李嵐其，郭麗娜，陳肖家，季幸姝，鐘慧雅，宋雅芳

（1.廣州中醫(yī)藥大學科技創(chuàng)新中心，廣州中醫(yī)藥大學脾胃研究所，廣東廣州 510405；2.澳門大學中華醫(yī)藥研究院，中藥質量研究國家重點實驗室，澳門 999078）

臟象學說是中醫(yī)理論體系的核心組成部分。脾者，諫議之官，為后天之本，氣血生化之源，在臟象學說中居于重要地位。同時，“脾主肌肉”也是中醫(yī)基礎學科研究領域中的熱點。線粒體是三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化的重要場所，在細胞的整個生命活動中擔負著合成三磷酸腺苷（ATP）的重要職責。能量代謝的過程由一系列酶促反應貫穿始終，細胞色素c氧化酶（COX）是線粒體呼吸鏈電子傳遞的限速酶，同時也是呼吸鏈終末氧化酶，在調節(jié)線粒體氧化磷酸化、保障充足的能量供應中起關鍵作用。它主要將細胞色素c上的4個電子傳遞給O2繼而生成H2O，然后借助于線粒體膜內、外的電化學質子梯度，啟動ATP合成酶的催化作用，使二磷酸腺苷（ADP）磷酸化為ATP[1]。

研究[2-3]發(fā)現(xiàn)，脾虛狀態(tài)下存在線粒體功能的改變，致使能量合成不足，脾主運化失司，脾主肌肉失調，從而造成一系列的脾虛證候。本研究以線粒體能量代謝為切入點，通過對脾虛大鼠骨骼肌病理結果及線粒體COXⅠ、COXⅣmRNA和蛋白表達變化的研究，以探討脾虛證中線粒體能量代謝障礙機制及健脾益氣方藥對其的影響，從線粒體角度出發(fā)為脾虛證治療提供科學依據(jù)，現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SD雄性大鼠（SPF級）42只，體質量為（270±20）g，由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，動物質量合格證號：SCXK（粵）2013-0020。所有大鼠在廣州中醫(yī)藥大學SPF級實驗室進行常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2 實驗藥物及制備四君子湯由黨參、白術、茯苓、甘草組成，比例為2∶2∶2∶1，藥材購自廣州杏園春藥店。制備方法：將以上中藥材先加入生藥10倍量純水中浸泡4 h后煎煮，待水沸騰40 min后倒出藥液；再加8倍量水直接煎煮，水沸騰30 min后倒出藥液；將2次水提液合并，濃縮成為1 g生藥/mL四君子湯水提液，冷卻后4℃保存。

1.3 主要試劑利血平注射液（天津金耀氨基酸有限公司生產(chǎn)，批號：1204191）；TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）；熒光定量PCR試劑（日本TaKaRa公司）；PrimeScriptTMRT Reagent Kit（日本TaKaRa公司）；COXⅠ抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；COXⅣ抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；牛血清白蛋白（武漢博士德生物工程有限公司）；ElivisionTMplus鼠/兔試劑盒（福州Maxin生物技術開發(fā)有限公司）。

1.4 主要儀器EG1140H石蠟包埋機（德國Leica公司）；SHANDON-AS325型旋轉石蠟切片機（英國Shandon公司）；普通PCR儀（美國Bio-Rad公司）；7300型熒光定量儀（美國ABI公司）；Scanspeed 1730R型低溫離心機（丹麥Labogene公司）；VXE SERIES型超低溫冰箱（美國Thermo公司）。

1.5 分組、造模與給藥方法SD大鼠適應性喂養(yǎng)至體質量（320±30）g，先隨機分成2組，正常組10只，模型組32只。造模方法參照文獻研究[4]：模型組大鼠皮下注射利血平注射液0.5 mg·kg-1·d-1，正常組大鼠皮下注射等體積的生理鹽水，每日1次，持續(xù)8 d。

造模開始后，模型組大鼠逐漸出現(xiàn)攝食量減少、明顯消瘦、嗜臥、瞇眼、喜蜷縮扎堆、大便稀溏、毛色枯槁不榮。參照沈自尹等[5-6]評價標準確定造模成功。

造模成功后隨機抽取7只正常組大鼠及14只模型組大鼠，將模型組大鼠分為四君子湯組和脾虛模型組，每組各7只。參照前期研究[7]，四君子湯組給予最適劑量濃度1.0 g·mL-1·kg-1灌胃，脾虛模型組和正常組灌胃等量生理鹽水，每日1次，持續(xù)21 d，并記錄大鼠一般情況。

1.6 觀察指標與方法

1.6.1 一般狀況觀察各組大鼠的精神狀態(tài)，記錄體質量、當天攝食量、飲水量、大便質地、毛發(fā)光澤度等。

1.6.2 對溴苯胺法檢測尿D-木糖排泄率各組灌胃四君子湯或生理鹽水21 d后，所有大鼠禁食不禁飲12 h，每只大鼠灌胃4 mL 3%D-木糖，收集5 h內尿液，采用對溴苯胺法[8-9]測定尿D-木糖排泄率。

1.6.3 蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察骨骼肌病理形態(tài)取大鼠骨骼肌組織，置于40 g/L多聚甲醛中，固定24 h后用PBS洗3次，依次使用由低到高濃度乙醇梯度脫水，用二甲苯溶液進行透明，浸蠟后包埋處理。取骨骼肌橫、縱2個截面的連續(xù)切片，厚度約為5 μm，使用HE染色法進行染色，在光學顯微鏡下觀察并拍攝骨骼肌病理形態(tài)結構。

1.6.4 熒光定量PCR法檢測骨骼肌COXⅠ、COXⅣmRNA表達采用TRIzol法提取骨骼肌組織RNA，計算濃度和純度后進行逆轉錄反應，條件與時間：37℃持續(xù)15 min，溫度升高至85℃持續(xù)5 s，后降溫至4℃結束反應。PCR反應的條件與時間：93℃持續(xù)30 s，55℃持續(xù)15 s，72℃保溫30 s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內參，采用2-△△Ct法計算目的基因的相對定量，計算復孔平均值。用Primer Express 2.0軟件設計特異性引物。引物由Invitrogen公司設計合成，COXⅠ的上游引物序列為5’-CT ATCACTGGCATCCGCTCA-3’，下游引物序列為5’-GACACCGTAGTCCACCAGCA-3’，擴增片段長度106 bp。COXⅣ的上游引物序列為5’-TCCAAT TGTACCGCATCCAG-3’，下游引物序列為5’-AA GCCGATGAAGAACATGGC-3’，擴增片段長度103 bp。

1.6.5 免疫組織化學Elivision法檢測骨骼肌COXⅠ、COXⅣ蛋白表達分離骨骼肌，取骨骼肌制作連續(xù)切片。低溫放置30 min，加入4℃丙酮固定10 min后，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗，以100 μg/mL的牛血清白蛋白封閉，室溫孵育10 min。滴加兔抗人COXⅠ/COXⅣ第一抗體（1∶50稀釋），并設陰性對照組（使用PBS代替一抗），4℃孵育過夜。第2天取出切片滴加二抗，水浴箱37℃孵育30 min。甩掉二抗，PBS清洗5 min×3次，微微晾干，滴加辣根過氧化物酶，37℃水浴箱孵育20 min。隨后去除原液體，PBS清洗5 min×3次，滴加新鮮配制的3，3’-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色溶液30 s。PBS清洗5 min×3次，蘇木素染色40 s。自來水沖洗浸泡10 min，切片組織酒精梯度脫水后徹底晾干，滴加適量中性樹脂，蓋玻片封片，顯微鏡下觀察。參考文獻方法[10]對細胞著色進行評分，見表1。本實驗研究采用4級分法，兼顧細胞著色與陽性細胞百分比評分，取兩者得分之和后，進行判定。陰性為0分，輕度為1分、2分，中度為3分、4分，重度為5分、6分。

表1 細胞著色評分標準Table 1 Cell staining scoring criteria

1.6.6 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測大鼠骨骼肌COXⅠ、COXⅣ蛋白表達取大鼠骨骼肌組織，加入含蛋白酶抑制劑的裂解液提取總蛋白，用二喹啉甲酸（BCA）試劑盒測定蛋白質含量。取蛋白質樣品（30 mg），100℃條件下變性5 min，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）分離并轉移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。加入COXⅠ、COXⅣ一抗（1∶1 000稀釋）于4℃孵育過夜，清洗后加入二抗常溫孵育1 h。最后滴加發(fā)光液，曝光處理，應用ImageJ軟件分析灰度值。

1.7 統(tǒng)計方法采用IBM SPSS Statistics 22.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）。如方差齊，則組間兩兩比較采用LSD法；如方差不齊，則采用Dunnett T3法。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般狀況開始造模后，脾虛模型組大鼠出現(xiàn)消瘦、攝食量減少、大便稀溏、毛色枯槁不榮、嗜臥、瞇眼、喜蜷縮扎堆，且體質量較正常組顯著降低。停止造模后，脾虛模型組大鼠一般狀況好轉、體質量呈上升趨勢，但仍顯著低于正常組，四君子湯組大鼠體質量較脾虛模型組有上升趨勢。

2.2 各組大鼠尿D-木糖排泄率比較給藥3周結束時，脾虛模型組尿D-木糖排泄率低于正常組（P＜0.05），而四君子湯組尿D-木糖排泄率較脾虛組有所恢復（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠尿D-木糖排泄率比較Table 2 Comparison of D-xylose excretion rate in various groups of rats （±s，%）

表2 各組大鼠尿D-木糖排泄率比較Table 2 Comparison of D-xylose excretion rate in various groups of rats （±s，%）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組脾虛模型組四君子湯組D-木糖排泄率44.68±9.71 24.95±13.45①39.33±9.50②鼠數(shù)/只7 7 7

2.3 各組大鼠骨骼肌組織病理形態(tài)比較正常組大鼠骨骼肌形態(tài)：肌纖維排列整齊，結構尚清晰，胞質染色整體一致，細胞核均勻分布。脾虛模型組大鼠骨骼肌形態(tài)：肌纖維排列紊亂、連續(xù)性較差，間隙增寬，胞質染色深淺不一，細胞核分布不均。與脾虛模型組比較，四君子湯組骨骼肌肌纖維排列較整齊，胞質染色較一致，細胞核分布均勻。表明四君子湯治療后，脾虛大鼠骨骼肌病理損傷情況改善。見圖1。

圖1 各組大鼠骨骼肌組織病理形態(tài)比較（HE染色，×200）Figure 1 Comparison of histopathological features of rat skeletal muscle in various groups（by HE staining，×200）

2.4 各組大鼠骨骼肌COXⅠ、COXⅣmRNA表達比較與正常組比較，脾虛模型組大鼠骨骼肌COXⅠ、COXⅣmRNA表達水平降低（P＜0.05）；與脾虛模型組比較，四君子湯組大鼠骨骼肌COXⅠ、COXⅣmRNA表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠骨骼肌COXⅠ、COXⅣmRNA表達比較Table 3 Comparison of mRNA expression of COXⅠand COXⅣin skeletal muscle in various groups of rats （lg±lg s）

表3 各組大鼠骨骼肌COXⅠ、COXⅣmRNA表達比較Table 3 Comparison of mRNA expression of COXⅠand COXⅣin skeletal muscle in various groups of rats （lg±lg s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組脾虛模型組四君子湯組COXⅣ4.86±0.43 3.61±1.21①4.33±0.50②鼠數(shù)/只7 7 7 COXⅠ5.04±0.64 3.96±0.87①4.24±0.54②

2.5 各組大鼠骨骼肌COXⅠ、COXⅣ蛋白表達比較免疫組織化學結果顯示：正常組大鼠骨骼肌胞漿深度染色，出現(xiàn)棕黃色顆粒；與正常組比較，脾虛模型組胞漿染色淺，視野內骨骼肌棕黃色顆粒明顯減少，脾虛模型組大鼠骨骼肌COXⅠ、COXⅣ蛋白表達水平均降低（P＜0.01）；經(jīng)四君子湯治療后，與脾虛模型組比較，COXⅠ、COXⅣ蛋白表達水平升高（P＜0.05或P＜0.01），骨骼肌胞漿染色較脾虛模型組深，見少量棕黃色顆粒分布，但仍低于正常對照組。見表4、圖2、圖3。蛋白免疫印跡法結果顯示：與正常組相比較，脾虛模型組大鼠骨骼肌COXⅠ、COXⅣ蛋白表達水平均降低（P＜0.01）；經(jīng)四君子湯治療后，與脾虛模型組相比較，COXⅠ、COXⅣ蛋白表達水平升高（P＜0.05）。見圖4。

圖3 各組大鼠骨骼肌COXⅣ免疫組織化學染色結果比較（×100）Figure 3 Comparison of immunohistochemical staining results of COXⅣin skeletal muscle in various groups of rats（×100）

圖4 各組大鼠骨骼肌COXⅠ、COXⅣ蛋白免疫印跡結果比較Figure 4 Comparison of Western Blot results of COXⅠ、COXⅣin skeletal muscle in various groups of rats

表4 各組大鼠骨骼肌COXⅠ、COXⅣ蛋白表達比較Table 4 Comparison of protein expression of COXⅠand COXⅣin skeletal muscle in various groups of rats （±s，分）

表4 各組大鼠骨骼肌COXⅠ、COXⅣ蛋白表達比較Table 4 Comparison of protein expression of COXⅠand COXⅣin skeletal muscle in various groups of rats （±s，分）

①P＜0.01，與正常組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與模型組比較

COXⅣ1.60±0.45 0.54±0.19①0.93±0.21②組別正常組脾虛模型組四君子湯組鼠數(shù)/只7 7 7 COXⅠ2.20±0.26 0.76±0.19①1.47±0.28③

圖2 各組大鼠骨骼肌COXⅠ免疫組織化學染色結果比較（×100）Figure 2 Comparison of immunohistochemical staining results of COXⅠin skeletal muscle in various groups of rats（×100）

3 討論

脾為五臟之使，氣血生化之源?！短绞セ莘健分杏涊d：“脾胃者，水谷之精，化為氣血，氣血充盛，營衛(wèi)流通，潤養(yǎng)身形，榮于肌肉也?！薄端氖バ脑础吩唬骸凹∪庹?，脾土之所生也，脾氣盛則肌肉豐滿而充實?！逼⑽竿?，氣血化源充盛，水谷精微足以輸布全身充養(yǎng)肌肉，使得肌肉發(fā)達、豐滿、健壯。李杲《脾胃論》中亦指出：“脾虛則肌肉瘦削?！薄捌⑽钢摚《枋扰P，四肢不收?！比粝忍炱⑽柑撊趸蚝筇炱⑽腹δ苁С＃⒉簧?，胃不降濁，脾胃運化功能失司，肌肉筋脈失于濡養(yǎng)，日久則見四肢乏力，肌肉痿軟，不耐勞作，甚則萎弱不用，發(fā)為痿證。故脾養(yǎng)四肢百骸，脾氣充則肌肉豐，脾氣虛則肌肉萎。

能量代謝是機體內物質代謝中能量釋放、轉移和利用的動態(tài)過程，它與中醫(yī)“脾主運化”“脾主肌肉”理論密不可分。脾主運化，通過飲食水谷中攝取精微物質，布散到臟腑組織中[11]。脾主肌肉，是以脾所運化的水谷精微充養(yǎng)全身肌肉[12]。線粒體是一種集三大基本生命活動（能量代謝、物質代謝和遺傳變異）于一身的半自主性細胞器，是“細胞動力站”。真核細胞能量生成主要來源于線粒體，其通過氧化磷酸化，消耗ADP和無機磷酸合成ATP，以滿足機體肌肉系統(tǒng)、腦等能量需求較大的器官[13]。

本課題組長期從事“脾-線粒體”的相關研究，提出機體吸收營養(yǎng)物質就是一個不斷消耗ATP，在生物線粒體內發(fā)生氧化磷酸化并釋放能量的過程，此為闡明中醫(yī)“脾主運化”的科學內涵提供了新思路[14]。本課題組通過進一步探討脾虛與線粒體能量代謝的關系，發(fā)現(xiàn)脾虛模型組大鼠的骨骼肌、胃黏膜組織線粒體超微結構出現(xiàn)空泡化、膜缺損、嵴斷裂等明顯損傷[15]。本研究結果顯示，脾虛模型組大鼠ATP、琥珀酸脫氫酶（SDH）酶活性和過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助激活因子1α（PGC-1α）的表達經(jīng)過四君子湯干預后，均得到了不同程度的提高，表明脾虛模型組大鼠骨骼肌線粒體存在能量代謝障礙，健脾益氣中藥可以使這種異常變化得到改善[7，16]。此外，有學者對脾與線粒體關系進行探討，結果表明，脾氣虛大鼠骨骼肌組織線粒體超微結構出現(xiàn)異常，ATP含量顯著低于正常組，電針“足三里”健脾治療后上述癥狀得到改善[17]。艾灸健脾益氣俞穴后可恢復線粒體結構，增加呼吸鏈酶含量，從而改善脾虛狀態(tài)[18]。上述脾虛相關研究涉及中藥、針灸、艾灸等多種手段，從線粒體結構、功能多角度進行探討，結果均表明健脾以提升機體運化可改善線粒體結構功能，調節(jié)能量代謝。本課題組在既往脾與線粒體相關研究的基礎上，進一步探討了健脾益氣代表方四君子湯對脾虛大鼠骨骼肌線粒體COXⅠ和COXⅣ活性的影響。

COX位于線粒體內膜，是由nDNA基因組和mtDNA基因組分別編碼，是線粒體內呼吸鏈電子傳遞的限速酶，處于調節(jié)線粒體氧化能力的關鍵地位，其數(shù)量的多寡與線粒體呼吸鏈功能密切相關[19]。其在氧化磷酸化和由活性氧簇（ROS）調控的代謝中起中心作用[20]。脾虛證時線粒體結構受損，伴隨功能障礙，從而影響能量代謝的關鍵過程。COX（Ⅰ、Ⅳ）是線粒體的標志酶，其酶的活性和含量的變化可直接影響整個呼吸鏈的功能，且其具有不穩(wěn)定、易受損的特點，極易受自由基造成的氧化損傷，導致給氧分子傳遞電子的數(shù)量降低，效率下降，自由基生成增多，進而加重損傷[21]。

COXⅠ是由mtDNA編碼的最大的COX亞單位，該酶的作用是將NADH上得到的2個高勢能電子轉移至鐵硫蛋白上，再將電子傳遞給輔酶Q。其具有酶催化活性，被認為是mtDNA質量的標志，因其僅在線粒體表達，可在一定程度上反映線粒體的功能[22]。

COXⅣ是COX組成的重要亞基，對維持COX分子的結構及功能起關鍵作用，其存在的2種異構體可以結合ATP，在ADP/ATP比例升高時使COX活性變構性激活，COXⅣ表達正常與否直接影響整條呼吸鏈的功能狀態(tài)以及細胞的能量供應[23]。

研究發(fā)現(xiàn)，脾虛型功能性消化不良大鼠肝臟COXⅣ蛋白和基因表達降低，經(jīng)脾虛1號方（六君子湯加延胡索、枳殼等）治療后，可顯著上調COXⅣmRNA和蛋白的表達[24]。電針足三里穴，可通過調節(jié)線粒體能量代謝提升脾氣虛模型組大鼠心肌、胃肌、骨骼肌組織中COX4的mRNA和蛋白的表達[25]。亦有研究表明，在脾氣虛證到脾不統(tǒng)血的不同階段，大鼠骨骼肌線粒體的4種呼吸鏈酶復合物活性均低于正常對照組，并說明這種變化是2種證型差異的重要指征[26]。脾虛證大鼠經(jīng)健脾類方治療后，其骨骼肌線粒體琥珀酸脫氫酶（SDH）及Ca2+-ATPase等表達均升高[27]。脾虛大鼠心肌線粒體存在超微結構的改變及少量線粒體自噬體出現(xiàn)[28]。有學者對AS巴馬小型豬肝臟組織84個與線粒體能量代謝密切相關的基因檢測發(fā)現(xiàn)：在17個變化基因中，有16個基因分別與COXⅠ、Ⅱ、Ⅳ和Ⅴ亞基相關[29]。以上研究提示，COXⅠ、COXⅣ蛋白的表達與脾虛證線粒體能量代謝障礙密切相關。

本研究結果表明，脾虛大鼠骨骼肌病理形態(tài)顯示肌纖維損傷，肌肉組織排列紊亂、間隙增大，肌細胞胞質染色、胞核分布不均勻，骨骼肌COXⅠ、COXⅣmRNA及蛋白表達水平均降低。表明脾虛大鼠線粒體結構與功能受損，氧化磷酸化功能障礙，提示脾虛證與線粒體損傷密切相關。脾為后天之本，氣血生化之源，脾虛則健運失司，氣血無以化生，肌肉失養(yǎng)，線粒體呼吸鏈中的細胞色素氧化酶亞基的蛋白合成受阻，氧化磷酸化功能障礙，從而影響能量的合成，造成能量代謝障礙。經(jīng)四君子湯治療后，脾虛大鼠骨骼肌病理形態(tài)改善，肌纖維排列整齊，細胞核分布較均勻，骨骼肌COXⅠ、COXⅣmRNA及蛋白表達增加，其機制可能與四君子湯改善脾虛引起的線粒體形態(tài)結構損傷，提高線粒體氧化磷酸化功能，從而減輕線粒體損傷，改善機體能量代謝有關。