楊春曉,方艷梅,黃輝濤,林毅雄

廣東省珠海市疾病預(yù)防控制中心,廣東珠海 519060

菌種的科學(xué)保藏和管理直接關(guān)系到微生物資源的保存和利用,選擇最適宜的保藏方法,可保證微生物在保藏和傳代過(guò)程中免于變異、衰退、活力減弱及死亡[1]。菌種保存,無(wú)論是標(biāo)準(zhǔn)菌株傳代保存還是有效保存新分離菌株,都是細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)、教學(xué)科研機(jī)構(gòu)及有關(guān)生產(chǎn)單位的重要工作之一[2]。在保存菌種的過(guò)程中,除了保證菌株存活外,還應(yīng)該在保存過(guò)程中保持其固有的各種生物性狀及抗原特性。應(yīng)針對(duì)不同的菌株確定適宜的保藏方法,同一菌株應(yīng)選用兩種或者兩種以上方法進(jìn)行保藏[3-5]。傳統(tǒng)保藏菌種的方法較多,其中公認(rèn)最好的方法是冷凍真空干燥保藏法[6-9]。而菌種保藏管法是近年來(lái)使用較多的新型保存方法[10],是用一種商品化的菌種保藏管中的瓷珠保存菌種,由于操作方便和實(shí)用性強(qiáng)倍受大家青睞,為微生物菌種保藏提供了新的方式[11]?；诖?本文通過(guò)殺菌試驗(yàn)對(duì)冷凍真空干燥保藏法和菌種保藏管法保存的金黃色葡萄球菌抗力進(jìn)行研究,以探討兩種菌種保藏方法的保存效果。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗(yàn)菌株為金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC6538),由廣東省微生物菌種保藏中心提供,經(jīng)復(fù)蘇培養(yǎng)后保種。菌種分別用以下兩種保存方法進(jìn)行保存:冷凍真空干燥保藏法4 ℃保存和菌種保藏管法-80 ℃保存。試驗(yàn)用消毒劑為某品牌速干手消毒液(以下簡(jiǎn)稱消毒液),主要成分為0.10%～0.14%過(guò)氧化氫和72%～82%乙醇。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)菌懸液制備 從第1 支菌種保藏管(-80 ℃保存6個(gè)月)中取出1粒瓷珠,加入適量營(yíng)養(yǎng)肉湯,37 ℃培養(yǎng)24 h,用10 μL 一次性接種環(huán)挑取一環(huán)劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板,37 ℃培養(yǎng)24 h,挑取平板中單個(gè)典型菌落,接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面,37 ℃培養(yǎng)24 h,取新鮮斜面培養(yǎng)物,用0.3 mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗下斜面上的菌苔,將其稀釋配制成濃度為1×108～9×108cfu/mL試驗(yàn)菌懸液。按相同方法從第2支菌種保藏管(-80 ℃保存1年)和第3支菌種保藏管(-80 ℃保存3年)分別取出瓷珠制成試驗(yàn)菌懸液。

用2 mL PBS溶解第一瓶用冷凍真空干燥保藏法保存的凍干粉(4 ℃保存6個(gè)月),待完全溶解分散后混勻,加入適量營(yíng)養(yǎng)肉湯,37 ℃培養(yǎng)24 h,用10 μL一次性接種環(huán)挑取一環(huán)劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板,37 ℃培養(yǎng)24 h,挑取平板中單個(gè)典型菌落,接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面,37 ℃培養(yǎng)24 h。按上述的方法配制成1×108～9×108cfu/mL 試驗(yàn)菌懸液。取第2瓶?jī)龈煞?4 ℃保存1年)和第3瓶?jī)龈煞?4 ℃保存3年),按同法制成試驗(yàn)菌懸液。

1.2.2 中和劑鑒定試驗(yàn) 試驗(yàn)設(shè)定8個(gè)試驗(yàn)組[12],按照中和劑鑒定試驗(yàn)的要求進(jìn)行操作。第1組為試驗(yàn)結(jié)果為無(wú)試驗(yàn)菌,或有極少數(shù)試驗(yàn)菌菌落生長(zhǎng);第2組的試驗(yàn)菌菌落較第1組多,但較第3、4、5組少;第3、4、5組試驗(yàn)菌菌落生長(zhǎng)量相似,其組間誤差率不超過(guò)15%;第6～8組無(wú)菌落生長(zhǎng)。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 殺菌試驗(yàn) 在無(wú)菌試管內(nèi)加入0.5 mL 試驗(yàn)菌懸液和0.5 mL小牛血清,再加入4 mL消毒液(對(duì)照組用PBS 代替),迅速混勻,蓋嚴(yán)試管塞后作用3 min,立即吸取0.5 mL混合液轉(zhuǎn)移至盛有4.5 mL中和劑的試管中,迅速混勻。作用10 min后作適當(dāng)稀釋,然后取其中2～3個(gè)稀釋度,分別吸取0.5 mL,置于兩個(gè)滅菌平皿中,傾注40～45 ℃的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15～20 mL,轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其充分均勻,瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平皿,37 ℃培養(yǎng)48 h,進(jìn)行活菌計(jì)數(shù),計(jì)算殺菌率。試驗(yàn)重復(fù)5次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Microsoft Excel軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù),采用SPSS25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料采用百分?jǐn)?shù)表示,組間比較采用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 中和劑鑒定試驗(yàn)結(jié)果 試驗(yàn)結(jié)果表明,以含0.1%硫代硫酸鈉及30 g/L 吐溫-80的營(yíng)養(yǎng)肉湯作為中和劑,可以起到有效中和試驗(yàn)中過(guò)氧化氫和乙醇的作用,且中和產(chǎn)物對(duì)試驗(yàn)菌生長(zhǎng)及培養(yǎng)基無(wú)影響,見表1。

表1 消毒液中和劑鑒定的平均回收菌落數(shù)(cfu/mL)

2.2 菌種保藏管法對(duì)金黃色葡萄球菌的殺菌試驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果表明,消毒液作用3 min,對(duì)菌種保藏管中保存6個(gè)月的金黃色葡萄球菌殺菌率為99.076%;對(duì)菌種保藏管中保存1 年的金黃色葡萄球菌殺菌率為99.193%;對(duì)保存3 年的金黃色葡萄球菌殺菌率為99.968%。由此可見,隨著菌種保藏管保存時(shí)間的延長(zhǎng),殺菌率明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=12.020,P=0.002)。見表2。

表2 菌種保藏管法對(duì)金黃色葡萄球菌的殺菌試驗(yàn)結(jié)果

2.3 冷凍真空干燥保藏法對(duì)金黃色葡萄球菌的殺菌試驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果表明,消毒液作用3 min,對(duì)冷凍真空干燥保藏法保存6個(gè)月的金黃色葡萄球菌殺菌率為99.025%;對(duì)冷凍真空干燥保藏法保存1年的金黃色葡萄球菌殺菌率為99.039%;對(duì)保存3年的金黃色葡萄球菌殺菌率為99.063%。由此可見,隨著冷凍真空干燥保藏法保存時(shí)間延長(zhǎng)殺菌率略有增加,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=0.666,P=0.717)。見表3。

表3 冷凍真空干燥保藏法對(duì)金黃色葡萄球菌的殺菌試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

菌種的保藏工作是十分重要的工作,成功進(jìn)行菌種保藏是利用微生物的先決條件,是良好的實(shí)驗(yàn)室管理和實(shí)驗(yàn)質(zhì)量的重要保證[13]。保存菌種的方法很多,總的來(lái)說(shuō)可以分成兩大類[14]:一類是保存生長(zhǎng)在培養(yǎng)基上的菌種培養(yǎng)物,通過(guò)控制培養(yǎng)條件延長(zhǎng)菌種的存活期;另一類保存方法是除去培養(yǎng)基后保存菌體細(xì)胞,利用低溫、干燥、無(wú)營(yíng)養(yǎng)和隔絕空氣等條件,使菌體細(xì)胞生命活動(dòng)降至最低,處于“休眠”狀態(tài),從而延長(zhǎng)菌種的保存時(shí)間。菌種保藏管法和冷凍真空干燥保藏法均屬于后者。本文采用含有效成分為過(guò)氧化氫和乙醇的消毒液對(duì)不同保存條件下金黃色葡萄球菌的殺菌率進(jìn)行研究,殺菌率越高,菌株的抗力越小。本研究結(jié)果表明,在菌種保藏管法中,隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng),金黃色葡萄球菌抗力下降明顯;而在冷凍真空干燥保藏法中,隨著保存時(shí)間延長(zhǎng),金黃色葡萄球菌抗力未見明顯變化,說(shuō)明不同菌種保藏方法對(duì)金黃色葡萄球菌抗力影響不同,冷凍真空干燥保藏法對(duì)金黃色葡萄球菌抗力影響較小,故認(rèn)為需要長(zhǎng)時(shí)間保存金黃色葡萄球菌首選冷凍真空干燥保藏法。但冷凍真空干燥保藏法操作技術(shù)難度大,需要特殊設(shè)備,由于基層微生物實(shí)驗(yàn)室普遍缺乏菌種凍干機(jī),無(wú)法采用此法保存菌株。菌種保藏管法即瓷珠菌種保存管法,常用于食品微生物標(biāo)準(zhǔn)菌種和分離菌株的保存、復(fù)蘇以及運(yùn)輸[15]。菌種保藏管法雖然保存效果次于冷凍真空干燥保藏法,但其在規(guī)定的期限內(nèi)具有良好的菌株保存效果,這種方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件要求不高,同時(shí)具有方便經(jīng)濟(jì)、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn),較好地滿足了工作需求,對(duì)基層微生物實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)較適用,易于推廣。

王凱[16]研究了斜面低溫、半固體穿刺法、液體石蠟法和冷凍干燥法保存金黃色葡萄球菌的效果,通過(guò)分析不同保存時(shí)間的細(xì)菌存活率,認(rèn)為冷凍干燥法保存金黃色葡萄球菌的效果較好,保存時(shí)間長(zhǎng),且不影響菌株的形態(tài)和生化結(jié)構(gòu)。羅成富[17]通過(guò)對(duì)不同菌種保藏方法保存的常見葡萄球菌成活率進(jìn)行比較,得出冷凍干燥法是保藏常見葡萄球菌的最佳方法,值得推廣。賈興真等[18]研究了84消毒液作用于經(jīng)反復(fù)凍融后的金黃色葡萄球菌的殺菌率,結(jié)果顯示用菌種保藏管保存的菌株抗力未見顯著變化。而本文通過(guò)殺菌試驗(yàn)研究?jī)煞N不同的菌種保藏方法對(duì)金黃色葡萄球菌抗力的影響,結(jié)果表明冷凍真空干燥保藏法保存效果更理想。

菌種保存溫度越低,微生物的代謝越不活躍,生物活性越穩(wěn)定[19]。但本研究結(jié)果表明在超低溫條件下菌種保藏管瓷珠的保存效果不如在普通低溫條件冷凍真空干燥保藏法的凍干粉。采用冷凍真空干燥保藏法-80 ℃保存菌株效果如何,其對(duì)消毒液的抗力變化情況仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述,冷凍真空干燥保藏法保存金黃色葡萄球菌的效果優(yōu)于菌種保藏管法。工作人員應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的具體條件和工作的實(shí)際要求選擇一種行之有效的菌種保藏方法,以保證實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制、日常檢驗(yàn)和科學(xué)研究等順利開展。