黃云川 ,楊 琴 ,唐 敬 ,張 敏 ,任用坤△

四川省南充市中醫(yī)醫(yī)院:1.醫(yī)技科;2.檢驗科,四川南充 637000

糖化清蛋白(GA)為清蛋白糖基化產(chǎn)物,是近年新發(fā)現(xiàn)的可用于確認糖尿病患者治療中期效果的血糖監(jiān)測指標。與傳統(tǒng)指標糖化血紅蛋白(HbA1c)比較,GA 反映的是患者近3周內(nèi)血糖水平,且在血紅蛋白異常情況下其結(jié)果不受影響[1]。血清GA 水平測定方法主要有免疫層析法、高效液相色譜法、酶法等,不同方法參考區(qū)間存在較大差異,目前國內(nèi)外尚無公認的參考測量方法。近年來日本臨床化學學會和日本糖尿病委員會指出,以JCCRM611作為GA 測量標準物,同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(ID-LC/MS/MS)可作為GA的參考測量方法[2]。另外周慧娟等[3]對該方法進行了方法學評價得出,ID-LC/MS/MS測定血清GA 水平準確可靠。酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)是利用酶標記抗原或抗體,從而檢測相應抗原或抗體水平的檢測手段,相較于ID-LC/MS/MS,具有操作簡便、價格低廉等特點,更利于臨床大規(guī)模篩查[4]。鑒于此,本研究擬對ELISA 和ID-LC/MS/MS檢測血清GA 水平性能進行比較,旨在為臨床應用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2020年1-6月本院檢驗科保留的體檢人群剩余血清300份作為研究標本,-80 ℃保存?zhèn)溆?。納入標準:(1)18 歲以上;(2)體檢合格。排除標準:(1)妊娠或哺乳期女性;(2)溶血、乳糜、黃疸血清標本。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 儀器與試劑 人GA ELISA 試劑盒(英國Abbexa公司)。Ultra PFPP色譜柱(北京邁瑞達科技有限公司)。七氟丁酸、乙腈(日本TCI公司)。Multiskan FC 型酶標儀(美國賽默飛世爾公司)。TSQ VANTAGE型三重四極桿液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國賽默飛世爾公司)。

1.3 方法

1.3.1 ELISA 將抗體預包被至96孔板上,按照試劑盒說明書配置標準品、測試樣品和生物素偶聯(lián)試劑,加至孔中孵育;加入結(jié)合了辣根過氧化物酶(HRP)的試劑并孵育,磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗;添加3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺,觀察到藍色產(chǎn)物時,加入酸性終止液,Multiskan FC 型酶標儀測定波長450 nm 處吸光度(A)值,根據(jù)標準曲線計算GA 水平。

1.3.2 ID-LC/MS/MS (1)標準工作液及上機標準工作液制備:按比例將賴氨酸和同位素標記賴氨酸、糖化賴氨酸和同位素標記糖化賴氨酸混勻;不同摩爾比標準工作液與待測樣品混勻,依次進行氫化還原反應、強酸高溫水解反應。(2)液相色譜條件:色譜柱為Ultra PFPP(柱長2.1 mm,內(nèi)徑150 mm,粒徑3 μm),乙腈(90∶10)為流動相A,水(含0.06%七氟丁酸)為流動相B,等度洗脫,流速250 μL/min,進樣量1 μL。(3)質(zhì)譜條件:TSQ VANTAGE型三重四極桿液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀,電離氣壓3 998.65 V,離子源為電噴霧(ESI),噴霧氣體為氮氣,噴霧器壓力30 PSI,氣體流速10 L/min,離子源溫度200.42 ℃,掃描類型MS2SRM,掃描范圍300～2 000 M/Z。(4)標準曲線質(zhì)譜采集:工作模式為選擇反應檢測掃描(SRM)模式,采集賴氨酸碎片離子峰84.2、67.1、56.2(147 M/Z),同位素標記賴氨酸碎片離子峰88.2、70.2、56.2(151 M/Z),選擇兩種物質(zhì)在碎片離子峰56.2的峰面積比值作標準曲線,糖化賴氨酸碎片離子峰84.2、248.4、130.0(311 M/Z),同位素標記糖化賴氨酸碎片離子峰84.2、270.1、189.1(317 M/Z),選擇兩種物質(zhì)在碎片離子峰84.2的峰面積比值作標準曲線;ID-LC/MS/MS法測定GA水平單位為mmol/mol,根據(jù)公式將其轉(zhuǎn)化為酶法常用單位%,GA(%)=0.056 52×GA(mmol/mol)-0.042 17。

1.3.3 一致性評價 將兩種方法檢測結(jié)果分別按照各試劑提供的參考范圍和本研究初步評估建立的參考范圍上限為標準,高于標準為陽性,低于標準為陰性;采用Kappa一致性檢驗評價兩種方法測定結(jié)果一致性,Kappa=(Po-Pe)/(1-Pe),Po為每一類正確分類的樣本數(shù)量之和除以總樣本數(shù),即實際一致率,Pe為理論一致率。

1.3.4 精密度評價 根據(jù)ELISA 測定值得到GA低、中、高水平樣本,將水平相近樣本混合制備血清GA 候選標準品,連續(xù)測定5 d,每天測定4次;計算兩個水平重復度和實驗室內(nèi)不精密度,分別用Sr和S1表示,確認其精密度范圍是否與廠商標注精密度符合,以基于生物學變異的精密度質(zhì)量規(guī)范(<2.6%)為質(zhì)量目標[5],將測定的精密度與質(zhì)量目標進行比較,以確保試驗結(jié)果可接受的醫(yī)學實用性。Sr=D 為測試總天數(shù),n為每天重復次數(shù),Xdi為第d天第i次測定結(jié)果。

1.3.5 正確度評價 ELISA 法測定3個水平GA 標準物(JCCRM611-1HH),由同位素稀釋質(zhì)譜法(ID/MS)賦值,認證值為31.1%;計算測定值與認定值的相對偏差,正確度(%)=(測定值-認證值)/認證值×100%,以小于1/2允許總誤差(±5%)為判斷標準[6],確保試驗結(jié)果正確度。

1.3.6 質(zhì)量控制 每個樣本連續(xù)測定3次,且在同一批內(nèi)完成測定,兩種檢測方法測定樣本在30 d內(nèi)完成。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用Microsoft Excel2010軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計。非正態(tài)分布的計量資料用M(P25,P75)表示。Passing-Bablok回歸計算兩種方法斜率、截距的95%置信區(qū)間(95%CI),Bland-Altman圖分析兩種方法平均偏差,以Kappa值作為兩種方法一致性評價結(jié)果,以Kappa值≥0.75表示兩者一致性較好,0.40～0.75表示兩者一致性一般,<0.40表示兩者一致性較差。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ID-LC/MS/MS測定血清GA 水平 血清GA水平檢測結(jié)果為偏態(tài)分布,ID-LC/MS/MS檢測血清GA 水平為18.73%(13.21%,22.48%)。

2.2 ELISA 測定血清GA 水平 檢測結(jié)果為偏態(tài)分布,ELISA 檢測血清GA 水平為15.36%(11.14%,18.78%)。

2.3 兩種方法檢測血清GA 水平的一致性評價Passing-Bablok回歸分析結(jié)果顯示,兩種方法檢測血清GA 水平的斜率和截距的95%CI分別為0.911～1.157,0.114～0.487,斜率的95%CI包含1,但截距的95%CI未包含0,見圖1。Bland-Altman圖顯示,兩種方法檢測血清GA 水平的差值均數(shù)為3.78%,低于臨床最低要求(4.5%),見圖2。兩種方法檢測血清GA 水平的一致性較高(Kappa=0.814)。

圖1 ID-LC/MS/MS和ELISA 測定血清GA 水平的Passing-Bablok回歸圖

圖2 ID-LC/MS/MS和ELISA 測定血清GA 水平的Bland-Altman圖

2.4 ELISA 方法學評價

2.4.1 精密度 ELISA 測定各樣品血清GA 水平變異系數(shù)(CV)均低于廠家提供近似水平標準品CV。見表1。

表1 精密度評價結(jié)果

2.4.2 正確度 ELISA 測定各樣品血清GA 水平測定值與認定值的相對偏差均小于1/2允許總誤差,在可接受范圍。見表2。

表2 正確度評價結(jié)果

3 討論

目前臨床GA 檢測方法尚無統(tǒng)一的參考標準,因此,無法避免因采用單位或溯源性不同導致的結(jié)果差異較大[7-8]。近年來隨著液相色譜和質(zhì)譜技術發(fā)展,LC/MS/MS 成為目前研究的熱點。而探索與IDLC/MS/MS一致性較高,且具有簡便、高效、經(jīng)濟的檢測方法,對臨床大規(guī)模應用具有重要意義[9]。ELISA 主要將蛋白、抗體或激素等直接或間接固定于固相載體,再加入一級檢測抗體形成抗原抗體復合物,從而檢測樣本中抗原水平,具有操作簡便、價格較低、靈敏度高等優(yōu)點。有研究對比了LC/MS/MS和ELISA 性能發(fā)現(xiàn),兩者在檢測血清25-羥基維生素D水平上一致性較好,且以LC/MS/MS為“金標準”作為參考,ELISA 診斷維生素D 缺乏的靈敏度和特異度較 高[10]。ID-LC/MS/MS 是 在LC/MS/MS 基 礎上增加了同位素標記技術,具有更高的靈敏度和特異度[11]。任文華等[12]研究指出,ID-LC/MS/MS 測定血清GA 精密度高、正確性好,與常規(guī)酶法相關性較好,推薦作為我國測定GA的候選參考方法。但由于ID-LC/MS/MS對檢測設備及樣品質(zhì)量要求較高,操作費時,費用較高,不利于基層醫(yī)院推廣和大規(guī)模篩查[13]。

本研究中,ELISA 采用的是英國Abbexa公司生產(chǎn)的GA 檢測試劑盒,結(jié)果顯示ELISA 檢測血清GA水平為15.36%(11.14%,18.78%),在ID-LC/MS/MS測定血清GA 水平[18.73%(13.21%,22.48%)]范圍內(nèi),提示ELISA 在血清GA 檢測中具有一定應用價值;ELISA 檢測血清GA 水平與以往報道的結(jié)果[14-15]存在差異,分析原因與檢測系統(tǒng)、參考范圍等有關。一致性評價中,Passing-Bablok回歸分析顯示兩種方法檢測血清GA 水平斜率的95%CI包含1,但截距的95%CI未包含0,提示兩種方法間不存在系統(tǒng)和比例誤差,Bland-Altman圖顯示兩種方法檢測血清GA水平的平均偏差低于臨床最低要求(3.78%vs.4.5%),通過計算Kappa值發(fā)現(xiàn),兩種方法檢測血清GA水平的一致性較高,提示ELISA 有可能成為IDLC/MS/MS的有效替代方法。進一步對ELISA 進行方法學評價發(fā)現(xiàn),ELISA測定各樣品血清GA 水平CV均低于廠家提供近似水平標準品CV,提示其符合基于生物學變異的精密度質(zhì)量規(guī)范;ELISA 法測定各樣品血清GA 水平測定值與認定值的相對偏差均小于1/2允許總誤差,在可接受范圍內(nèi),提示其準確度較高。

綜上所述,ELISA 與ID-LC/MS/MS 測定血清GA 具有良好一致性,均能滿足臨床要求,以ID-LC/MS/MS為參考,ELISA 具有良好的正確度和精密度,且操作簡單、費用相對較低,可用于臨床大規(guī)?？焖贆z測。