邢菊玲，劉芬，馮萌，黃天來，周欣欣

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510006）

糖尿病是因胰島素分泌和（或）作用缺陷而導(dǎo)致血糖水平升高的一種復(fù)雜的代謝性疾病。糖尿病在全球患病率不斷攀升，我國為糖尿病的高發(fā)地區(qū)[1-5]。根據(jù)發(fā)病機制不同，糖尿病可分為1型糖尿病和2型糖尿病[2-3]，而2型糖尿病作為主要的糖尿病類型，占糖尿病患者的90%以上。2型糖尿病是指由遺傳和環(huán)境因素相互作用而引起的一種代謝異常綜合征，以慢性高血糖為主要特征，具有起病隱匿、潛伏期長的特點[4]。目前，針對2型糖尿病的治療西醫(yī)多采用羅格列酮、二甲雙胍等調(diào)脂類藥物，一方面可以增加肝臟、肌肉、脂肪組織對胰島素的敏感性，另一方通過減少糖原生成，增加葡萄糖外周利用而降低血糖，但長時間用藥會造成肝腎功能和消化系統(tǒng)的損傷，效果不夠理想[6]。

糖尿病歸屬于中醫(yī)學(xué)“消渴”病的范疇，常表現(xiàn)為乏力、多飲、多食、多尿等癥狀，臨床多采用生津止渴、益氣養(yǎng)陰、輸津澀精等方法予以治療。大量研究表明，中藥在改善2型糖尿病療效顯著，具有多環(huán)節(jié)、多靶點以及多途徑用藥價值，且用藥后安全性較高[7]。復(fù)方黃芪散出自北宋《圣濟總錄》，由黃芪、葛根、桑白皮（1∶2∶1）組成，原文記載其可“治三消渴疾，肌膚瘦弱，飲水不止，小便不利”。方中：黃芪補氣生津以止渴，善治氣虛津虧的消渴證；葛根升發(fā)清陽，鼓舞脾胃清陽之氣上升而生津止渴，輸津液以溉五臟而滋陰清熱，生用善治陰虛消渴；桑白皮甘寒瀉火，滋陰潤燥，以甘寒之性制黃芪稍熱之性，以益氣生津，善治氣陰不足消竭；三藥配伍共奏益氣健脾、滋陰清熱、生津止渴功效，三消并治，標(biāo)本兼顧。本課題組前期研究[8-12]表明，黃芪散可改善2型糖尿病模型大鼠糖脂代謝紊亂、調(diào)節(jié)內(nèi)外源性脂代謝失衡及提高胰島素敏感性，降低體質(zhì)系數(shù)，起到降脂和減肥作用，同時可以改善糖尿病性心肌病和糖尿病性的骨質(zhì)疏松。但中藥復(fù)方組方成分復(fù)雜，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不明確，且相關(guān)機制解釋較困難，因此，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對黃芪散活性成分及其作用靶點進行“分子-靶點-通路-疾病”的多層次網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，闡明黃芪散治療2型糖尿病可能存在的分子機制，以期為今后黃芪散治療2型糖尿病的研究提供新的思路和方法?，F(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 黃芪散活性化合物及靶標(biāo)蛋白的篩選通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺[13]（TCMSP）（http://tcmspw.com/tcmsp.php），以“黃芪”“葛根”“桑白皮”為關(guān)鍵詞檢索黃芪散中的化學(xué)成分，篩選出口服生物利用度（OB）≥30%[14]和類藥性（DL）≥0.18[15]的化學(xué)成分作為活性成分及相關(guān)靶標(biāo)蛋白。

1.2 活性成分潛在靶點反向預(yù)測首先通過有機小分子生物活性數(shù)據(jù)庫PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/search/）搜索“1.1”項篩選的活性成分，得到簡化分子線性輸入規(guī)范SMILES（simplified molecular input line entry specification），再將各分子的SMILES式輸入Swiss Target Prediction在線網(wǎng)址（http://www.swisstargetprediction.ch/[16]），種屬設(shè)置為Homo sapiens（Human），Probability≥0.85，得到所選成分潛在靶點的預(yù)測結(jié)果，將TCMSP得到的靶標(biāo)蛋白和反向預(yù)測得到的潛在靶點匯總，得到最后的成分靶標(biāo)。

1.3 疾病靶點的篩選通過人類基因數(shù)據(jù)庫GeneCards（http://www.genecards.org/）和在線人類孟德爾遺傳（OMIM）數(shù)據(jù)庫（http://www.omim.org/），以“type 2 diabetes”“T2DM”和“diabetes mellitus type 2”為關(guān)鍵詞進行檢索，得到與2型糖尿病相關(guān)的基因，其中GeneCards數(shù)據(jù)庫以相關(guān)性分數(shù)（relevance score）≥30[17]作為篩選條件，將篩選結(jié)果歸納整理得到2型糖尿病疾病的靶標(biāo)。

1.4 藥物靶點與疾病靶點標(biāo)準(zhǔn)化及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建通過靶點標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)庫UniProt（https://www.uniprot.org/）分別上傳上述得到的藥物成分靶點與疾病靶點的名稱（target name），蛋白種屬設(shè)置為Homo sapiens（Human），獲取其靶點的標(biāo)準(zhǔn)基因名。并通過Cytoscape 3.6.1軟件（http://www.cytoscape.org/）構(gòu)建化合物成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，分析化合物和靶點間的度（Degree）值。

1.5 蛋白質(zhì)相互作用（PPI）的構(gòu)建及其核心網(wǎng)絡(luò)的篩選首先通過Venny 2.1軟件將標(biāo)準(zhǔn)化的成分靶點與疾病靶點取交集，得到交叉共有的靶蛋白基因名，即潛在靶點，再將潛在靶點導(dǎo)入在線網(wǎng)站STRING 10.5（https://string-db.org[18]），選 用Multiple Proteins工具，種屬設(shè)置為Homo sapiens（Human），獲取PPI關(guān)系，根據(jù)最高級篩選條件“highest confidence（≥0.9）”，得到聯(lián)系最緊密的PPI網(wǎng)絡(luò)，并保存TSV格式文件。將文件中的node1、node2、combined score整理導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件進行網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)分析。網(wǎng)絡(luò)中靶點大小和顏色可反映節(jié)點Degree值。并通過軟件的Merge功能將上述的成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)與蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)合并，得到疾病-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，利用插件Network Analyzer分析網(wǎng)絡(luò)節(jié)點Degree值，計算基因靶點的平均值，篩選出節(jié)點Degree值高于平均值的節(jié)點作為核心靶點。

1.6 基因本體論（GO）生物過程和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析將上述篩選出的核心靶點導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/[19]），種屬設(shè)置為Homo sapiens（Human），靶基因名選擇官方名稱（Office-gene-symbol），進行GO生物學(xué)過程富集分析和KEGG信號通路富集分析。以P＜0.05作為篩選條件，選取符合條件的GO生物過程和KEGG通路，并根據(jù)P值從小到大排序，選擇P值在前20位的通路進行可視化處理。

1.7 分子對接利用MOE（Molecular Operating Environment）2015軟件對黃芪散的部分核心靶點與主要活性成分進行分子對接。通過PubChem CID（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound）下載包括quercetin、kaempferol等15個活性成分的三維結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入MOE軟件進行能量優(yōu)化，并保存為MDB文件作為之后分子對接的配體。通過PDB數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）下載ESR1和JUN的3D晶體結(jié)構(gòu)（PDBID：1A52和5FV8，分辨率：2.8?和1.99?），導(dǎo)入Moe軟件，刪除不相關(guān)的配體與水分子，并基于AMBER10：EHT力場和R-field隱式溶劑模型，通過LigX模塊優(yōu)化蛋白的質(zhì)子化狀態(tài)及氫原子的位置，保存作為分子對接的受體，之后，通過MOE軟件中的對接模塊Dock預(yù)測受體與配體之間的的結(jié)合能力，并通過London dG和GBVI/WSA dG打分函數(shù)對活性成分與靶標(biāo)蛋白相互作用進行評分。對接打分越低（即能量越低），表示結(jié)合構(gòu)型越穩(wěn)定。

2 結(jié)果

2.1 活性化合物的篩選通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索得到黃芪散化學(xué)成分共299個，其中，黃芪87個，葛根18個，桑白皮194個，以O(shè)B≥30%和DL≥0.18篩選后，獲得黃芪散的活性成分共50個（見表1），其中，黃芪19個、葛根4個、桑白皮32個。其中，白樺脂酸（mairin）、山柰酚（kaempferol）和槲皮素（quercetin）為黃芪-桑白皮所共有，刺芒柄花素（formononetin）為黃芪-葛根所共有，beta-谷甾醇（beta-sitosterol）為葛根-桑白皮所共有。

表1 黃芪散活性成分篩選結(jié)果Table 1 Screening results of active ingredients of Huangqi San

2.2 化學(xué)成分靶點預(yù)測結(jié)果通過TCMSP平臺，共得到成分靶標(biāo)924個（黃芪448個、葛根68個、桑白皮408個），通過Swiss Target Prediction服務(wù)器篩選補充得到170個，結(jié)合TCMSP和Swiss Target Prediction刪除重復(fù)基因后共得到成分靶點基因246個。

2.3 疾病靶點預(yù)測結(jié)果通過GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索2型糖尿病的關(guān)鍵詞，共得到10 777個與2型糖尿病相關(guān)的基因，經(jīng)過篩選最終得到580個。通過OMIM數(shù)據(jù)庫補充基因83個，最后得到663個疾病候選靶點基因。

2.4 成分-藥物靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將上述50個藥物活性成分與246個成分靶點輸入Excel文件并進行屬性編排，導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件得到黃芪散活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，圖中橢圓代表藥物作用的靶點，長方形代表藥物活性成分，三角形代表藥物，共得到287個節(jié)點，2 748條邊，見圖1。網(wǎng)絡(luò)中的50個化合物中有12個未參與網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，因此節(jié)點由246個基因、38個藥物活性成分和3個藥物組成，而每條邊則表示不同節(jié)點與節(jié)點之間的相互作用關(guān)系，可見一個藥物對應(yīng)多種成分，一種成分對應(yīng)多個靶點，反過來一個靶點也對應(yīng)多種成分，從而更加直觀地體現(xiàn)了中藥復(fù)方多成分、多靶點的特點。在網(wǎng)絡(luò)中，一個節(jié)點與其他節(jié)點的連線越多，節(jié)點Degree值越大，其化合物或者靶點在網(wǎng)絡(luò)中作用也越關(guān)鍵。黃芪散成分-靶點網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點Degree值＞20的靶點有PTGS2、PTGS1、PPARG、PRSS1、AR、NOS2、NCOA2、ESR1、RXRA、ACHE、SCN5A、ESR2、GSK3B、ADRB2、GABRA1和PGR，節(jié)點Degree值＞20的成分有槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、刺芒柄花素（formononetin）、beta-谷甾醇（beta-sitosterol）、7-O-甲基異丙醇胺（7-O-methylisomucronulatol）、異鼠李素（isorhamnetin）、桑根酮F（sanggenone F）和桑辛素（moracin D）等。

圖1 黃芪散活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖Figure 1 Active ingredient-target network diagram of Huangqi San

（續(xù)表1）

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建通過Uniport得到成分與疾病靶標(biāo)蛋白的標(biāo)準(zhǔn)基因名，導(dǎo)入Venny 2.1軟件繪制韋恩圖（見圖2），得到成分和疾病共有潛在靶點98個。主要有誘導(dǎo)型一氧化氮合酶2（NOS2）、前列腺素G/H合成酶1（PTGS1）、前列腺素G/H合成酶2（PTGS2）、雌激素受體1（ESR1）、過氧化物酶體增殖因子活化受體γ（PPARG）、絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）、糖原合酶激酶3β（GSK3B）、白細胞介素6（IL6）、乙酰膽堿酯酶（ACHE）等。將得到的98個潛在靶點導(dǎo)入STRING平臺，設(shè)置“highest confidence≥0.9”，得到PPI網(wǎng)絡(luò)，并下載導(dǎo)出TSV格式文件，將文件中的node1、node2、combined score信息整理導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件進行網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)分析，見圖3，節(jié)點Degree和節(jié)點之間的combined score可分別反映靶點大小和顏色及邊的粗細，該網(wǎng)絡(luò)有88個節(jié)點，361條邊組成。通過Cytoscape 3.6.1軟件的Merge功能將成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)與PPI網(wǎng)絡(luò)合并，得到疾病-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖（見圖4，Degree值越大，節(jié)點越大），并利用插件Network Analyzer分析網(wǎng)絡(luò)節(jié)點Degree。Degree值越大，則節(jié)點越大。網(wǎng)絡(luò)中共有284個節(jié)點和953條邊，其中，38個是成分節(jié)點，246個是基因節(jié)點，成分節(jié)點和基因節(jié)點的平均Degree值為15.58和5.34，成分節(jié)點Degree值大于平均Degree值 的 有quercetin（193），kaempferol（64）、7-Omethylisomucronulatol（32）、isorhamnetin（30）、Formononetin（27）、beta-sitosterol（26）、3，9-di-O-methylnissolin（19）、hederagenin（16）、（6aR，11aR）-9，10-dimethoxy-6a，11a-dihydro-6Hbenzofurano[3，2-c]chromen-3-ol（18）9個成分，基因節(jié)點Degree值大于平均Degree值的有包括ESR1（37）、JUN（34）、PTGS2（34）、AKT1（34）、MAPK14（31）等在內(nèi)的75個基因，見表2。

表2 黃芪散關(guān)鍵基因的基本信息Table 2 Basic information of key genes of Huangqi San

圖2 黃芪散治療2型糖尿病的活性成分靶點-疾病靶點韋恩圖Figure 2 Venn diagram of targets of active ingredientdisease in Huangqi San for treatment of T2DM

圖3 黃芪散治療2型糖尿病共有靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)Figure 3 PPI network of common targets in Huangqi San for treatment of T2DM

圖4 黃芪散治療2型糖尿病的疾病-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)Figure 4 Disease-component-target network in Huangqi San for treatment of T2DM

2.6 GO生物過程和KEGG通路富集分析利用DAVID數(shù)據(jù)庫，將上述得到的75個靶蛋白基因上傳并進行GO生物過程及KEGG信號通路的富集分析。以P＜0.05作為篩選條件，共得到了113個GO條目，并按照P值從小到大的順序，選取前20個GO生物過程分析條目，主要包括類固醇激素受體活性、蛋白酪氨酸激酶活性、核受體活性、泛素蛋白連接酶結(jié)合、生長因子受體結(jié)合、細胞因子活性等生物過程，具體結(jié)果見表3。另外，KEGG結(jié)果分析，共富集到157條信號通路（P＜0.05），按照P值從小到大的順序篩選前20條，主要涉及到糖尿病并發(fā)癥晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）信號通路、流體剪應(yīng)力與動脈粥樣硬化、乳腺癌、結(jié)直腸癌、乙型肝炎、丙型肝炎肺炎、缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）信號通路、IL-17信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-Akt信號通路等，見圖5~圖6。此外，KEGG結(jié)果還包含一些常見的治療糖尿病的信號通路，如胰島素抵抗（insulin resistance）通路、AMPK信號通路、MAPK信號通路、PPAR信號通路和Toll樣受體信號通路等。

圖5 基因本體論（GO）分析氣泡圖Figure 5 Bubble charts of gene ontology（GO）analysis

圖6 京都基因與基因組百科全書（KEGG）分析氣泡圖Figure 6 Bubble charts of Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）analysis

2.7 分子對接本研究基于PPI網(wǎng)絡(luò)中Degree值較大的前2個核心靶點與15個活性成分進行能量匹配，根據(jù)對接打分選取最優(yōu)構(gòu)型，見表4。其平均對接打分為-5.54 kcal/mol，可見大部分配體均能與受體很好地結(jié)合，其中，異鼠李素（isorhamnetin）與ESR1對接打分最低，為-7.25 kcal/mol。異鼠李素（ID：5281654）結(jié)構(gòu)見圖7-A。ESR1蛋白結(jié)構(gòu)見圖7-B。docking后活性位點及相互作用關(guān)系見圖7-C和圖7-D：圖7-C中異鼠李素顯示為黃色，周圍活性口袋的氨基酸顯示為綠色，條帶顏色為白色；圖7-D中，綠色代表具疏水性的氨基酸，紫色代表極性作用不帶電荷或帶正負的氨基酸。因此可見，異鼠李素周圍存有Met421、Ile424、Phe404、Met434、leu428、leu391、leu349、leu346、leu387、leu384、Met388、leu525等疏水基團，Thr347、Gly521、His524等極性不帶電氨基酸殘基，Glu353極性帶負電的氨基酸和Arg394極性帶正電的氨基酸，表明較多的疏水性氨基酸在空間位置上包圍在化合物周圍，以范德華力為主導(dǎo)影響兩者相互作用，并且還與氨基酸殘基His524和Glu353產(chǎn)生氫鍵作用及l(fā)eu387的PI鍵作用。

表4 受體與配體的對接打分Table 4 The docking score of receptors and ligands

圖7 異鼠李素與ESR1相互作用的分子對接示意圖Figure 7 Molecular docking diagram of isorhamnetin interaction with ESR1

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是由英國鄧迪大學(xué)藥理學(xué)家Hopkins于2007年在Nature Bioteehnology雜志中首次提出，并定義為一門以系統(tǒng)生物學(xué)和多項藥理學(xué)為理論基礎(chǔ)，利用生物分子網(wǎng)絡(luò)分析方法，選取特定節(jié)點進行藥物設(shè)計和靶點分析的藥理學(xué)分支學(xué)科[20-21]。隨著人類物質(zhì)文明的高度發(fā)展，生活方式的改變，以及老齡化進程的加劇，人類疾病譜發(fā)生了很大的變化，以腫瘤、心血管疾病和糖尿病等為代表的慢性復(fù)雜病已成為威脅人類健康的重要因素。這些復(fù)雜疾病及并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展過程往往涉及機體的多個臟腑、多個靶點、多個基因以及多個信號通路[22]，因此，傳統(tǒng)“一個藥物、一個靶標(biāo)、一種疾病”的藥物理念已經(jīng)難以達到很好的治療目的。而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有“多基因、多靶點”的特點，同時中藥及其復(fù)方為多成分、多途徑、多靶點協(xié)同作用，這正與復(fù)雜疾病的治療理念想吻合，因此探索中藥及復(fù)方與多靶點多基因之間的復(fù)雜網(wǎng)狀關(guān)系，在闡述復(fù)雜疾病的發(fā)病機制及治療靶標(biāo)的研究方面具有重要的價值。黃芪散作為治療消渴病的經(jīng)典古方，秉承中醫(yī)藥的君臣佐使觀念和臟腑經(jīng)絡(luò)學(xué)說，三味藥相互配伍，相輔相成，相得益彰。因此，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建黃芪散-2型糖尿病的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，逐步分析了其活性成分、調(diào)控的靶點基因和體內(nèi)發(fā)生的生物過程和信號通路，系統(tǒng)整體地解釋了黃芪散在治療2型糖尿病中的作用。

本研究結(jié)果顯示，黃芪散的有效活性成分為38個，發(fā)揮治療2型糖尿病的關(guān)鍵成分有槲皮素、山柰酚、刺芒柄花素、beta-谷甾醇等。有研究表明，槲皮素能降低2型糖尿病大鼠的血糖，其機制可能與其降低機體氧化應(yīng)激水平，抑制胰島細胞凋亡有關(guān)[23]，還能通過激活胰腺組織中成纖維細胞生長因子21（FGF21）/AMPK信號通路來減輕大鼠外周胰島素抵抗[24]。山柰酚可以通過抑制胰島β細胞凋亡，促進增殖，保護胰島β細胞功能、改善胰島素敏感性以及調(diào)節(jié)胞內(nèi)甲狀腺激素代謝相關(guān)酶的活性，增加能量消耗來改善脂代謝紊亂，降低血糖[25]。另外，Oza等[26]的研究也表明，刺芒柄花素不僅可以改善糖尿病大鼠的葡萄糖耐量、胰島素敏感性和血脂狀況，還可以顯著地降低血液中的糖血紅蛋白，提高大鼠的肝糖原水平，同時，還可以保護胰島β細胞免受壞死和萎縮的影響。本研究結(jié)果與上述報道相符，說明黃芪散在治療2型糖尿病時具有多成分共同作用的特點。

本研究疾病-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)結(jié)果表明黃芪散有效成分可能是通過ESR1、JUN、PTGS2、AKT1、MAPK14等75個藥物成分與疾病的共同靶點起作用。郭姣教授于2017年首次提出“糖脂代謝?。℅lucolipid Metabolic Disease，GLMD）”概念，即糖脂代謝是一種以糖、脂代謝紊亂為特征，由遺傳、環(huán)境、精神等多種因素參與的疾病，以神經(jīng)內(nèi)分泌失調(diào)、胰島素抵抗、氧化應(yīng)激、炎癥、腸道菌群失調(diào)為核心病理，以高血糖、血脂失調(diào)、非酒精性脂肪肝、超重、高血壓及動脈粥樣硬化等單一或合并出現(xiàn)為主要臨床表現(xiàn)特點，需要綜合一體化治療[27]。因此，對今后的抗糖尿病的藥物提出了更高更全面的要求，不只是要單方面地降低血糖，同時還要具有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌失調(diào)，抗胰島素抵抗，抗炎抗氧化等作用。本研究中發(fā)現(xiàn)，黃芪散的核心靶點與上述糖脂代謝病的核心病理均密切相關(guān)，這些靶點可以大致分為六大類：一是神經(jīng)內(nèi)分泌因子類，有雄激素受體（AR）、雌激素受體α（ESR1）、雌激素受體β（ESR2）、類固醇受體激活蛋白（NCOA1、NCOA2）和綿羊孕酮受體（PGR）；二是胰島素抵抗類，有胰島素受體（INSR）、過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARA）、過氧化物酶體增殖因子活化受體γ（PPARG）、胰島素樣生長因子1受體（IGF1R）、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3（IGFBP3）、胰島素樣生長因子2（IGF2）；三是血管因子類，有一氧化氮合酶（NOS2、NOS3）、信號傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子1（STAT1）、血管內(nèi)皮細胞黏附分子1（VCAM1）、血管內(nèi)皮生長因子A（AVEGFA）、血管內(nèi)皮生長因子受體（KDR）、細胞間黏附分子1（ICAM1）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族的基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2和MMP9，以及調(diào)控誘導(dǎo)血管生成的調(diào)節(jié)因子MAPK家族（MAPK1、MAPK14、MAPK18）；四是炎癥因子類，包括BCL-2基因家族中的細胞凋亡促進基因（BAX、BCL2、BCL2L1）、白細胞介素（IL10、IL2、IL4、IL6、IL1A、IL1B），腫瘤壞死因子家族CD40LG及趨化因子CCL2；五是癌癥類，有RAF1、RB1、MYC、JUN癌基因以及與胃癌密切相關(guān)的SERPINE1；六是激酶及調(diào)節(jié)細胞生長、分裂、增殖、分化等生物過程的核基因類，有乙酰膽堿酯酶（ACHE）、β2腎上腺素能受體（ADRB2）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、糖原合成酶激酶3β（GSK3B）、絲氨酸蛋白酶1（PRSS1）、表皮細胞生長因子（EGF、EGFR、ERBB2）和核受體亞家族3C組成員1（NR3C1）。同樣，GO富集分析表明黃芪散涉及體內(nèi)的多個生物過程，因此，說明黃芪散在治療2型糖尿病時具有多靶點、多途徑協(xié)同作用的特點。

KEGG通路富集分析共得到了157條信號通路，其中AMPK通路、胰島素抵抗通路[28]、PPARα通路[12]、p53通路[29]均已在實驗中得到驗證，與本課題組前期研究結(jié)果一致，反映了本研究數(shù)據(jù)的可靠性。根據(jù)P值篩選到的前20條核心通路與2型糖尿病發(fā)病機制最密切，其中多條通路與2型糖尿病的并發(fā)癥相關(guān)，且已經(jīng)被實驗或臨床研究驗證。例如，孔莫維等[30]研究表明，糖尿病與諸多的癌癥（乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌等）均存在相互關(guān)系，與普通人群相比，糖尿病患者患癌癥的風(fēng)險會大大增加，可能機制在于糖尿病患者長期的高血糖狀態(tài)為腫瘤細胞存活及轉(zhuǎn)移提供了充足的條件，胰島素抵抗與高胰島素血癥狀態(tài)則通過促進胰島素樣生長因子（IGF）及其受體的高表達，發(fā)揮促進腫瘤細胞增殖及抗凋亡作用，糖尿病導(dǎo)致的慢性炎癥狀態(tài)也增加了腫瘤的發(fā)生風(fēng)險[31]。另外，患有乙肝或丙肝的患者也更容易發(fā)生糖尿病，可能機制是肝炎病毒感染后，隨著患病的時間不斷延長，患者的肝臟損傷程度不斷加重，機體葡萄糖代謝受到明顯影響，同時胰島素敏感性降低，容易出現(xiàn)胰島素抵抗、高胰島素血癥等，最終誘發(fā)糖尿病[32-33]。β-皰疹病毒亞科的雙鏈DNA病毒巨細胞病毒（CMV）與2型糖尿病也存在一定的相關(guān)性，胰島β細胞的功能失調(diào)被認為是誘發(fā)糖尿病的主要發(fā)病機制[34]。AGE-RAGE信號通路參與糖尿病的諸多并發(fā)癥，在糖尿病腎病中，AGEs-RAGE信號通路激活下游關(guān)鍵因子如NF-κB、VGEF、TGF-β1、MCP-1等基因，從而延緩糖尿病腎病的進展[35]。在糖尿病難愈合創(chuàng)面中，AGEs可通過兩個途徑（受體途徑、非受體途徑）發(fā)揮作用，受體途徑占主導(dǎo)地位，即通過與內(nèi)皮細胞等細胞膜上受體RAGE結(jié)合，激發(fā)多種細胞因子形成與釋放，改變機體神經(jīng)和血管的病理損傷[36]。在糖尿病神經(jīng)病變中，AGE的累積可能引起周圍神經(jīng)組織血液流速減慢，導(dǎo)致外周神經(jīng)缺血缺氧，因此清除循環(huán)的AGE可預(yù)防AGE對組織的損傷[37]。大量研究還表明IL-17信號通路、HIF-1信號通路、PI3K-Akt信號通路、流體剪應(yīng)力與動脈粥樣硬化、TNF信號通路在糖尿病的發(fā)生發(fā)展中亦發(fā)揮重要作用[38-42]。本研究結(jié)果結(jié)合已有報道發(fā)現(xiàn)，黃芪散可以通過干預(yù)以上多條通路來發(fā)揮治療作用，同時也表明，疾病的調(diào)控機制存在復(fù)雜且相互交叉的關(guān)系。

分子對接驗證結(jié)果表明，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出的關(guān)鍵成分與核心靶點ESR1和JUN均有較為穩(wěn)定的結(jié)合，其中，異鼠李素與ESR1的對接打分最低，相互作用越強，化合物構(gòu)象也愈穩(wěn)定，且相較于二甲雙胍，異鼠李素與ESR1打分最接近，表明異鼠李素在激活ESR1上表現(xiàn)出與二甲雙胍相類似的作用。

綜上所述，本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)，初步篩選和分析了黃芪散治療2型糖尿病的相關(guān)靶點，并探討了黃芪散治療2型糖尿病的潛在分子機制。但本研究仍存在一些不足，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于大數(shù)據(jù)背景進行的研究，具體機制尚需要進一步通過實驗加以驗證。本研究發(fā)現(xiàn)，黃芪散的核心靶點中抗炎因子占較大比例，但關(guān)于黃芪散的抗炎作用還未見報道，因此提出假設(shè)：黃芪散可能通過抑制炎癥因子分泌，參與抗炎抗氧化達到治療2型糖尿病的作用。另外，黃芪散在調(diào)控血管增生方面也占有很大的優(yōu)勢，可進一步探索黃芪散在治療2型糖尿病合并心血管疾病方面的作用，后期本課題組將針對性地開展相關(guān)體內(nèi)、體外實驗進行驗證。