李 勤,凌莉琴,劉超男,陳 思,周 靜

四川大學(xué)華西醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)科,四川成都 610041

血小板功能檢測(cè)廣泛應(yīng)用于臨床出血性疾病的診斷以及抗血小板藥物的治療監(jiān)測(cè)[1-3]。光透射血小板聚集檢測(cè)(LTA)被認(rèn)為是評(píng)價(jià)血小板聚集功能的“金標(biāo)準(zhǔn)”[4],其檢測(cè)原理是富血小板血漿(PRP)標(biāo)本在誘導(dǎo)劑作用下發(fā)生血小板聚集,使血漿濁度降低,透光度增加,儀器將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)經(jīng)過放大和信號(hào)處理后,得到各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的聚集率以及全檢測(cè)過程的聚集曲線。

血小板聚集率結(jié)果的可信度受采血、分離、誘導(dǎo)劑效價(jià)和比色等環(huán)節(jié)的分析前質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)化操作影響。傳統(tǒng)LTA 操作步驟多,影響因素較多,結(jié)果重復(fù)性較低。因此,血小板聚集功能檢測(cè)儀器的自動(dòng)化需求越來越大。目前,廠商研制出了一種新型的全自動(dòng)血小板聚集分析儀LBY-NJ4A,可滿足大樣本量檢測(cè),但投入臨床應(yīng)用的時(shí)間尚短,相關(guān)研究較少,其應(yīng)用價(jià)值仍有待進(jìn)一步評(píng)估[5]。因此,本文根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)的儀器性能評(píng)價(jià)方法[6]及美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室修正法規(guī)(CLIA'88)的評(píng)價(jià)方法[7],評(píng)價(jià)并比較LBY-NJ4A 與實(shí)驗(yàn)室常用的手動(dòng)儀器Chrono-log700的主要性能指標(biāo),并對(duì)廠家提供的參考范圍進(jìn)行驗(yàn)證,為今后血小板聚集儀的臨床應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取試驗(yàn)當(dāng)天本院收治的住院患者80例為研究對(duì)象。其中血小板最大聚集率(MAR)大于參考范圍上限(高聚集率組)40例(急性腦梗死20例,急性冠脈綜合征20例);MAR 小于參考范圍下限(低聚集率組)40例(抗血小板藥物治療20例,肝硬化20例)。同時(shí)選取體檢健康者40例,其中男20例,女20例,肝、腎、內(nèi)分泌功能以及血常規(guī)、凝血功能指標(biāo)等均在正常范圍內(nèi),采血前2周內(nèi)未服用任何影響血小板功能的藥物。

1.2 儀器與試劑 血小板聚集分析儀(Chronolog700,美國(guó);LBY-NJ4A,中國(guó));全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(SysmexXN-9000,日本);以終濃度5 μmol/L腺苷二磷酸(ADP)、500 μg/mL 花生四烯酸(AA)、4 μg/mL 膠原(COL)為誘導(dǎo)劑,3種誘導(dǎo)劑均購(gòu)于泰利信醫(yī)療科技有限公司。用LTA 方法測(cè)定5 min 內(nèi)的MAR。

1.3 方法 所有血液標(biāo)本均使用美國(guó)BD 公司生產(chǎn)的109 mmol/L枸櫞酸鈉1∶9抗凝真空采血管采集空腹血。全血標(biāo)本以160×g離心10 min獲得PRP,2 000×g離心10 min獲得乏血小板血漿(PPP)。標(biāo)本從開始采集到檢測(cè)結(jié)束時(shí)間控制在3 h內(nèi)。

1.3.1 批內(nèi)精密度 選擇患者兩個(gè)水平的混合血漿標(biāo)本,分別在兩種儀器上檢測(cè)ADP 最大聚集率(MARADP)、AA 最大聚集率(MARAA)和COL最大聚集率(MARCOL),連續(xù)檢測(cè)10次,計(jì)算均值)、標(biāo)準(zhǔn)差(s)和變異系數(shù)(CV)。

1.3.2 日間精密度 使用廠家提供的兩個(gè)水平的標(biāo)準(zhǔn)濁度物,分別在兩種儀器上檢測(cè)MARADP、MARAA和MARCOL,每天1 次,連續(xù)檢測(cè)20 d,計(jì)算、和CV。

1.3.3 通道一致性 分別使用ADP、AA 和COL 3種誘導(dǎo)劑進(jìn)行通道一致性評(píng)價(jià)。以ADP 為例,LBYNJ4A 4個(gè)不同通道 (Chrono-log700 兩個(gè)不同通道)測(cè)定同一標(biāo)本的MARADP,每個(gè)通道各檢測(cè)5 次。LBY-NJ4A 4個(gè)不同通道的測(cè)定值使用單因素方差分析,Chrono-log700 兩個(gè)不同通道的測(cè)定值使用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。此外,計(jì)算各通道均值),以通道1為標(biāo)準(zhǔn)通道,計(jì)算其余通道與通道1測(cè)定均值的相對(duì)偏差(RD)100%,i=2、3、4。

1.3.4 參考范圍驗(yàn)證 以ADP、AA、COL 為誘導(dǎo)劑,兩種儀器分別測(cè)定40 例體檢健康者PRP的MAR。根據(jù)CLSI 頒布的EP28-A3C[6]文件,若40例健康體檢者中落在參考范圍外的測(cè)定值不超過4例(R≥90%,R=落在參考區(qū)間例數(shù)/實(shí)測(cè)例數(shù)×100%),認(rèn)為該參考范圍可以作為臨床使用,否則應(yīng)考慮重新建立適用的參考范圍。

1.3.5 抗干擾能力 收集多個(gè)水平PRP 為基礎(chǔ)樣品,按不同比例混合分成5組。分別加入已知終濃度的生物性干擾物血紅蛋白(Hb)、總膽紅素(TBIL)和三酰甘油(TG)。測(cè)定并記錄加入干擾物前后的標(biāo)本MAR,計(jì)算干擾率(%)=(干擾物后檢測(cè)結(jié)果-干擾物前檢測(cè)結(jié)果)/干擾物前檢測(cè)結(jié)果×100%。要求加入干擾物后的PRP 中血小板水平不低于100×109/L,以避免血小板水平過低對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成影響[8]。

1.3.6 儀器間相關(guān)性 分別以ADP、AA、COL為誘導(dǎo)劑,LBY-NJ4A 為檢測(cè)儀器,Chrono-log700為對(duì)照儀器,對(duì)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算R、回歸方程。

1.3.7 攜帶污染率 分別以ADP、AA、COL為誘導(dǎo)劑,在LBY-NJ4A 上用高值PRP和低值PRP兩份標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)測(cè)定3次,檢測(cè)結(jié)果分別為H1、H2、H3、L1、L2、L3,并按公式計(jì)算攜帶污染率(%)=(L1-L3)/(H3-L3)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 批內(nèi)精密度 兩種儀器測(cè)定的MARADP、MARAA和MARCOL批內(nèi)精密度的CV為4.3%～4.9%,均符合CLSI EP5-A2文件推薦的小于5%的標(biāo)準(zhǔn),見表1。

表1 批內(nèi)精密度結(jié)果(%)

2.2 日間精密度 兩種儀器測(cè)定MARADP、MARAA和MARCOL日間精密度的CV為3.5%～4.8%,符合CLSI EP5-A2標(biāo)準(zhǔn),見表2。

表2 日間精密度結(jié)果(%)

2.3 通道一致性 兩種儀器的通道一致性均符合CLIA'88的標(biāo)準(zhǔn),即通道間測(cè)定值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),通道間測(cè)定值RD≤1/2 總允許誤差(10%),見表3。

表3 儀器各通道測(cè)定結(jié)果(%)

2.4 參考范圍驗(yàn)證 以ADP、AA 和COL 為誘導(dǎo)劑,40例體檢健康者在LBY-NJ4A 上的檢測(cè)結(jié)果,全部在LBY-NJ4A 廠家提供的參考范圍內(nèi);在Chronolog700上的檢測(cè)結(jié)果,≥95%在Chrono-log700廠家提供的參考范圍內(nèi)。兩種儀器的參考范圍驗(yàn)證均符合CLSI EP28-A3C要求。見表4。

表4 MARADP、MARAA、MARCOL 參考范圍驗(yàn)證(n=40)

2.5 抗干擾能力 終濃度為156 mg/L的Hb和3.7 g/L的TG 不影響兩種儀器的檢測(cè)結(jié)果(干擾率均小于廠家給定的批內(nèi)變異率10%);終濃度為240 mg/L的TBIL不影響LBY-NJ4A 檢測(cè)結(jié)果(5個(gè)標(biāo)本檢測(cè)干擾率<10%),但可影響Chrono-log700檢測(cè)結(jié)果(3個(gè)標(biāo)本檢測(cè)干擾率>10%),見表5。

表5 干擾物對(duì)儀器檢測(cè)MARADP的影響(%)

2.6 儀器間相關(guān)性 ADP、AA、COL 為誘導(dǎo)劑時(shí),兩儀器相關(guān)系數(shù)r分別為0.847、0.915 和0.929(P<0.05),儀器相關(guān)性好。

2.7 攜帶污染率 LBY-NJ4A 攜帶污染率符合廠家要求(≤5.00 %),見表6。

表6 LBY-NJ4A 攜帶污染率測(cè)定結(jié)果(%)

3 討論

血小板具有黏附、聚集、釋放等生理功能[9]。其聚集特性不僅在生理止血中發(fā)揮重要作用,也是病理血栓形成的首要因素之一[10-12]。血小板膜上存在ADP受體,當(dāng)其與ADP 結(jié)合可使血小板發(fā)生聚集。ADP來源于血管損傷部位發(fā)生血小板黏附后的損傷組織及紅細(xì)胞,但血小板釋放的內(nèi)源性ADP 是主要的血小板誘導(dǎo)劑[13-14]。除ADP 外,AA、COL 和瑞氏托霉素等也可使血小板發(fā)生聚集,并誘發(fā)血小板釋放內(nèi)源性ADP進(jìn)一步促進(jìn)聚集。目前,血小板聚集功能檢測(cè)已成為常規(guī)檢驗(yàn)項(xiàng)目,血小板聚集功能檢測(cè)可對(duì)血栓性疾病和出血性疾病的診斷和治療進(jìn)行評(píng)估,還可以對(duì)抗血小板聚集藥物的臨床效果進(jìn)行初步評(píng)估,具有很好的臨床指導(dǎo)性。

LTA 至今被認(rèn)為是世界范圍內(nèi)血小板聚集功能檢查的“金標(biāo)準(zhǔn)”,傳統(tǒng)LTA 操作步驟多,包括制備PRP和PPP標(biāo)本、檢測(cè)標(biāo)本原始透光度、手動(dòng)加入誘導(dǎo)劑、實(shí)時(shí)檢測(cè)透光度變化等,因此標(biāo)本檢測(cè)周期較長(zhǎng),影響因素較多,結(jié)果不夠穩(wěn)定。為此,采用自動(dòng)化儀器檢測(cè)血小板聚集功能的臨床需求越來越受到重視。

本研究對(duì)傳統(tǒng)手工法Chrono-log700與自動(dòng)化儀器LBY-NJ4A的檢測(cè)性能進(jìn)行了比較。由于血小板聚集功能檢測(cè)的特殊性(體外血小板易被激活,不易保存及運(yùn)輸),本研究利用儀器間相關(guān)性分析,對(duì)Chrono-log700與LBY-NJ4A的檢測(cè)結(jié)果相互驗(yàn)證正確度。結(jié)果表明Chrono-log700 與LBY-NJ4A的檢測(cè)結(jié)果具有良好的相關(guān)性(r>0.8)。另外,兩種儀器均具有良好的精密度、通道一致性和臨床實(shí)用的參考范圍區(qū)間。因此,兩種儀器均滿足血小板聚集功能檢測(cè)的基本要求。

LTA 為比濁法,檢測(cè)過程易受血漿中的一些具有光散射性物質(zhì)如Hb、TG、TBIL 等的影響,造成檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確[15]。本研究結(jié)果表明終濃度為156 mg/L的Hb和3.7 g/L的TG 不影響兩種儀器的檢測(cè)結(jié)果,表明兩種儀器對(duì)Hb及TG 抗干擾能力均較強(qiáng);而終濃度為240 mg/L的TBIL 不影響LBYNJ4A 檢測(cè)結(jié)果,但可影響Chrono-log700檢測(cè)結(jié)果,表明LBY-NJ4A 抗TBIL 干擾能力優(yōu)于Chronolog700。Chrono-log700檢測(cè)過程為手工加樣,不涉及管道系統(tǒng)和加樣針,無攜帶污染率;而LBY-NJ4A 為自動(dòng)化檢測(cè)過程可避免人為誤差,保證標(biāo)準(zhǔn)化操作,雖有一定的攜帶污染率(3.27%～4.17%),但也符合廠家要求(≤5.00%)。

綜上所述,LBY-NJ4A 與Chrono-log700 均符合CLSI、CLIA'88及廠家的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn),可用于檢測(cè)血小板聚集功能。但LBY-NJ4A 抗干擾能力更強(qiáng),自動(dòng)化程度較高,人工需求較少,因此LBY-NJ4A 將更有利于實(shí)驗(yàn)室大樣本量工作的開展。