何 雯 ,楊 森 ,王 琦 ,游莉斯

1.四川省成都市第六人民醫(yī)院耳鼻喉科,四川成都 610051;2.四川省遂寧市中心醫(yī)院耳鼻咽喉科,四川遂寧 629000;3.四川省成都市第六人民醫(yī)院檢驗科,四川成都 610051;4.四川省成都市第六人民醫(yī)院腫瘤科,四川成都 610051

鼻咽癌(NPC)是指發(fā)生于鼻咽腔頂部和側(cè)壁的惡性腫瘤,發(fā)病率為耳鼻咽喉惡性腫瘤之首[1]。該病涉及一系列的遺傳變化,如原癌基因的激活和腫瘤抑制基因的失活,這些變化會擾亂體內(nèi)的生理平衡,導(dǎo)致異常的細(xì)胞增殖,從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[2-3]。由于鼻咽癌缺乏個體化的治療方法和治療藥物,目前仍以放療為主[4]。大多數(shù)鼻咽癌病患者發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)處于晚期,治療效果不佳,5年生存率較低[5]。因此研究鼻咽癌惡性發(fā)展的分子機(jī)制,對提高鼻咽癌患者的治療效果和改善預(yù)后具有重要意義。環(huán)狀非編碼RNA 基因PVT1(circPVT1)為一種新的環(huán)狀RNA,在人類癌癥如肺癌和前列腺癌中的表達(dá)高于鄰近的正常組織,已有研究發(fā)現(xiàn)其具有許多與癌癥進(jìn)展相關(guān)的功能,包括細(xì)胞存活和遷移[6-7]。circPVT1可能是腫瘤治療的潛在靶點,然而其在鼻咽癌中的功能與作用機(jī)制報道較少。本研究主要探討circPVT1對鼻咽癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響及作用機(jī)制,旨在為臨床預(yù)防和治療鼻咽癌提供新的思路和方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年1月至2021年1月于成都市第六人民醫(yī)院耳鼻喉科治療的臨床鱗狀細(xì)胞鼻咽癌患者的活檢組織標(biāo)本31例為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)患者活檢前未經(jīng)受過任何治療;(2)活檢組織經(jīng)病理證實為鼻咽癌;(3)患者未患有其他類型的腫瘤。選取慢性鼻竇炎患者活檢組織31例作為對照組。所有患者均簽署知情同意書,本研究由成都市第六人民醫(yī)院批準(zhǔn)審核通過。

1.2 試劑與儀器 鼻咽癌細(xì)胞系HNE1 購于德國DSMZ細(xì)胞庫;二甲基噻唑-二苯基溴化四唑(MTT)購自美國Gibco 公司;DMEM 培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)購自美國HyClone 公司;聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜購自美國Pall Life Sciences公司;Western blot相關(guān)化學(xué)試劑購自上海碧云天生物科技有限公司;增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑購自英國Abcam 公司;兔抗大鼠circPVT1單克隆抗體、小鼠抗大鼠p-AKT單克隆抗體、小鼠抗大鼠p-PI3K 單克隆抗體、兔抗大鼠PTEN 單克隆抗體、兔抗大鼠AKT 單克隆抗體、小鼠抗大鼠PI3K 單克隆抗體、小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體和HRP標(biāo)記的兔抗小鼠IgG 和HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG 購自英國Abcam 公司;Transwell Chamber購自美國Corning 公司;RNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和lipo2000 試劑購自美國Invitrogen公司;circPVT1 mimic和circPVT1 inhibitor由上海吉馬制藥科技有限公司合成;超凈工作臺購自蘇州太素凈化設(shè)備工程有限公司;細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 實時熒光定量PCR(RT-qRCR)檢測circPVT1的表達(dá) 使用TRIzol試劑提取總RNA,并根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行DNA 逆轉(zhuǎn)錄合成。引物由Primer Premier 6.0根據(jù)各基因序列設(shè)計,由上海鷹君生物技術(shù)有限公司合成。反應(yīng)條件如下:95 ℃預(yù)變性60 s,92 ℃變性30 s,58 ℃退火45 s,72 ℃延伸35 s,共35個循環(huán)。甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為參照。根據(jù)熒光定量計算所有樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的起始循環(huán)數(shù)?；跇?biāo)準(zhǔn)CT 值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,然后使用2-ΔΔCt方法進(jìn)行半定量分析。circPVT1引物F:5'-GGT TCC ACC AG CGT TAT TC-3';R:5'-CAA CTT CCT TTG GGT CTC C-3'。內(nèi)參GAPDH 引物F:5'-CCA GGT GGT CTC CTC TGA-3';R:5'-GCT GTA GCC AAA TCG TTG T-3'。試驗重復(fù)3次。

1.3.2 HNE1細(xì)胞培養(yǎng)和分組 將儲存在液氮中的鼻咽癌細(xì)胞系HNE1放置于37 ℃水浴中解凍。細(xì)胞完全解凍后,以1 000 r/min離心3 min,轉(zhuǎn)移到含有新鮮DMEM 培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)皿中,在37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。當(dāng)細(xì)胞融合度為95%左右時,以1×106個/孔接種于6 孔板中。培養(yǎng)的HNE1細(xì)胞隨機(jī)分為3組:陰性對照組、circPVT1過表達(dá)試驗組和circPVT1干擾試驗組。

1.3.3 circPVT1 mimic 和circPVT1 inhibitor 轉(zhuǎn)染 按照上述步驟培養(yǎng)陰性對照組、circPVT1 過表達(dá)試驗組和circPVT1干擾試驗組HNE1細(xì)胞,當(dāng)細(xì)胞接種12 h融合度達(dá)到70%～80%時,將circPVT1 mimic、circPVT1 inhibitor和陰性對照組細(xì)胞分別加入到200 μL無血清的DMEM 培養(yǎng)基中,充分混合,室溫下孵育15 min。lip2000分別與circPVT1 mimics、circPVT1 inhibitor、陰性對照組細(xì)胞稀釋液充分混合,室溫下孵育30 min。PBS沖洗各組細(xì)胞,除去細(xì)胞中的血清,分別加入1.6 mL 無血清DMEM 培養(yǎng)基及各組轉(zhuǎn)染試劑,放置在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6 h后更換一次培養(yǎng)液,并進(jìn)一步繼續(xù)培養(yǎng)48 h。采用RT-qRCR 檢測circPVT1 mimic和circPVT1 inhibitor轉(zhuǎn)染效果。試驗重復(fù)3次。

1.3.4 MTT 法檢測細(xì)胞增殖能力 將HNE1細(xì)胞從含有10%PBS的DMEM 培養(yǎng)基吸出,以5×103個/孔接種于96孔板中,培養(yǎng)24 h后棄去上清液。每組細(xì)胞間隔24 h處理一次,然后每組加入20 μL無菌MTT。在每個時間點設(shè)置3 個復(fù)制孔。連續(xù)培養(yǎng)4 h后,完全除去上清液,以每孔150 μL 加入DMSO孵育10 min。當(dāng)晶體完全溶解時,在570 nm的波長下測量吸光度值(A570)以反映細(xì)胞增殖情況。試驗重復(fù)3次。

1.3.5 Transwell Chamber檢測細(xì)胞侵襲能力 circPVT1 mimics和circPVT1 inhibitor轉(zhuǎn)染到HNE1細(xì)胞48 h后,吸出培養(yǎng)液,向每個孔中加入50 μL 含10 g/L BSA的無血清培養(yǎng)基,37 ℃孵育30 min。隨后將Transwell小室置于24孔板中,500 μL 含10%FBS的DMEM 培養(yǎng)基加入到小室中,100 μL HNE1細(xì)胞懸液加入到小室中,并在無血清DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后取出Transwell小室,用PBS沖洗,棉簽擦去微孔膜上層的細(xì)胞,固定在冰乙醇中30 min。轉(zhuǎn)移到微孔膜下層的細(xì)胞在倒置顯微鏡下計數(shù)。對每個樣品計數(shù)10個視野,最后計算平均值。試驗重復(fù)3次。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡 circPVT1 mimic和circPVT1 inhibitor轉(zhuǎn)染處理48 h后,常規(guī)消化計數(shù)后收集HNE1細(xì)胞,固定于75%乙醇中,4 ℃過夜。次日,PBS洗滌后,將細(xì)胞懸置于800 μL 1×PBS和1%BSA的混合溶液中,隨后加入100 μg/mL PI溶液(3.8%枸櫞酸鈉,pH=7.0)和100 RNase (RNase,10 mg/mL),在37 ℃避光室下孵育30 min,然后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。試驗重復(fù)3次。

1.3.7 Western blot 檢測鼻咽癌細(xì)胞中PTENP13K/AKT 信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 提取各組的總蛋白后加入裂解液,冰上裂解15～30 min,4 ℃10 000 r/min離心機(jī)下離心15 min 后吸取上清液,BCA 法測蛋白濃度。分離的蛋白質(zhì)在10% SDSPAGE上電泳后,轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉2 h,封閉完成后,分別用兔抗大鼠circPVT1單克隆抗體(1∶500)、小鼠抗大鼠p-AKT 單克隆抗體(1∶800)、小鼠抗大鼠p-PI3K 單克隆抗體(1∶800)、兔抗大鼠PTEN 單克隆抗體(1∶800)、兔抗大鼠AKT 單克隆抗體(1∶800)、小鼠抗大鼠PI3K 單克隆抗體(1∶800)和小鼠抗大鼠GADPH 單克隆抗體(1∶1 000),4 ℃孵育過夜。次日,洗滌后,分別加入HRP標(biāo)記的兔抗小鼠IgG(1∶2 000)或HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶2 000),37 ℃孵育1.5 h。用Leagene ECL發(fā)光液于暗室內(nèi)對Western blot條帶進(jìn)行發(fā)光顯影,使用蛋白質(zhì)圖像處理系統(tǒng)軟件和Quantity one軟件分別掃描X 光膠片和條帶密度測量值。試驗重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計量資料以表示,兩組間比較采用t檢驗,3組間比較采用方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 circPVT1在鼻咽癌組織中的表達(dá) 采用RTqRCR檢測circPVT1在慢性鼻竇炎組織和鼻咽癌組織中的表達(dá),結(jié)果顯示,與對照組(0.46±0.05)相比,circPVT1在鼻咽癌組織(1.24±0.22)中表達(dá)顯著增加(t=6.10,P=0.004)。

2.2 RT-qRCR 檢測circPVT1 mimic和circPVT1 inhibitor轉(zhuǎn)染效果 采用RT-qRCR 檢測轉(zhuǎn)染circPVT1 mimic和circPVT1 inhibitor對鼻咽癌細(xì)胞HNE1中circPVT1表達(dá)的影響。結(jié)果顯示,與陰性對照組(0.68±0.18)相比,circPVT1 過表達(dá)試驗組中circPVT1的表達(dá)(1.55±0.26)顯著增加(t=4.765,P=0.005);與陰性對照組相比,circPVT1干擾試驗組中circPVT1的表達(dá)(0.21±0.16)顯著降低(t=3.38,P=0.020)。

2.3 circPVT1對鼻咽癌細(xì)胞增殖能力的影響 采用MTT 法檢測circPVT1對鼻咽癌細(xì)胞增殖能力的影響,結(jié)果顯示,與陰性對照組(112.67±2.78)相比,circPVT1 過表達(dá)試驗組 HNE1 細(xì)胞的A570值(178.35±5.62)顯著增加(t=18.14,P<0.001),circPVT1干擾試驗組HNE1 細(xì)胞的A570值(42.23±3.45)顯著降低(t=27.54,P<0.001)。

2.4 circPVT1對鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響 采用Transwell Chamber試驗檢測circPVT1對鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響,結(jié)果顯示,與陰性對照組[(175.67±11.38)個]相比,circPVT1過表達(dá)試驗組HNE1細(xì)胞的轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)[(256.33±18.62)個]顯著增加(t=6.40,P=0.001),circPVT1 干擾試驗組HNE1細(xì)胞的轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)[(56.33±13.24)個]顯著降低(t=11.84,P<0.001),見圖1。

圖1 Transwell Chamber試驗分析circPVT1對鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響

2.5 circPVT1對鼻咽癌細(xì)胞凋亡的影響 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測circPVT1對鼻咽癌細(xì)胞凋亡的影響,結(jié)果顯示,與陰性對照組(13.32%±4.35%)相比,circPVT1 過表達(dá)試驗組 HNE1 細(xì)胞的凋亡率(6.24%±2.57%)顯著降低(t=2.65,P=0.045),circPVT1干擾試驗組HNE1 細(xì)胞的凋亡率(28.65%±5.23%)顯著增加(t=3.90,P=0.011),見圖2。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)分析circPVT1對鼻咽癌細(xì)胞凋亡的影響

2.6 circPVT1對PTEN-PI3K/AKT 信號通路的影響 采用Western blot檢測circPVT1對鼻咽癌細(xì)胞PTEN-PI3K/AKT 信號通路的影響,結(jié)果顯示,與陰性對照組相比,circPVT1過表達(dá)試驗組HNE1細(xì)胞中PTEN 蛋白表達(dá)顯著降低、p-PI3K、p-AKT 表達(dá)顯著增加(P<0.05)。circPVT1干擾試驗組HNE1細(xì)胞中PTEN的表達(dá)顯著增加,p-PI3K、p-AKT的表達(dá)顯著降低(P<0.05),見圖3和表1。

圖3 Western blot檢測circPVT1對PTEN-PI3K/AKT信號通路的影響

表1 各組細(xì)胞中PTEN-PI3K/AKT 信號通路相關(guān)蛋白的相對表達(dá)量

3 討論

鼻咽癌是一種獨特的Ⅱ型頭頸部惡性腫瘤,具有明顯的地理和種族分布特征,特別是在東南亞和中國南方,發(fā)病率較高[8]。該病發(fā)病部位深且隱蔽,早期進(jìn)展緩慢,常導(dǎo)致誤診,增加了臨床治療難度[9]。大多數(shù)鼻咽癌患者在晚期被診斷,且多數(shù)鼻咽癌是分化較差的未角化鱗狀細(xì)胞癌,惡性程度高,浸潤能力強(qiáng),易轉(zhuǎn)移[10]。盡管原發(fā)腫瘤在放療(IMRT)及放化療結(jié)合治療下得到短期控制,但仍存在局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等問題[11]。鼻咽癌的確切發(fā)病機(jī)制至今尚未闡明。因此,篩選和鑒定有效的分子標(biāo)志物對鼻咽癌早期診斷和干預(yù)具有重要意義。

circRNA 為一種新發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA,在3'和5'末端通過共價鍵形成閉環(huán)的過程中產(chǎn)生[11]。由于這種封閉的結(jié)構(gòu),circRNA 具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性,對RNA 降解途徑具有高度抗性,表明與線性非編碼RNA 相比,circRNA 可以更有效地對疾病進(jìn)行診斷[12]。越來越多的研究表明,circRNA 可以作為診斷和治療疾病的分子標(biāo)志物,特別是在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起作用[13-14],如circPIP5K1A 敲低可通過調(diào)節(jié)miR-101/ABCC1軸抑制非小細(xì)胞肺癌的進(jìn)展并提高順鉑敏感性[15]。circABCB10在乳腺癌組織和細(xì)胞中上調(diào),通過靶向調(diào)節(jié)miR-1271促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[16]。circPVT1 來自lncRNA-PVT1的第3個外顯子,位于已知的癌癥易感性區(qū)域chr 8:128902834-128903244中,被鑒定為許多類型癌癥的候選癌基因,包括頭頸鱗狀細(xì)胞癌和白血病[17-18]。既往研究表明,在非小細(xì)胞肺癌中circPVT1表達(dá)上調(diào),可能是一個潛在的預(yù)后標(biāo)志物[19]。在乳腺癌組織和細(xì)胞系中circPVT1高表達(dá),可通過調(diào)節(jié)miR-29a-3p介導(dǎo)的AGR2-HIF-1α軸促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞生長、侵襲、遷移并抑制細(xì)胞凋亡,從而成為乳腺癌中的致癌基因[20]。circPVT1為多種腫瘤治療的潛在分子靶點,但是在鼻咽癌中的作用尚不清楚,本研究首先采用RT-qRCR 檢測鼻咽癌組織中circPVT1的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,與對照組相比,鼻咽癌組織中circPVT1表達(dá)明顯增加,提示circPVT1在鼻咽癌中可能發(fā)揮癌基因作用,但是本研究收集樣本較少,未對circPVT1鼻咽癌患者中表達(dá)的臨床意義進(jìn)行分析,后續(xù)需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗證及深入分析。研究顯示,在非小細(xì)胞肺癌和乳腺癌等常見惡性腫瘤中circPVT1促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力[19-20],本研究也顯示,干擾circPVT1的表達(dá)顯著抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力,過表達(dá)circPVT1顯著增強(qiáng)了鼻咽癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力,表明circPVT1的表達(dá)促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的惡性進(jìn)展,發(fā)揮促癌作用。

關(guān)于circPVT1促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制研究顯示,circPVT1 可以抑制Bax、p53 和Daxx等促凋亡蛋白的表達(dá),并激活Caspase級聯(lián)反應(yīng),抑制細(xì)胞凋亡從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長[20-22]。PTEN 是一種抑癌因子,屬于負(fù)調(diào)控細(xì)胞增殖的基因[23-24],PTEN 是乳腺癌和胰腺癌等癌癥的腫瘤抑制因子,可以通過拮抗磷酸化酶如酪氨酸激酶的活性來抑制腫瘤的發(fā)展[25-26]。PTEN 可作為分子靶點抑制鼻咽癌細(xì)胞的惡性進(jìn)展[27]。本研究采用Western blot檢測發(fā)現(xiàn),干擾circPVT1的表達(dá)促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞PTEN 蛋白的表達(dá),過表達(dá)circPVT1抑制鼻咽癌細(xì)胞PTEN 蛋白的表達(dá)。PTEN 負(fù)向調(diào)節(jié)PI3K/AKT 信號通路是其發(fā)揮腫瘤抑制因子作用的重要機(jī)制[28],PI3K/AKT 信號通路與腫瘤發(fā)生密切相關(guān),其激活可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖、疾病進(jìn)展。有研究已經(jīng)證實鼻咽癌的進(jìn)展與PI3K/AKT 信號通路有關(guān)[29],YAO 等[28]報道在鼻咽癌細(xì)胞HK-1 中干擾PTEN的表達(dá),可通過激活PI3K/AKT 信號通路促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展,PTEN-PI3K/AKT 信號軸可作為抗鼻咽癌治療的靶點。本研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)鼻咽癌HNE1細(xì)胞中circPVT1的表達(dá)導(dǎo)致p-PI3K、p-AKT表達(dá)增加;抑制HNE1細(xì)胞中circPVT1的表達(dá)導(dǎo)致p-PI3K、p-AKT 表達(dá)降低。

綜上所述,circPVT1在鼻咽癌組織中上調(diào),促進(jìn)了鼻咽癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力,抑制細(xì)胞凋亡,可能是通過靶向調(diào)節(jié)PTEN-PI3K/AKT 信號途徑實現(xiàn)的。因此,circPVT1 可能成為鼻咽癌診斷和治療的分子靶點。