jìn)展等過程[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-1246 在ESCC 血清中表達(dá)上調(diào),TNM 分期為Ⅲ期的患者miR-1246表達(dá)水平高于TNM 分期為Ⅰ～Ⅱ期患者,說明miR-1246 表達(dá)與ESCC患者TNM 分期有關(guān)。丁元杰等[12]篩選ESCC差異表達(dá)miR,發(fā)現(xiàn)miR-1246存在明顯表達(dá)異常,與ESCC發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。另有研究顯示糖原合成酶激酶3β是關(guān)鍵絲/蘇氨酸蛋白激酶,通過作用于Wnt/β-鏈蛋白、磷酸肌醇-3 激酶/蛋白激酶B、Hedgehog信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化、存活和凋亡,miR-1246直接靶向調(diào)控糖原合成酶激酶3β促進(jìn)食管癌轉(zhuǎn)移[13]。本研究中miR-1246在CD4+/CD8+降低患者中表達(dá)水平升高,miR-1246與CD4+/CD8+呈負(fù)相關(guān),說明miR-1246過表達(dá)可抑制T 淋巴細(xì)胞功能,降低抗腫瘤免疫反應(yīng),提示miR-1246可能通過調(diào)控腫瘤免疫,促使腫瘤細(xì)胞逃逸導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展。COOKS等[5]報(bào)道顯示miR-1246作為p53家族的一個(gè)靶點(diǎn),可促使腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞招募外周血單核細(xì)胞,抑制腫瘤免疫微環(huán)境,促使腫瘤進(jìn)展。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-146a表達(dá)缺失與ESCC 惡性侵襲轉(zhuǎn)移行為有關(guān),miR-146a表達(dá)水平與CD4+/CD8+呈正相關(guān),提示miR-146a缺失可能抑制T 淋巴細(xì)胞增殖分化,降低對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力,提高腫瘤進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)。miR-146a是免疫應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)因子,通過抑制輔助性T 細(xì)胞分化所需的轉(zhuǎn)錄激活因子1,抑制干擾素-γ介導(dǎo)的輔助性T 細(xì)胞應(yīng)答,對(duì)輔助性T 細(xì)胞發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用[14],miR-146a還可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖凋亡、新生血管形成,介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與巨噬細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),改變腫瘤微環(huán)境[15-16]。MASTROIANNI等[17]研究結(jié)果顯示miR-146a通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子1/干擾素-γ 軸影響程序性細(xì)胞死亡受體1水平,程序性細(xì)胞死亡受體1是適應(yīng)性和先天免疫應(yīng)答的抑制劑,可誘導(dǎo)腫瘤反應(yīng)性細(xì)胞毒性T 細(xì)胞功能衰竭,參與腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。本研究發(fā)現(xiàn)miR-1246與miR-146a表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān),提示兩者可能在ESCC發(fā)病中發(fā)揮相互抑制作用,破壞腫瘤免疫微環(huán)境,抑制機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng),促使癌癥進(jìn)展。

通過隨訪發(fā)現(xiàn)miR-1246高表達(dá)、miR-146a低表達(dá)與ESCC 患者低生存率有關(guān),miR-1246、miR-146a聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)ESCC 患者預(yù)后具有較高效能,提示miR-1246、miR-146a可能成為ESCC 患者預(yù)后評(píng)估的輔助指標(biāo),二者聯(lián)合檢測(cè)可為ESCC 患者預(yù)后評(píng)估提供更可靠的參考。

綜上所述,miR-1246、miR-146a均參與ESCC 發(fā)病和腫瘤免疫調(diào)節(jié)過程,因此本研究選擇miR-1246、miR-146a兩者指標(biāo)進(jìn)行探討分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-1246與miR-146a可能相互抑制調(diào)控腫瘤免疫反應(yīng)參與ESCC 進(jìn)展和不良預(yù)后。miR-1246、miR-146a聯(lián)合檢測(cè)可作為ESCC患者預(yù)后評(píng)估的輔助手段。