代永娟,高 燕,楊 建

成都醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院/成都市郫都區(qū)人民醫(yī)院腫瘤血液科,四川成都 611730

胎盤特異性蛋白8(PLAC8)也稱為onzin,在骨髓細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和肺、腸的上皮細(xì)胞等各種類型細(xì)胞中表達(dá)[1]。PLAC8 在正常組織穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用,研究顯示其表達(dá)異常導(dǎo)致多種疾病和人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,PLAC8在肺癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌等常見惡性腫瘤中均發(fā)揮促癌作用,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長、侵襲和轉(zhuǎn)移,抑制腫瘤細(xì)胞凋亡[2-4]。然而,PLAC8在子宮內(nèi)膜癌進(jìn)展中的確切功能和潛在機制仍不清楚。HUANG 等[5]報道PLAC8 與蛋白 激酶B(AKT)相互作用,激活A(yù)KT/mTOR 信號通路促進(jìn)鼻咽癌惡性進(jìn)展。AKT/mTOR 信號通路在細(xì)胞生長、凋亡以及化療耐藥等生物過程中均具有重要作用,可作為藥物干預(yù)的靶點[6]。且AKT/mTOR 信號通路在子宮內(nèi)膜癌中也處于激活狀態(tài)[7],而PLAC8是否可以調(diào)控AKT/mTOR 信號通路促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡尚不清楚。本研究旨在探討PLAC8在子宮內(nèi)膜癌惡性進(jìn)展中發(fā)揮的重要作用,探討PLAC8是否可以作為子宮內(nèi)膜癌預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物和治療的潛在新分子靶點,現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2015年3月至2016年9月保存于本院病理科的子宮內(nèi)膜癌石蠟包埋組織塊80例,正常子宮內(nèi)膜石蠟包埋組織塊36例?；颊呔鶝]有放療或化療史;組織標(biāo)本的病理診斷由兩名專門病理醫(yī)師確認(rèn);臨床病理、隨訪預(yù)后資料完整(患者術(shù)后3個月隨訪一次,隨訪60個月或者患者死亡時終止)。80例子宮內(nèi)膜癌患者中死亡52例,存活28例。所有研究對象均簽訂知情同意書。標(biāo)本的使用得到了本院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 試劑來源 細(xì)胞培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板購于美國Corning公司;子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株Ishikawa購于中科院上海細(xì)胞庫;胎牛血清、DMEM-F12培養(yǎng)基購于美國Gibco公司;NC 短發(fā)夾RNA(shRNA)或PLAC8 shRNA 購于上海吉瑪基因技術(shù)有限公司;兔源PLAC8一抗、兔源Ki67一抗、兔源AKT 一抗、鼠源pAKT 一 抗、兔源mTOR 一抗、兔 源pmTOR 一 抗、HRP偶聯(lián)的羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗購于英國Abcam 公司;MTS試劑購于上海同仁化學(xué)技術(shù)有限公司;細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)法(IHC) 4 μm 石蠟切片經(jīng)脫蠟和水化后,在抗原修復(fù)液中微波1 min,浸入3%過氧化氫中10 min,阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次后,用3%牛血清蛋白封閉15 min。將切片與抗兔PLAC8抗體在4 ℃下孵育過夜、二抗室溫孵育1 h。PBS洗3次后,加入顯色液。蘇木精復(fù)染后,分級乙醇中脫水,封片。染色測定結(jié)果由兩名病理學(xué)專家獨立評估和評分。PLAC8染色強度評分標(biāo)準(zhǔn)如下:強,3分;中等,2分;弱,1分;陰性,0分。PLAC8染色面積評分標(biāo)準(zhǔn)如下:>75%,4分;>50%～75%,3 分;>25%～50%,2 分;>10%～25%,1分;≤10%,0分。最終染色分?jǐn)?shù):染色強度分?jǐn)?shù)×染色面積分?jǐn)?shù)。最終染色分?jǐn)?shù)≥2 分定義為PLAC8高表達(dá),<2分定義為PLAC8低表達(dá)。Ki67增殖指數(shù)按熱點區(qū)域進(jìn)行評價,即陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)/總的腫瘤細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組 子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株Ishikawa采用含有10%胎牛血清的DMEM-F12 培養(yǎng)基培養(yǎng),放置在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。Ishikawa細(xì)胞呈對數(shù)生長期時,胰酶消化收集細(xì)胞,將細(xì)胞按2×105個/孔接種于6孔板內(nèi),分為sh-NC組、sh-PLAC8-1組、sh-PLAC8-2組。按照Lip 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染,取5 μg NC shRNA或PLAC8 shRNA-1、PLAC8 shRNA-2分別與1 mL無血清DMEM-F12培養(yǎng)基混勻后室溫孵育5 min,5 μL Lip 2000與1 mL無血清DMEM-F12培養(yǎng)基混勻后室溫孵育5 min。NC shRNA 或 PLAC8 shRNA-1、PLAC8 shRNA-2分別加入各組Ishikawa細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后,通過Western-blot檢測沉默效率。

1.3.3 MTT 試驗檢測細(xì)胞增殖能力 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后收集sh-NC 組和sh-PLAC8-1組、sh-PLAC8-2組細(xì)胞,將細(xì)胞調(diào)整至濃度為1×104個/毫升的單細(xì)胞懸液。向96孔板中加入100 μL 細(xì)胞懸液,每組設(shè)置1、2、3、4及5 d檢測時間點,每個時間點設(shè)置6個復(fù)孔,放置在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。于對應(yīng)的檢測點每孔加入20 μL MTS試劑,繼續(xù)孵育2 h后采用全波長掃描儀檢測各樣品在490 nm 波長處的吸光度值(A 值)。

1.3.4 細(xì)胞凋亡檢測 取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞采用無EDTA的胰酶消化收集sh-NC 組和sh-PLAC8-1組、sh-PLAC8-2組細(xì)胞,PBS洗3洗后,細(xì)胞沉淀采用250 μL 緩沖液重懸,并用尼龍網(wǎng)過濾。并加入5 μL FITC和10 μL PI染色液混勻后,于常溫下避光孵育10 min。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡情況。

1.3.5 Western-blot 胰酶消化sh-NC 組和sh-PLAC8-1組、sh-PLAC8-2組細(xì)胞,加入RIPA 裂解緩沖液和蛋白酶抑制劑混合物混勻,冰上裂解30 min,裂解液在4 ℃以12 000×g離心15 min,獲得蛋白裂解液。根據(jù)說明書,使用BCA 蛋白質(zhì)檢測試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度,蛋白煮沸變性。等質(zhì)量的蛋白質(zhì)樣品通過10%聚丙烯酰胺凝膠電泳-SDS(PAGE-SDS)分離,并濕轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜(PVDF膜)上。PVDF膜在室溫下與5%脫脂奶粉孵育封閉1 h。TBST 洗3 次后,膜與AKT、pAKT、mTOR 和pm-TOR 和GAPDH 一抗稀釋液4 ℃孵育過夜。TBST洗3次后,PVDF膜與HRP偶聯(lián)的羊抗兔、羊抗鼠二抗室溫孵育2 h。使用 ChemiDocTMMP 成像系統(tǒng)可視化蛋白條帶成像。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。所有試驗重復(fù)3次。使用Graph Pad Prism 軟件作圖展示。計數(shù)資料采用百分?jǐn)?shù)表示,組間比較采用χ2檢驗。計量資料采用表示,兩組間比較采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,進(jìn)一步組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。通過Kaplan Meier法繪制患者生存曲線,采用Log-Rank 法進(jìn)行檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PLAC8在子宮內(nèi)膜癌組織中高表達(dá) IHC 結(jié)果顯示,80例子宮內(nèi)膜癌和36例正常子宮內(nèi)膜中的PLAC8陽性表達(dá)率分別為58.75%和41.25%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖1。

圖1 PLAC8在子宮內(nèi)膜癌組織和正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)(×100)

2.2 PLAC8表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌患者病理參數(shù)的關(guān)系 腫瘤級別高、國際婦產(chǎn)科協(xié)會(FIGO)分期為Ⅲ～Ⅳ期、Ki67 增殖指數(shù)>50的子宮內(nèi)膜癌中PLAC8陽性表達(dá)率明顯增高(P<0.05)。發(fā)病年齡、是否絕經(jīng)、腫瘤組織類型、肌層浸潤深度和淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移等因素與PLAC8表達(dá)無關(guān)(P>0.05),見表1。

表1 子宮內(nèi)膜癌患者組織中PLAC8表達(dá)情況與臨床病理參數(shù)的關(guān)系[n(%)]

續(xù)表1 子宮內(nèi)膜癌患者組織中PLAC8表達(dá)情況與臨床病理參數(shù)的關(guān)系[n(%)]

2.3 PLAC8表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌患者生存時間的關(guān)系 PLAC8高表達(dá)患者中死亡34例,5年生存率為27.66%;PLAC8低表達(dá)患者中死亡18例,5年生存率為45.45%。繪制患者生存曲線,經(jīng)分析,高表達(dá)PLAC8的子宮內(nèi)膜癌患者其生存時間短于低表達(dá)PLAC8者(χ2=5.082,P=0.024)。

2.4 PLAC8 shRNA 轉(zhuǎn)染子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的結(jié)果在sh-NC 組和sh-PLAC8-1 組、sh-PLAC8-2 組子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中PLAC8蛋白表達(dá)水平分別為1.13±0.14和0.30±0.07、0.39±0.04。sh-PLAC8-1組和sh-PLAC8-2組中的PLAC8蛋白表達(dá)水平明顯低于sh-NC組(P<0.001),見圖2。

圖2 PLAC8 shRNA 轉(zhuǎn)染成功的Ishikawa子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞

2.5 細(xì)胞增殖能力檢測 第5天時,sh-PLAC8-1和sh-PLAC8-2組中的細(xì)胞增殖數(shù)量明顯低于sh-NC組中的細(xì)胞增殖數(shù)量,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖3。

圖3 PLAC8 shRNA 轉(zhuǎn)染Ishikawa子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長曲線

2.6 細(xì)胞凋亡情況 sh-NC 組和sh-PLAC8-1、sh-PLAC8-2組子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡率分別為4.65%±1.62%和21.93%±5.98%、19.48%±3.57%。與sh-NC組相比,sh-PLAC8-1和sh-PLAC8-2組子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡率顯著增加(F=15.558,P=0.004),見圖4。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)分析PLAC8 shRNA 轉(zhuǎn)染子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡情況(×100)

2.7 AKT/mTOR 信號通路檢測 sh-NC 組、sh-PLAC8-1和sh-PLAC8-2 組細(xì)胞中AKT 和mTOR蛋白表達(dá)無明顯變化。與sh-NC 組比較,sh-PLAC8-1和sh-PLAC8-2組細(xì)胞中pAKT 和pmTOR 蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05),見圖5。

圖5 PLAC8 shRNA 轉(zhuǎn)染癌細(xì)胞中AKT、pAKT、mTOR 和pmTOR的表達(dá)水 平

3 討論

PLAC8是一種相對分子質(zhì)量為12.5×103的蛋白質(zhì),其分子結(jié)構(gòu)從兩棲動物到人類都高度保守,PLAC8被證明參與調(diào)節(jié)代謝和免疫等各種細(xì)胞生理過程,以及細(xì)胞增殖、分化、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥性生成等腫瘤病理過程,其作用機制可能是通過調(diào)控PI3k/AKT/NF-κB、PI3K/AKT/GSK3β、TGF-β/SMAD等信號途徑發(fā)揮作用[8-10]。子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率和病死率逐年增加,嚴(yán)重威脅女性患者生命健康[11]。大多數(shù)子宮內(nèi)膜癌患者可選擇的治療手段療效有限,預(yù)后較差[12]。研究顯示,任何組織學(xué)的ⅢB期或ⅢC 期疾病以及ⅠA 期(伴有肌層浸潤)、ⅠB、Ⅱ或ⅢA 期漿液性或透明細(xì)胞癌是子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后不良的因素[13],但是子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機制尚未完全闡明,因此,了解子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機制對于探索子宮內(nèi)膜癌的預(yù)防和治療策略至關(guān)重要。PLAC8在子宮內(nèi)膜癌中發(fā)揮的作用未知,研究PLAC8在子宮內(nèi)膜癌中發(fā)揮的作用及作用機制,對于探索子宮內(nèi)膜癌治療的分子靶點具有重要意義。

本研究采用IHC 檢測發(fā)現(xiàn)PLAC8 蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)上調(diào),說明PLAC8在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)異常,提示PLAC8在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病過程中可能發(fā)揮重要作用,考慮為候選癌基因。同時本研究發(fā)現(xiàn),PLAC8 高表達(dá)與患者腫瘤級別高、FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期和Ki67增殖指數(shù)>50相關(guān),且PLAC8高表達(dá)的子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后較差,說明PLAC8與子宮內(nèi)膜癌惡性進(jìn)展密切相關(guān),是子宮內(nèi)膜癌預(yù)后不良的分子標(biāo)志物,提示PLAC8在子宮內(nèi)膜癌中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能,相關(guān)研究也顯示,肺癌和乳腺癌組織中PLAC8表達(dá)升高,并且PLAC8高表達(dá)與肺癌患者腫瘤大小、組織學(xué)分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM 分期呈正相關(guān),高表達(dá)PLAC8的肺癌患者預(yù)后較差[2-3]。研究顯示,PLAC8過表達(dá)在體外和體內(nèi)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移并抑制細(xì)胞凋亡[3],敲低PLAC8的表達(dá)導(dǎo)致胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤細(xì)胞的增殖和活力降低[14]。本研究采用shRNA 干擾PLAC8的表達(dá),采用MTS和細(xì)胞凋亡試驗檢測PLAC8是否在細(xì)胞水平影響子宮內(nèi)膜癌的增殖和凋亡能力,結(jié)果顯示敲低PLAC8的表達(dá)在體外顯著抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的發(fā)生,表明PLAC8在子宮內(nèi)膜癌中發(fā)揮促癌基因作用,提示PLAC8是子宮內(nèi)膜癌進(jìn)展中的重要分子。

PLAC8在子宮內(nèi)膜癌中的作用機制仍需進(jìn)一步探討,細(xì)胞凋亡是程序性細(xì)胞死亡的主要機制,機體通過不同的機制維持正常生理和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。在腫瘤細(xì)胞中,細(xì)胞凋亡受到抑制,細(xì)胞惡性增殖失控,從而導(dǎo)致腫瘤的惡性進(jìn)展[15]。PLAC8可通過調(diào)控不同的信號通路促進(jìn)不同的腫瘤惡性表型,既往研究顯示,PLAC8通過調(diào)控PI3k/AKT/NF-κB信號通路抑制乳腺癌細(xì)胞凋亡[3]。PLAC8通過抑制 PI3K/AKT/GSK3β信號通路促進(jìn)鼻咽癌的放射抗性[9]。HUANG 等[10]報道,敲低PLAC8的表達(dá)后,TGF-β/SMAD 信號通路失活并抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖、傷口愈合、遷移、侵襲及異種移植物的生長。研究顯示,在鼻咽癌細(xì)胞中PLAC8 與AKT 共定位,兩者可以相互作用,干擾PLAC8的表達(dá),其可通過抑制AKT/mTOR 信號通路抑制細(xì)胞增殖,并促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的凋亡[5]。AKT/mTOR 信號通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[6],提示PLAC8在子宮內(nèi)膜癌中發(fā)揮作用可能是通過調(diào)控AKT/mTOR 信號通路實現(xiàn)的,本研究Western-blot檢測結(jié)果顯示干擾PLAC8顯著抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中pAKT 和pmTOR 蛋白的表達(dá)。表明干擾PLAC8的表達(dá)顯著抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞AKT/mTOR 信號通路,提示PLAC8可能通過激活A(yù)KT/mTOR 信號通路在子宮內(nèi)膜癌中發(fā)揮作用,但PLAC8是否通過直接與AKT 相互作用激活A(yù)KT/mTOR 信號通路進(jìn)而促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的惡性進(jìn)展本文未進(jìn)行深入研究,這也是本課題組后續(xù)的研究方向。

綜上所述,子宮內(nèi)膜癌中PLAC8呈高表達(dá),敲低PLAC8表達(dá)能促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡,其機制可能是通過調(diào)控AKT/mTOR 信號通路起作用。