柯雙橋，張婷，龐瑞明

（1.廣州中醫(yī)藥大學附屬寶安中醫(yī)院，廣東深圳 518000；2.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京 100000）

充血性心力衰竭（congestive heart failure，CHF）是指由于各種原因引起的心肌結(jié)構(gòu)和功能的改變并導致心室泵血和（或）充盈功能低下的臨床綜合征[1]。其發(fā)病機制和臨床防治的研究仍是現(xiàn)代醫(yī)學面臨的重大課題[2]。其臨床以胸痛、心悸、神疲、乏力等為主要表現(xiàn)，根據(jù)患者的不同癥狀表現(xiàn)，中醫(yī)學將心力衰竭歸屬于“喘證”“水腫”“心悸”等范疇。多數(shù)醫(yī)家認為CHF的病因病機為本虛標實，即氣虛陽虛為本，血瘀水泛為標[3]。心氣虛是CHF的病機基礎，是其發(fā)生的始動環(huán)節(jié)。心氣虛則無力溫運血脈，血行不暢，停而為瘀，終致心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展甚或惡化。黃芪是臨床常用的益氣中藥，味甘，性微溫，可補氣升陽、固表止汗、利水消腫，其性味功效與心力衰竭之病機相契合，在以益氣法治療心力衰竭的過程中發(fā)揮著重要作用。臨床試驗研究[4]中，對慢性心力衰竭患者應用黃芪注射液不僅能夠改善心室舒張與收縮情況，還能夠?qū)⒏黜椥氖抑貥?gòu)指標降低，從而糾正異常血流，控制病情進展。但黃芪注射液的治療機制尚不清楚，在一定程度上限制了其臨床應用。有研究表明，心肌細胞是一種終末分化細胞，若心肌細胞不斷死亡丟失，則意味著心臟泵血功能的下降，導致心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展，是從代償走向失代償?shù)霓D(zhuǎn)折點[4]。本研究構(gòu)建心肌細胞凋亡模型，探討黃芪注射液對H9c2心肌細胞凋亡的影響及機制?，F(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞大鼠H9c2心肌細胞系，購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所國家實驗細胞資源共享服務平臺。

1.2 藥物與試劑黃芪注射液組，購自神威藥業(yè)集團有限公司，批號：國藥準字Z13020999。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清以及胰蛋白酶，購自美國Gibco公司；血管緊張素轉(zhuǎn)換酶Ⅱ（AngⅡ）（批號：ANGT-003），購自中國杭州中肽生化有限公司；TRIzol購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、擴增試劑盒，購自北京天根生化科技有限公司；引物由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成提供；電壓依賴性陰離子通道蛋白1（VDAC1）、線粒體融合蛋白2（Mfn2）、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白75（GRP75）等抗體購自美國Abcam公司；Mfn2購自美國Proteintech公司；全蛋白提取試劑盒與二喹啉甲酸（BCA）蛋白含量檢測試劑盒購自江蘇凱基技術生物有限公司；鈣離子熒光探針Fura-2AM試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司；ATP比色/熒光測定試劑盒，購自美國Sigma-Aldrich公司；異硫氰酸熒光素-膜聯(lián)蛋白V（FITC-Annexin V）/碘化丙啶（PI）凋亡檢測試劑盒，購自美國BD公司；其他試劑為市售分析純試劑。

1.3 儀器Gene Quant紫外分光光度計（Pharmacia Biotech公司）；基因擴增儀GeneAmp PCR Sys-tem 9700（美國ABI公司）；實時熒光定量PCR儀Mx3000P（美國安捷倫科技公司）；RT-6000酶標儀（深圳Rayto公司）；WesTM全自動蛋白表達分析系統(tǒng)（普諾森生物科技有限公司）。

1.4 細胞分組與處理大鼠H9c2心肌細胞系以含有體積分數(shù)10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基于37℃的CO2孵育箱中培養(yǎng)。待細胞長至80%～90%時去上清，加入無血清DMEM。將細胞分為3組，處理如下：對照組，常規(guī)培養(yǎng)，AngⅡ濃度為0 mol/L；模型組，以AngⅡ誘導的H9c2心肌細胞凋亡為模型，AngⅡ濃度為1×10-7mol/L；AngⅡ+黃芪注射液組，給藥濃度為AngⅡ1×10-7mol/L+0.125%黃芪注射液。各處理組細胞孵育48 h后進行檢測。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 CCK-8法檢測細胞活性按實驗方案處理心肌細胞后，于96孔板每孔100 μL培養(yǎng)基中加入10 μL CCK-8母液，繼續(xù)孵育4 h，應用酶標儀于450 nm波長處測定其光吸收度（OD）值。實驗結(jié)果以細胞存活率表示，細胞存活率=（實驗組OD值-空白對照組OD值）/（對照組OD值-空白對照組OD值）×100%。

1.5.2 流式細胞術檢測細胞凋亡情況具體操作步驟按照FITC-Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒說明書進行。細胞在25 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)處理后，4℃PBS洗2次。用Binding buffer重懸細胞，細胞濃度為1×106個/mL，取100 μL。加5 μL FITC-Annexin V和PI混勻后室溫避光孵育15 min，加400 μL Binding buffer，應用流式細胞儀分析檢測細胞凋亡情況。

1.5.3 ATP比色/熒光法檢測細胞中ATP含量的變化具體操作步驟按照ATP比色/熒光測定試劑盒說明書進行。

1.5.4 鈣離子熒光探針Fura-2AM檢測H9c2細胞鈣離子含量H9c2在96孔板培養(yǎng)處理后，D-Hanks清洗3次，加入2.5 μmol/L Fura-2于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，D-Hanks洗3次，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 min后，應用酶標儀測量340、380 nm激發(fā)光下的510 nm發(fā)射光吸光度，計算兩者比值，即為細胞鈣含量。

1.5.5 實時定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）法檢測細胞VDAC1、Mfn2、GRP75 mRNA表達細胞去上清，PBS洗3次，吸干所有液體，加入TRIzol裂解細胞提取總RNA，應用紫外分光光度計測定RNA濃度和純度。取2 μg總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。配制20 μL PCR反應體系，反應條件：95℃10 min預變性，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸20 s，40次循環(huán)。目的基因引物序列：VDAC1上游引物序列為5’-CTCTGGTGCTTGGCTATG-3’，下游引物序列為5’-CCTGATACTTGGCTGCT ATT-3’，擴增片段103 bp；Mfn2上游引物序列為5’-TAAGCAGATGACAGAGGAAG-3’，下游引物序列為5’-GCACAGACACAGGAAGAA-3’，擴增片段119 bp；GRP75上游引物序列為5’-GCGTCA GAAGCAATCAAG-3’，下游引物序列為5’-TCAT CATATCGTCGTCCAAT-3’，擴 增 片 段135 bp；GAPDH上游引物序列為5’-AGTTCAACGGCACAG TCAAG-3’，下游引物序列為5’-TACTCAGCACC AGCATCACC-3’，擴增片段106 bp。

1.5.6 蛋白免疫印跡（Western Blot）檢測細胞VDAC1、Mfn2、GRP75蛋白表達收集細胞于1.5 mL EP管中，每管細胞（1×106個）加入100 μL裂解液中，用超聲破碎儀裂解，收集上清，BCA法測定蛋白定量。配制十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠并進行電泳（參考分子克隆實驗指南），將蛋白電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，浸沒于封閉液中緩慢搖蕩1 h。用封閉液稀釋一抗至工作濃度（GAPDH為1∶5 000，VDAC1為1∶1 000，Mfn2為1∶1 000，GRP75為1∶1 000），將膜均勻浸入一抗中4℃過夜。TBST洗膜，將膜置于封閉液中室溫孵育1 h，加入二抗（1∶5 000稀釋）室溫孵育1 h，滴加發(fā)光液孵育2 min后化學發(fā)光成像。應用ImageJ軟件進行圖像分析。結(jié)果以目的蛋白灰度值與內(nèi)參（GAPDH）灰度值比值表示。

1.6 統(tǒng)計方法采用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，2組比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的AngⅡ、黃芪注射液對H9c2細胞活性的影響AngⅡ濃度小于1×10-7mol/L時，對細胞增殖沒有顯著影響；黃芪注射液濃度為0.125%時，對H9c2細胞的促增殖作用最為顯著。具體結(jié)果見圖1。故選擇AngⅡ濃度1×10-7mol/L、0.125%黃芪注射液進行后續(xù)實驗。

圖1 不同濃度AngⅡ、黃芪注射液對H9c2心肌細胞活性的影響（CCK-8法）Figure 1 Effects of different concentrations of AngⅡand Astragalus injection on H9c2 myocardial cell activity（by CCK-8 method）

2.2 黃芪注射液對AngⅡ誘導的H9c2心肌細胞凋亡的影響與對照組比較，AngⅡ組細胞凋亡率升高（P＜0.01）；與AngⅡ組比較，AngⅡ組+黃芪注射液組細胞凋亡率降低（P＜0.01）。具體結(jié)果見圖2。表明AngⅡ可誘導H9c2心肌細胞發(fā)生顯著凋亡，黃芪注射液可抑制其凋亡的發(fā)生。

圖2 黃芪注射液對AngⅡ誘導的H9c2心肌細胞凋亡的影響Figure 2 Effects of Astragalus injection on apoptosis of H9c2 myocardial cells induced by AngⅡ

2.3 黃芪注射液對AngⅡ誘導的H9c2心肌細胞ATP含量的影響與對照組比較，AngⅡ組ATP含量升高（P＜0.01）；與AngⅡ組比較，AngⅡ+黃芪注射液組ATP含量降低（P＜0.05）。具體結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，H9c2經(jīng)過AngⅡ刺激48 h后ATP含量增加，黃芪注射液可以抑制由AngⅡ引起的ATP增加。

圖3 黃芪注射液對AngⅡ誘導的H9c2心肌細胞ATP含量的影響Figure 3 Effect of Astragalus injection on ATP content of H9c2 myocardial cells induced by AngⅡ

2.4 黃芪注射液對AngⅡ誘導的H9c2心肌細胞鈣含量的影響與對照組比較，AngⅡ組鈣含量升高（P＜0.05）；與AngⅡ組比較，AngⅡ+黃芪注射液組鈣含量降低（P＜0.01）。具體結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，AngⅡ誘導48 h后可以導致細胞胞漿鈣含量顯著增加，黃芪注射液處理可以顯著下調(diào)鈣含量的增加，提示黃芪注射液可以調(diào)節(jié)并維持心肌細胞胞漿的正常鈣含量。

圖4 黃芪注射液對AngⅡ誘導的H9c2心肌細胞鈣含量的影響Figure 4 Effect of Astragalus injection on calcium content of H9c2 myocardial cells induced by AngⅡ

2.5 黃芪注射液對AngⅡ誘導的H9c2心肌細胞VDAC1、Mfn2、GRP75 mRNA表達的影響與對照組比較，AngⅡ組Mfn2、GRP75 mRNA表達水平升高（P＜0.05），VDAC1 mRNA表達水平降低（P＜0.05）；與AngⅡ組比較，AngⅡ+黃芪注射液組Mfn2、GRP75 mRNA表達水平降低（P＜0.05），VDAC1 mRNA表達水平升高（P＜0.05或P＜0.01）。具體結(jié)果見圖5。結(jié)果表明，AngⅡ誘導可以抑制H9c2心肌細胞VDAC1 mRNA表達，而黃芪注射液可以恢復其表達抑制；AngⅡ誘導可以促進H9c2心肌細胞Mfn2、GRP75 mRNA表達，黃芪注射液可以抑制其表達的增高。

圖5 黃芪注射液對AngⅡ誘導的H9c2心肌細胞VDAC1、Mfn2、GRP75 mRNA表達的影響（RT-PCR法）Figure 5 Effects of Astragalus injection on mRNA expression of VDAC1，Mfn2 and GRP75 in H9c2 myocardial cells induced by AngⅡ（by RT-PCR）

2.6 黃芪注射液對AngⅡ誘導的H9c2心肌細胞VDAC1、Mfn2、GRP75蛋白表達的影響與對照組比較，AngⅡ組MAM結(jié)構(gòu)蛋白VDAC1、Mfn2、GRP75蛋白表達水平升高（P＜0.05或P＜0.01）；與AngⅡ組比較，AngⅡ+黃芪注射液組MAM結(jié)構(gòu)蛋白VDAC1、Mfn2、GRP75蛋白表達水平降低（P＜0.01）。具體結(jié)果見圖6。結(jié)果表明，AngⅡ孵育48 h可以導致H9c2心肌細胞MAM結(jié)構(gòu)蛋白VDAC1、Mfn2、GRP75蛋白表達增強，黃芪注射液可以顯著抑制其增強。

圖6 黃芪注射液對AngⅡ誘導的H9c2心肌細胞VDAC1、Mfn2、GRP75蛋白表達的影響（Western blot法）Figure 6 Effects of Astragalus injection on protein expression of VDAC1，Mfn2，GRP75 in H9c2 myocardial cells induced by AngⅡ（by Western Blot method）

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，充血性心力衰竭（CHF）的發(fā)生發(fā)展與鈣信號傳導、細胞凋亡、三磷酸腺苷（ATP）的生成及能量代謝等密切相關。越來越多的研究證實，心肌細胞凋亡可引起心臟可逆的收縮功能障礙，介導心力衰竭的起始、維持和進展，在心力衰竭中起著關鍵作用[5]。目前認為，參與細胞凋亡的途徑有3條，即外源性死亡受體途徑、內(nèi)源性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑和內(nèi)源性線粒體途徑[6]，其中，線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑的細胞凋亡成為心力衰竭相關研究的熱點，而線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關結(jié)構(gòu)和功能則是維持心肌細胞功能正常的關鍵。線粒體相關內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜（MAM）是線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生交互作用的功能區(qū)域，研究發(fā)現(xiàn)，有幾十種蛋白質(zhì)富集于此[7]，包括Mfn2、VDAC1、GRP75。已有研究表明，Mfn2及IP3R-VDAC-GRP75蛋白復合體是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)線粒體間鈣離子轉(zhuǎn)運的重要通道，調(diào)控鈣離子從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到線粒體的轉(zhuǎn)運[8]，而鈣轉(zhuǎn)運是心肌細胞凋亡能量代謝的核心機制[9]，二者均可誘導心肌細胞凋亡，參與心力衰竭的發(fā)生和發(fā)展。

AngⅡ是腎素-血管緊張素系統(tǒng)的主要活性成分，有實驗研究表明，其在心肌細胞凋亡中發(fā)揮重要作用[10-11]，抑制由AngⅡ引起的細胞凋亡對于臨床防治心力衰竭意義重大。因此，本研究以AngⅡ誘導的心肌細胞凋亡為模型。

本研究結(jié)果顯示：與對照組比較，AngⅡ組細胞凋亡率，ATP含量，鈣含量，Mfn2、GRP75 mRNA表達水平，VDAC1、Mfn2、GRP75蛋白表達水平升高，VDAC1 mRNA表達水平降低（P＜0.05或P＜0.01）；與AngⅡ組比較，AngⅡ+黃芪注射液組細胞凋亡率，ATP含量，鈣含量，Mfn2、GRP75 mRNA表達水平，VDAC1、Mfn2、GRP75蛋白表達水平降低，VDAC1 mRNA表達水平升高（P＜0.05或P＜0.01）。表明黃芪注射液可以有效減弱AngⅡ誘導的H9c2心肌細胞能量代謝，抑制鈣超載，調(diào)控DAC1、Mfn2、GRP75基因和蛋白的表達，有效抑制心肌細胞凋亡，從而改善心功能。

綜上所述，黃芪注射液可以通過改善心肌細胞能量代謝和線粒體鈣離子轉(zhuǎn)運來抑制心肌細胞凋亡，發(fā)揮細胞保護作用，從而達到緩解和治療心力衰竭的目的。但心力衰竭的發(fā)生機制十分復雜，僅心肌細胞凋亡即有3種通道途徑可以觸發(fā)，其中還涉及多種細胞凋亡因子和蛋白參與。本研究結(jié)果可以為黃芪注射液臨床防治心力衰竭提供應用依據(jù)，但其具體的參與機制仍需進一步研究。