王國(guó)茗 ,尹照萍 ,潘巍巍 ,劉國(guó)峰 ,符一寧

遼油寶石花醫(yī)院:1.呼吸及危重癥醫(yī)學(xué)科;2.腫瘤科,遼寧盤(pán)錦 124010

慢性阻塞性肺疾病(COPD)及肺癌為全球性高發(fā)病率、高病死率的疾病,均為重大公共健康問(wèn)題[1]。流行病學(xué)研究證實(shí),吸煙致COPD 患者合并肺癌的概率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于非吸煙COPD 患者,COPD 是誘發(fā)肺癌的危險(xiǎn)因素,且肺癌是導(dǎo)致COPD 患者最常見(jiàn)的死亡原因[2]。COPD 合并肺癌的發(fā)病率呈逐年增加趨勢(shì),臨床工作中,COPD 合并肺癌的診治情況仍不樂(lè)觀,早期診斷、判斷病情進(jìn)展對(duì)提高療效、改善患者預(yù)后至關(guān)重要。

微小RNA(miR)-210作為重要的缺氧敏感型微小RNA 分子,在實(shí)體腫瘤缺氧微環(huán)境中變化顯著,促使細(xì)胞發(fā)生凋亡逃逸,導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控并發(fā)生癌變傾向[3]。研究證實(shí),COPD 對(duì)肺癌免疫微環(huán)境產(chǎn)生影響,且在免疫治療中COPD 合并肺癌患者能夠獲益,提示COPD 異常炎癥免疫狀態(tài)在肺癌誘發(fā)、惡性進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮作用[4]。輔助性T 細(xì)胞17(Th17)是體內(nèi)重要的免疫細(xì)胞,在調(diào)節(jié)炎癥免疫方面發(fā)揮重要作用,尤其在慢性炎癥繼發(fā)腫瘤過(guò)程中更為明顯[5]。

鑒于此,本研究擬探討血清miR-210表達(dá)水平與患者肺功能、Th17 相關(guān)細(xì)胞因子的關(guān)系及其診斷COPD 合并肺癌的價(jià)值,旨在為該病的診治提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017年1月至2020年12月本院收治的COPD 合并肺癌患者(COPD 合并肺癌組,n=60)、單純肺癌患者(肺癌組,n=60),單純COPD患者(COPD 組,n=80),以及同期體檢健康者(健康對(duì)照組,n=100)為研究對(duì)象,COPD 符合《慢性阻塞性肺疾病基層診療指南(2018年)》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6],肺癌符合文獻(xiàn)[7]中的診斷標(biāo)準(zhǔn),排除未完成肺功能檢測(cè)、合并其他惡性腫瘤、合并自身免疫性疾病、合并支氣管哮喘、肺結(jié)核等肺部疾病患者。

COPD 合并肺癌組患者中男43例,女17例;年齡52～81歲,平均(67.52±10.41)歲;36例患者有吸煙史,24 例患者無(wú)吸煙史;吸煙指數(shù)(1 036.2±323.5);病理類型:鱗癌31 例,腺癌18 例,其他11例。肺癌組中男45例,女15例;年齡50～80歲,平均(65.24±9.46)歲;38例患者有吸煙史,22例患者無(wú)吸煙史;吸煙指數(shù)(937.9±315.3);病理類型:鱗癌29例,腺癌19例,其他12例。COPD 組中男57例,女23例;年齡51～81歲,平均(66.43±9.02)歲;45例患者有吸煙史,35 例患者無(wú)吸煙史;吸煙指數(shù)(995.3±306.3)。健康對(duì)照組中男71 例,女29 例;年齡53～79歲,平均(65.62±9.23)歲。4組研究對(duì)象性別構(gòu)成、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究患者及其家屬簽署知情同意書(shū),且本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 血清標(biāo)本收集 以普通采血試管于清晨采集所有研究對(duì)象靜脈血4～5 mL,以2 000 r/min 在-5 ℃環(huán)境下離心10 min,收集上層血清2 mL,分裝于兩個(gè)試管,每個(gè)試管1 mL。其中一個(gè)即刻送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行miR-210檢測(cè)。另一個(gè)則置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?保存期為6個(gè)月。使用前,從-80 ℃冰箱轉(zhuǎn)移至-5 ℃冰箱放置30 min,再放置室溫下至緩慢融解,即刻送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行miR-210檢測(cè)。

1.2.2 miR-210 檢測(cè) 采用RNA 提取試劑盒(51028-M,常州百代生物科技股份有限公司)提取血清RNA;采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(K1652,美國(guó)Thermo Fisher公司)、PCR 儀(ABI9700,美國(guó)ABI公司)合成cDNA;采用熒光定量PCR 儀(Rotor-Gene 3000,德國(guó)Qiangen公司)進(jìn)行定量檢測(cè),定量引物(上海生工生物工程公司設(shè)計(jì)和合成)序列如下,miR-210-F:5'-GTG CAG GGT CCG AGG T-3';miR-210-R:5'-TAT CTG TGC GTG TGA CAG CGG CT-3'。U6-F:5'-CTC GCT TCG GCA GCA C-3';U6-R:5'-AAC GCT TCA CGA ATT TGC G-3'。反應(yīng)條件如下:95 ℃預(yù)變性10 min,40 個(gè)循環(huán);95 ℃,15 s;60 ℃,60 s。以U6為miR-210內(nèi)參,采用2-ΔΔCt計(jì)算miR-210相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 肺功能檢測(cè) 采用肺功能檢測(cè)儀(Master Screen PFT System,德國(guó)耶格公司)檢測(cè)受試者的用力肺活量(FVC)、第1 秒用力呼氣容積(FEV1)、FEV1預(yù)計(jì)值百分比(FEV1%pred)及呼氣流量峰值(PEF)等肺功能指標(biāo)。

1.2.4 Th17相關(guān)細(xì)胞因子檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)外周血Th17相關(guān)細(xì)胞因子指標(biāo)水平。具體步驟如下:收集受試者晨起空腹外周血10 mL,低溫2 000 r/min 離心10 min,收集上清液,ELISA 試劑盒(上海臻科生物科技有限公司)檢測(cè)白細(xì)胞介素(IL)-17、IL-21、IL-23、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩對(duì)比采用LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性采用Pearson 相關(guān)分析。采用受試者工作特征曲線(ROC曲線)分析血清miR-210診斷COPD 合并肺癌的效能。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清miR-210、肺功能及Th17相關(guān)細(xì)胞因子比較 各組血清miR-210相對(duì)表達(dá)水平、肺功能指標(biāo)及Th17相關(guān)細(xì)胞因子指標(biāo)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。健康對(duì)照組、COPD 組、肺癌組、COPD 合并肺癌組患者血清miR-210相對(duì)表達(dá)水平逐漸升高,組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。健康對(duì)照組、COPD 組、肺癌組、COPD 合并肺癌組患者肺功能指標(biāo)水平逐漸降低,組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。健康對(duì)照組、COPD組、肺癌組、COPD 合并肺癌組患者Th17相關(guān)細(xì)胞因子指標(biāo)水平逐漸升高,組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組血清miR-210相對(duì)表達(dá)水平、肺功能指標(biāo)及Th17相關(guān)細(xì)胞因子水平比較()

表1 各組血清miR-210相對(duì)表達(dá)水平、肺功能指標(biāo)及Th17相關(guān)細(xì)胞因子水平比較()

注:與健康對(duì)照組比較,*P<0.05;與COPD組比較,#P<0.05;與肺癌組比較,▽P<0.05。

2.2 COPD 合并肺癌組患者血清miR-210相對(duì)表達(dá)水平與肺功能指標(biāo)、Th17相關(guān)細(xì)胞因子指標(biāo)的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析顯示,COPD 合并肺癌組患者血清miR-210相對(duì)表達(dá)水平與FEV1/FVC、FEV1%pred、PEF 呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),與IL-17、IL-21、IL-23、TNF-α呈正相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 COPD 合并肺癌組患者血清miR-210相對(duì)表達(dá)水平與肺功能指標(biāo)、Th17相關(guān)細(xì)胞因子指標(biāo)的相關(guān)性(n=60)

2.3 血清miR-210相對(duì)表達(dá)水平對(duì)COPD 合并肺癌的診斷價(jià)值 ROC曲線分析結(jié)果顯示,血清miR-210相對(duì)表達(dá)水平診斷COPD 合并肺癌的曲線下面積(AUC)為0.704(95%CI:0.525～0.944);血清miR-210相對(duì)表達(dá)水平的截?cái)嘀禐?.8時(shí),具有較高的靈敏度(66.67%)和特異度(75.00%),約登指數(shù)為0.417。

續(xù)表2 COPD 合并肺癌組患者血清miR-210相對(duì)表達(dá)水平與肺功能指標(biāo)、Th17相關(guān)細(xì)胞因子指標(biāo)的相關(guān)性(n=60)

3 討論

吸煙、煙霧暴露、慢性炎癥及遺傳易感性等均為COPD合并肺癌的易感因素,具體發(fā)病機(jī)制尚無(wú)統(tǒng)一結(jié)論。近年來(lái)有學(xué)者提出,肺癌可能是COPD的最終結(jié)局[8]。COPD 合并肺癌多發(fā)于60歲以上男性長(zhǎng)期吸煙人群,且COPD 呼吸道癥狀可能掩蓋肺癌患者早期臨床癥狀,導(dǎo)致患者漏診、誤診,COPD 合并肺癌確診時(shí)多為晚期,受自身肺功能限制的原因,無(wú)法接受根治性治療,治療難度大,預(yù)后差[9]。高危人群定期檢查肺功能、檢測(cè)血清診斷標(biāo)志物,有助于早期診斷,提高治療效果,改善生活質(zhì)量和提高預(yù)后。

COPD 是一種慢性炎癥性肺部疾病,肺組織反復(fù)的損傷、修復(fù)引發(fā)瘢痕,導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[10],可見(jiàn)異常炎性反應(yīng)在COPD 疾病進(jìn)展、惡化為肺癌的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。miR-210 已被證實(shí)在急性腦梗死、肝炎、膿毒癥等疾病的炎癥病理過(guò)程中發(fā)揮作用,且與IL-6、TNF-α 等炎癥因子間存在相關(guān)性[11];缺氧是COPD、COPD 合并肺癌患者的重要特征,而對(duì)缺氧敏感的miR-210可能在COPD 在發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮調(diào)節(jié)功能[12]。

本研究發(fā)現(xiàn)健康體檢者、單純COPD 患者、單純肺癌患者、COPD 合并肺癌患者血清miR-210相對(duì)表達(dá)水平逐漸升高,初步證明miR-210 高表達(dá)可能與COPD 異常炎癥、肺部癌變有關(guān);研究證實(shí)VEGF 與肺癌血管生成關(guān)系緊密[13],miR-210作為實(shí)體瘤在缺氧條件下變化最顯著的miRNA 分子,筆者推測(cè),miR-210可能通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF 表達(dá)促進(jìn)腫瘤血管新生、協(xié)助腫瘤細(xì)胞免疫逃逸,誘發(fā)肺癌[14]。

肺功能檢查是診斷COPD的“金標(biāo)準(zhǔn)”。本研究發(fā)現(xiàn),與健康體檢者比較,單純COPD 患者、單純肺癌患者的肺功能下降,且COPD 合并肺癌患者肺功能損傷較單純COPD 患者、單純肺癌患者更加嚴(yán)重,筆者推測(cè)COPD 患者肺功能下降,黏膜清除能力下降,可能是導(dǎo)致肺部腫瘤形成的機(jī)制之一;此外,COPD 合并肺癌患者血清miR-210 相對(duì)表達(dá)水平與FEV1/FVC、FEV1%pred、PEF 呈負(fù)相關(guān),表明監(jiān)測(cè)血清miR-210相對(duì)表達(dá)水平,可在一定程度上評(píng)估患者肺功能損傷情況。

Th17細(xì)胞主要分泌IL-17、IL-21、IL-23、TNF-α等促炎因子。研究表明,肺癌患者外周血Th17細(xì)胞水平升高[15];臨床研究發(fā)現(xiàn),Th17相關(guān)細(xì)胞因子水平升高可增加COPD 患者罹患肺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[16-17];Th17細(xì)胞促進(jìn)炎性反應(yīng),在COPD 合并肺癌疾病發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn),健康體檢者、COPD 患者、COPD 合并肺癌患者的外周血IL-17、IL-21、IL-23、TNF-α水平逐漸增加,且COPD合并肺癌患者血清miR-210水平與Th17相關(guān)細(xì)胞因子水平呈正相關(guān),以上結(jié)果表明miR-210可在一定程度上預(yù)測(cè)患者炎癥程度。

ROC曲線分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),血清miR-210 相對(duì)表達(dá)水平對(duì)診斷COPD 合并肺癌有一定價(jià)值(AUC 為0.704),但存在靈敏度偏低的局限。此外,COPD 合并肺癌確診患者多為晚期,本研究納入COPD 合并肺癌的病例較少,后續(xù)將收集更多的樣本從而進(jìn)一步探討miR-210作為診斷COPD 合并肺癌標(biāo)志物的可能。

綜上所述,COPD 合并肺癌患者血清miR-210相對(duì)表達(dá)水平增加,且與患者肺功能及Th17相關(guān)細(xì)胞因子指標(biāo)水平有關(guān),可一定程度上反映患者病情嚴(yán)重程度,血清miR-210可作為輔助診斷COPD 合并肺癌的分子標(biāo)志物。