李 濤，宋國(guó)新，李 霄，孫浩然，李 海，劉 沖

漿細(xì)胞腫瘤(plasma cell neoplasms, PCN)是由終末分化的B細(xì)胞產(chǎn)生，通常分泌具有重鏈重排的單克隆丙種免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)，或稱(chēng)M蛋白。PCN包括多種亞型：漿細(xì)胞骨髓瘤、漿細(xì)胞瘤、Ig沉積病、骨硬化性骨髓瘤(亦稱(chēng)POEMS綜合征)等，其中漿細(xì)胞瘤又分為骨孤立性漿細(xì)胞瘤和骨外(髓外)漿細(xì)胞瘤。骨外(髓外)漿細(xì)胞瘤是發(fā)生于骨外軟組織的局限性孤立性腫瘤，最常見(jiàn)于上呼吸道，尤其是老年人的口咽、鼻腔鼻竇和喉等部位，形態(tài)學(xué)特點(diǎn)類(lèi)似骨內(nèi)孤立性漿細(xì)胞瘤[1]。近年，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)部分發(fā)生于鼻腔鼻竇的漿細(xì)胞瘤伴有EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)感染，但WHO(2017)淋巴造血系統(tǒng)腫瘤分類(lèi)中未提及該特征，目前也僅有少量的個(gè)案報(bào)道[2-7]，兩者之間潛在的關(guān)聯(lián)尚不明確。本文著重探討原發(fā)于鼻腔鼻竇的EBV陽(yáng)性漿細(xì)胞瘤的臨床病理學(xué)特征及其與相關(guān)腫瘤的鑒別診斷，為臨床和病理醫(yī)師提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料收集2017年1月～2020年12月江蘇省人民醫(yī)院/南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理學(xué)部診斷的22例鼻腔鼻竇漿細(xì)胞瘤，其中7例為EBV陽(yáng)性漿細(xì)胞瘤(占31.8%)。

1.2 方法

1.2.1HE及免疫組化 標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林充分固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、3 μm厚連續(xù)切片、HE染色、中性樹(shù)膠封固。免疫組化染色采用EnVision兩步法，所用一抗包括CD3(SP7)、CD5(SP19)、CD20(L26)、PAX-5(MX017)、CD79a(MX076)、CD38(MX044)、CD138(MI15)、MUM1(MUM1P)、CD30(Ber-H2)、CD56(MX039)、C-myc(EP121)、Ki-67(MIB-1)等，均購(gòu)自福州邁新公司，利用Lumatas全自動(dòng)免疫組化染色儀進(jìn)行制片。

1.2.2EBER原位雜交 石蠟4 μm厚切片，烘烤后進(jìn)行脫蠟和水化，隨后進(jìn)行蛋白酶K處理、雜交孵育、顯色、水洗、蘇木精復(fù)染、梯度乙醇脫水、中性樹(shù)膠封固等程序。其中EBV編碼的小RNA(EBER)探針購(gòu)自北京中杉金橋公司，以EBV陽(yáng)性的鼻咽癌作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替探針作為陰性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中酶處理和雜交孵育過(guò)程嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，保證實(shí)驗(yàn)室和所有器械等均為專(zhuān)用，避免RNA酶污染。陽(yáng)性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：僅為細(xì)胞核著色，胞質(zhì)和胞膜著色為陰性(核分裂除外)。

1.2.3FISH 石蠟3 μm厚切片2張，烘烤后進(jìn)行脫蠟和水化，胃蛋白酶消化10 min，后經(jīng)70%、85%和100%梯度乙醇脫水固定，自然干燥。然后轉(zhuǎn)入暗室進(jìn)行基因變性和雜交，加入探針?lè)湃朐浑s交儀進(jìn)行雜交反應(yīng)及后續(xù)處理，待實(shí)驗(yàn)完畢，晾干，利用熒光顯微鏡觀察基因的突變形式。C-myc基因斷裂重組檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京金菩嘉公司，所用探針為GLP C-myc(8q24)。判讀標(biāo)準(zhǔn)：10%以上腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)1個(gè)黃色融合信號(hào)、1個(gè)紅色信號(hào)和1個(gè)綠色信號(hào)為陽(yáng)性(正常為2個(gè)黃色信號(hào))。

1.2.4Ig基因重排檢測(cè) DNA提取試劑盒采用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit，引物系統(tǒng)符合BIOMED-2標(biāo)準(zhǔn)，PCR反應(yīng)液購(gòu)自上海源奇生物公司，在ABI3130遺傳分析儀上進(jìn)行片段掃描的克隆性分析，再根據(jù)“BIOMED-2解讀指南”進(jìn)行判斷分析，其中單克隆結(jié)果為：目的范圍內(nèi)出現(xiàn)明確單峰熒光信號(hào)或在弱的多信號(hào)背景中出現(xiàn)明確單峰信號(hào)判斷為單克隆性重排；顯示連續(xù)多熒光信號(hào)的鐘型曲線判斷為多克隆性重排。實(shí)驗(yàn)過(guò)程包含質(zhì)控要求：若標(biāo)本在100、200、300、395 bp位置收集到ROX熒光信號(hào)(紅色峰)，則表示標(biāo)本DNA的質(zhì)量和數(shù)量符合要求；反之，重新檢測(cè)樣品，若仍無(wú)熒光信號(hào)則檢測(cè)結(jié)果報(bào)告為“用于檢測(cè)的DNA數(shù)量或者質(zhì)量不合格，無(wú)法進(jìn)行檢測(cè)”。檢測(cè)基因(含有效監(jiān)測(cè)范圍)如下：管家基因(100、200、300、394 bp)、FR1-JH(310～360 bp)、FR2-JH(250～295 bp)、DH-JH(110～290 bp、390～420 bp)、Vk-Jk(120～160 bp、190～210 bp、260～300 bp)、Vk-Kde+intron-Kde(210～250 bp、270～300 bp、350～390 bp)。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征7例均為老年男性患者，年齡范圍58～70歲，平均65.7歲。發(fā)病部位包括鼻腔(3例)、鼻竇(2例)、鼻中隔(1例)、鼻前庭(1例)。腫瘤直徑1～3.5 cm，平均2.2 cm。所有患者均為孤立性偶發(fā)病例，無(wú)免疫抑制劑治療、器官移植以及漿細(xì)胞骨髓瘤等相關(guān)病史，主要臨床表現(xiàn)依據(jù)發(fā)病頻率依次為：鼻出血(5/7)、鼻塞(5/7)、鼻息肉(2/7)、不規(guī)則新生物(2/7)、癤腫(1/7)。

2.2 病理特征7例腫瘤性漿細(xì)胞呈彌漫實(shí)性生長(zhǎng)，根據(jù)漿細(xì)胞分化成熟度分為三個(gè)級(jí)別：1級(jí)2例，腫瘤細(xì)胞分化好，具有成熟漿細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞呈卵圓形，核偏位，染色質(zhì)深染、均質(zhì)狀或呈“車(chē)輻狀”分布在核膜邊緣，無(wú)核仁，有豐富的嗜堿性胞質(zhì)和核周空暈(圖1)；2級(jí)1例，腫瘤細(xì)胞分化較不成熟，瘤細(xì)胞體積大，核染色質(zhì)疏松，核質(zhì)比例高，核異型增加，核仁明顯，可見(jiàn)雙核或多核細(xì)胞，但胞質(zhì)仍較豐富、嗜堿性，核周空暈可見(jiàn)(圖2)；3級(jí)4例，瘤細(xì)胞分化更為不成熟，其中1例呈現(xiàn)漿母細(xì)胞樣形態(tài)(核大空泡狀，核仁明顯、居中，核分裂易見(jiàn)，胞質(zhì)較少聚集在細(xì)胞膜邊緣，核周空暈不明顯或缺如，圖3)，另外3例呈現(xiàn)間變性形態(tài)(顯著的多形性和異形性，圖4)。為進(jìn)一步觀察腫瘤的病理特征，將本組7例再分為分化成熟組2例和不成熟組5例，其中2例分化成熟組中部分區(qū)域仍散在分布較為不成熟的腫瘤性漿細(xì)胞。

圖1 腫瘤細(xì)胞具有成熟漿細(xì)胞形態(tài)，異型小，細(xì)胞呈卵圓形，核偏位，染色質(zhì)深染、均質(zhì)狀或呈“車(chē)輻狀”分布 圖2 腫瘤細(xì)胞分化較不成熟，瘤細(xì)胞體積大，核染色質(zhì)疏松，核質(zhì)比例高，核異型增加 圖3 腫瘤細(xì)胞呈漿母細(xì)胞樣，具有大而空泡狀的細(xì)胞核，核仁明顯、居中，核分裂易見(jiàn) 圖4 腫瘤細(xì)胞異型性顯著(體積增大，核形不規(guī)則、核仁顯著、多核、巨核)，符合間變性特征 圖5 腫瘤細(xì)胞彌漫表達(dá)CD79a，EnVision兩步法 圖6 腫瘤細(xì)胞彌漫表達(dá)CD138，EnVision兩步法 圖7 腫瘤細(xì)胞彌漫表達(dá)MUM1，EnVision兩步法 圖8 具有漿母細(xì)胞樣形態(tài)特征的腫瘤Ki-67增殖指數(shù)高達(dá)90%，EnVision兩步法 圖9 EBER原位雜交檢測(cè)陽(yáng)性

2.3 免疫表型腫瘤細(xì)胞主要表達(dá)CD79a(圖5)以及漿細(xì)胞分化的標(biāo)記，如CD38、CD138(圖6)、MUM1(圖7)，陽(yáng)性率均為100%，不表達(dá)CD20和PAX-5。Ki-67增殖指數(shù)為10%～90%，其中分化成熟組為10%～20%，分化不成熟組為40%～90%(圖8)。Ki-67陽(yáng)性率>70%的3例腫瘤細(xì)胞CD30陰性、CD56陽(yáng)性。

2.4 EBER原位雜交檢測(cè)22例漿細(xì)胞瘤中7例出現(xiàn)彌漫強(qiáng)陽(yáng)性，陽(yáng)性定位于細(xì)胞核，呈棕黃色(圖9)，7例切片陽(yáng)性質(zhì)控和陰性質(zhì)控組織較理想著色或不著色，提示EBER原位雜交檢測(cè)陽(yáng)性。

2.5 FISH檢測(cè)7例C-myc基因斷裂重組檢測(cè)鏡下所見(jiàn)C-myc基因?yàn)?個(gè)黃色信號(hào)或表現(xiàn)為1紅1綠1黃比率<10%，提示C-myc基因均未發(fā)生易位。

2.6 Ig基因重排檢測(cè)7例均為陽(yáng)性，其中5例表現(xiàn)為IGH和IHK(重鏈和輕鏈)重排，1例表現(xiàn)為IGH重排，1例表現(xiàn)為IGK重排，涉及的基因及出現(xiàn)頻率為：FR2-JH(6/7)、FR1-JH(1/7)、DH-JH(1/7)、Vk-Kde+intron-Kde(5/7)、Vk-Jk(1/7)。所有病例均可見(jiàn)輕鏈限制性表達(dá)(κ或λ)。

2.7 預(yù)后7例患者6例獲得隨訪資料，1例失訪，隨訪2.7～40個(gè)月，均存活，至今無(wú)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，其中4例術(shù)后進(jìn)行了放療，1例進(jìn)行細(xì)胞免疫治療，1例未進(jìn)行治療。

3 討論

漿細(xì)胞瘤伴EBV陽(yáng)性這一特征并未在WHO(2017)淋巴造血系統(tǒng)腫瘤分類(lèi)中提及，目前僅為少數(shù)個(gè)案報(bào)道[2-9]，文獻(xiàn)報(bào)道該現(xiàn)象多見(jiàn)于移植后的漿細(xì)胞瘤[4]。本組22例鼻腔鼻竇漿細(xì)胞瘤中EBV陽(yáng)性7例(占31.8%)。腫瘤細(xì)胞CD79a、MUM1、CD138、CD38陽(yáng)性，CD20和PAX-5陰性。Ig基因重排檢測(cè)均為陽(yáng)性并可見(jiàn)輕鏈限制性表達(dá)(κ或λ)。C-myc基因斷裂重組檢測(cè)均為陰性?；颊呔鶠楣铝⑿耘及l(fā)病例，無(wú)免疫抑制劑治療、器官移植以及漿細(xì)胞骨髓瘤等相關(guān)病史。7例均符合骨外(髓外)孤立性漿細(xì)胞瘤的臨床病理特征，但與一般的漿細(xì)胞瘤不同的是所有病例EBER原位雜交檢測(cè)均呈陽(yáng)性。

EBV又稱(chēng)人類(lèi)皰疹病毒-4型(human herpesvirus-4, HHV-4)，是一種普遍存在的雙鏈DNA病毒，主要感染人口咽上皮和淋巴細(xì)胞，通過(guò)病毒的包膜糖蛋白Gp350與B淋巴細(xì)胞表面的CD21受體結(jié)合，優(yōu)先感染B淋巴細(xì)胞[10]。目前，已明確EBV與許多疾病有關(guān)，包括上皮和間葉性腫瘤以及淋巴造血系統(tǒng)疾病等，但其發(fā)病機(jī)制的確切作用尚未完全明了[11]。EBV的生命周期具有原發(fā)感染(包括溶解復(fù)制階段)和潛伏期雙向性特點(diǎn)：原發(fā)感染階段，由于宿主缺乏對(duì)病毒的免疫力，病毒可破壞口咽細(xì)胞。接下來(lái)的幾天和幾周內(nèi)，細(xì)胞免疫和體液免疫得以發(fā)展，病毒潛伏在記憶B細(xì)胞中，使記憶B細(xì)胞成為EBV貯存庫(kù)，被病毒感染的細(xì)胞便逃避了機(jī)體的免疫識(shí)別[10]。盡管全球90%以上的人口感染了EBV，但僅有一小部分相關(guān)感染會(huì)導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)化[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)EBV血清陽(yáng)性的健康個(gè)體中，受EBV感染的記憶B細(xì)胞向漿細(xì)胞的終末分化與病毒復(fù)制和EBV裂解周期的啟動(dòng)有關(guān)，呈現(xiàn)一種限制性潛伏期模式[2,6,12]。EBER作為EBV編碼的小RNA，屬于EBV的表達(dá)產(chǎn)物，在EBV感染的細(xì)胞核中以高拷貝數(shù)存在，可能參與了抑制細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和腫瘤形成等過(guò)程[13]。結(jié)合本組分析發(fā)現(xiàn)鼻腔鼻竇的漿細(xì)胞瘤雖然少見(jiàn)，但發(fā)病人群中EBV感染率占31.8%，盡管相關(guān)機(jī)制尚不明確，推測(cè)EBV可能與漿細(xì)胞瘤的發(fā)生有一定的關(guān)系，需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)行深入探究。

本組7例腫瘤細(xì)胞均呈彌漫浸潤(rùn)，形態(tài)上依據(jù)漿細(xì)胞分化程度呈完整的譜系，即腫瘤細(xì)胞從成熟到不成熟形態(tài)，甚至呈現(xiàn)間變性或漿母樣特征。本組3例呈間變性特征，1例具有漿母細(xì)胞樣形態(tài)特點(diǎn)，此外分化較為成熟的2例中也有部分區(qū)域散在分布分化較為不成熟的漿細(xì)胞。腫瘤增殖指數(shù)在2例分化較成熟組分別為10%和20%，在5例分化不成熟組為40%～90%。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，個(gè)別學(xué)者亦觀察到EBV陽(yáng)性漿細(xì)胞瘤的形態(tài)學(xué)特征可表現(xiàn)為漿母細(xì)胞性、局灶漿母細(xì)胞性或間變性[14]。結(jié)合本組病例，發(fā)現(xiàn)EBV對(duì)腫瘤的形態(tài)和增殖活性可造成一定的影響。

鑒別診斷：當(dāng)EBV陽(yáng)性漿細(xì)胞瘤中存在間變性或漿母細(xì)胞樣形態(tài)特征時(shí)，需與漿母細(xì)胞淋巴瘤(plasmablastic lymphoma, PBL)進(jìn)行鑒別[15]。PBL更易呈EBV陽(yáng)性(陽(yáng)性率為60%～75%，發(fā)生于口腔黏膜的陽(yáng)性率接近100%)，同時(shí)具有高增殖活性[1]，其形態(tài)及免疫表型等諸多特征均與EBV陽(yáng)性漿細(xì)胞瘤極為相似，但兩者臨床治療方案卻截然不同，因此PBL是EBV陽(yáng)性漿細(xì)胞瘤最重要的鑒別點(diǎn)之一。PBL好發(fā)于HIV陽(yáng)性的男性患者，大部分腫瘤細(xì)胞類(lèi)似于B免疫母細(xì)胞，目前歸類(lèi)于大B細(xì)胞淋巴瘤范疇。形態(tài)學(xué)具有較大的變化范圍，從彌漫和鑲嵌排列到顯著的漿細(xì)胞性分化，腫瘤細(xì)胞具有顯著的異型性、核偏位、胞質(zhì)豐富、核仁明顯、核分裂象易見(jiàn)，可見(jiàn)凋亡小體等。PBL細(xì)胞具有漿細(xì)胞表型，表達(dá)CD138、CD38、Vs38c、IRF4/MUM1，不表達(dá)或弱表達(dá)CD20、PAX-5，但與漿細(xì)胞瘤不同的是該腫瘤常表達(dá)EMA、CD30，不表達(dá)CD56，Ki-67增殖指數(shù)一般較高(>90%)[1]。遺傳學(xué)上MYC基因是在PBL中最早報(bào)道的異?；騕16]，也是PBL中最常見(jiàn)的染色體異常(陽(yáng)性率達(dá)49%)[17]。本組有3例Ki-67呈高增殖指數(shù)(>70%)，但CD30陰性、CD56陽(yáng)性，C-myc基因斷裂重組檢測(cè)均為陰性，不符合PBL的特點(diǎn)，盡管形態(tài)存在間變性或漿母細(xì)胞樣的特點(diǎn)，最終診斷為EBV陽(yáng)性漿細(xì)胞腫瘤，伴有間變性或漿母細(xì)胞樣形態(tài)特征。另一方面當(dāng)腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)呈現(xiàn)分化較為成熟以及伴有Ki-67低增殖指數(shù)時(shí)，需進(jìn)一步與低級(jí)別的結(jié)外邊緣區(qū)黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤伴廣泛的漿樣分化以及漿細(xì)胞單克隆性增殖鑒別[18-19]。因此，外檢中如果發(fā)現(xiàn)漿細(xì)胞瘤存在間變性或漿母細(xì)胞樣特征時(shí)，需考慮EBV感染的可能性，同時(shí)還要充分的詢(xún)問(wèn)患者是否存在免疫抑制治療、器官或組織移植等病史[4]。

7例患者6例獲得隨訪資料，1例失訪，隨訪時(shí)間2.7～40個(gè)月，至今均存活，其中4例術(shù)后進(jìn)行了放療，1例進(jìn)行細(xì)胞免疫治療，1例未進(jìn)行治療。有研究報(bào)道，EBER陽(yáng)性患者預(yù)后良好，無(wú)侵襲性臨床病程，但與EBER陰性患者相比，EBER陽(yáng)性患者更容易出現(xiàn)疾病進(jìn)展(復(fù)發(fā)/進(jìn)展為多發(fā)性骨髓瘤)[5]，由于目前所觀察的樣本較小，該結(jié)論仍需進(jìn)一步探討。

EBV的存在對(duì)腫瘤的形態(tài)和增殖活性具有一定的影響，但對(duì)該疾病發(fā)病機(jī)制和發(fā)展的影響仍需進(jìn)一步觀察，有待大樣本數(shù)據(jù)的薈萃分析，建議病理醫(yī)師在今后的外檢工作中增加漿細(xì)胞腫瘤EBV的檢測(cè)，為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)該腫瘤的生物學(xué)行為儲(chǔ)備病例資料。