董禮 劉斌 江慶 齊保峰 范娟

組織癌變是由多個基因發(fā)生累積突變的一個多步驟過程，腫瘤細胞不同基因的位點改變、缺失、重復(fù)等，都會影響細胞生長和增殖的調(diào)控，從而促使腫瘤的發(fā)生[1]。每一種組織基因突變的亞型特性、最優(yōu)治療方式、預(yù)后等都各不相同；其中，以肺腺癌、含腺癌成分或具有腺癌分化傾向的其它非小細胞肺癌患者，攜帶敏感基因突變者最多，靶向治療獲益最大[2]。相關(guān)研究在NSCLC驅(qū)動基因中開展得最早，也最為成熟。臨床上一般送檢材料主要為組織標(biāo)本(經(jīng)手術(shù)切除、內(nèi)鏡下鉗取或刷檢、經(jīng)皮針吸等)，以及非組織標(biāo)本(胸腔積液、全血或血清等)，但二者的最終檢測結(jié)果往往有一定程度的偏差。本文通過收集583例臨床初診確診肺腺癌患者的二代基因測序法(next generation sequencing, NGS)檢測結(jié)果及一般臨床特征信息，回顧性分析對比不同標(biāo)本來源下肺腺癌患者的EGFR、KRAS、ERBB2以及ALK等基因突變檢出率情況。

資料與方法

一、研究資料

研究收集2018年5月至2020年12月在阜陽市人民醫(yī)院/第二人民醫(yī)院/腫瘤醫(yī)院以及阜南/利辛/臨泉縣人民醫(yī)院等6家醫(yī)院就診的583例初診確診肺腺癌患者。分析所有患者的臨床資料，包括性別、年齡、TNM分期、吸煙史、標(biāo)本來源，及通過經(jīng)皮肺穿刺、支氣管鏡、手術(shù)切除等獲得的腫瘤組織標(biāo)本和血液、胸水等非組織標(biāo)本下患者EGFR、KRAS、ERBB2以及ALK基因的二代測序突變檢測結(jié)果。此研究已獲得上述所涉醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

二、方法

所有取材流程均由高年資醫(yī)師親自指導(dǎo)進行，保證樣品標(biāo)本的保存與運輸、狀態(tài)及樣本質(zhì)量均符合上機前標(biāo)準(zhǔn)。采用杭州瑞普基因的瑞吉安檢測試劑盒、核酸提取試劑、測序反應(yīng)通用試劑盒，以及Illumina HiSeq 4000測序平臺進行測序。組織質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)為：惡性腫瘤細胞占比≥20%、DNA總量≥10ng，平均測序深度為≥1000，不低于10%平均測序深度占比≥80%；液體標(biāo)本測序質(zhì)控：DNA總量≥10ng，平均測序深度≥8000，不低于10%平均測序深度占比≥80%。具體操作流程參見文獻[3]。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，組間率的比較采用Fisher確切概率法或χ2檢驗，計數(shù)資料采用例數(shù)或率(%) 表示；采用Logistic回歸分析方法排除混雜因素影響后對不同標(biāo)本亞組的基因突變檢出進行二元分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、一般臨床資料

通過χ2檢驗及Fisher確切概率法分析可見：583例肺腺癌患者中，EGFR基因突變在年齡≤65歲、不吸煙的女性患者中檢出率相對較高(P<0.05)；KRAS基因突變在男性吸煙患者基因突變檢出率相對較高(P<0.05)；ALK基因突變則在女性、不吸煙患者突變檢出率相對較高(P<0.05)；而ERBB2基因突變在不同性別、年齡、吸煙史及腫瘤分期的檢出率對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(詳見表1)。

二、583例肺腺癌患者NGS檢測EGFR、KRAS、ERBB2及ALK基因突變情況

583例肺癌患者中，EGFR基因突變普遍集中于外顯子18～21位點，其中以19位點缺失及21位點L858R突變檢出為主；KRAS基因突變主要集中于外顯子2、3位點，以G12C突變?yōu)橹?；ERBB2基因突變則主要集中于外顯子20位點； ALK基因突變22例，均檢出為EML4-ALK 基因融合，其中含有p.G1202R點突變1例(4.55%)(見圖1)。

三、不同標(biāo)本來源下肺腺癌患者的EGFR、KRAS、ERBB2及ALK基因突變檢出情況

排除一般資料等混雜因素可見：組織標(biāo)本對于EGFR突變檢出仍為最佳，其中具體組織取材方式之間并無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.492，>0.05)，但經(jīng)內(nèi)鏡下、手術(shù)獲取的組織標(biāo)本卻優(yōu)于血液標(biāo)本(P=0.033，P=0.020，<0.05)；KRAS、ALK基因突變檢測亦是組織取材為先；而組織、血液、胸水等標(biāo)本之間對于檢出ERBB2基因突變均有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.024,<0.05)，其中經(jīng)皮肺穿刺明顯優(yōu)于血液檢出(P=0.033，<0.05)(見圖2)。

表1 583例肺腺癌患者的一般臨床資料及EGFR、KRAS、ERBB2及ALK基因突變檢測情況[n(%)]

四、多基因共突變患者的臨床特征

583例患者中共有13例多基因共突變者，檢出率為2.23%，95%置信區(qū)間為(0.010,0.034)，除均含EGFR基因共突變外，分別為伴有5例KRAS基因突變、5例ERBB2基因突變/擴增、3例ALK基因融合。其中，女性8例，男性5例；年齡≥65歲者8例，<65歲者5例；TNM分期均為Ⅲ～Ⅳ期；有吸煙史12例；標(biāo)本來源于組織者12例，來源于血液者1例。詳細病理特征(見表2)。

表2 多基因共突變患者的臨床特征

圖1 583例肺腺癌患者NGS檢測EGFR、KRAS、ERBB2及ALK基因突變情況

(注：圖2-1、2-2、2-3、2-4分別為EGFR、KRAS、ALK及ERBB2各基因亞組對比；其中因經(jīng)胸水未檢出ERBB2基因突變，故未將胸水組列入亞組對比比較。)

討 論

自2004年發(fā)現(xiàn)表皮生長因子受體(EGFR)基因突變起[4]，陸續(xù)又發(fā)現(xiàn)了許多其他突變，如ALK、BRAF、ROS1基因等[5]。這些致癌途徑的發(fā)現(xiàn)，促進了靶向藥物在抗腫瘤作用方面的發(fā)展，使得NSCLC的治療取得了重大進步，患者生存結(jié)果顯著改善[6]。指南建議：一旦確診為非小細胞肺腺癌，均應(yīng)盡快完善基因檢測[7]；只有明確了患者的基因突變類型，才能精準(zhǔn)指導(dǎo)患者的后續(xù)治療，尤其是靶向藥物、免疫藥物的選用。

肺腺癌的生長特性主要沿管外及肺泡壁蔓延，常在肺周邊部形成大小不等的腫塊；早期也可侵犯血管、淋巴管。針對這一特性，我們一般可通過手術(shù)切除、內(nèi)鏡下鉗取或肺穿刺等來獲得其腫瘤組織；但臨床工作中較多肺癌晚期患者因操作創(chuàng)傷大、身體耐受性差、腫瘤位置特殊等無法獲得足夠的組織樣本。這時選擇取材相對容易、侵入性小、重復(fù)性高的患者外周血、胸腔積液、肺泡灌洗液或腦脊液等液體標(biāo)本來進行送檢就顯得十分重要[8]。腫瘤患者的血體液中含有因腫瘤細胞壞死、凋亡釋放出的ctDNA，甚至CTC(circulating tumor cell，外周血液循環(huán)腫瘤細胞)，雖然二者含量相對少，但因包含了腫瘤細胞的基因組信息，可反映腫瘤進展現(xiàn)況，近些年來國內(nèi)外學(xué)者爭相通過各種渠道的超深度測序法來提高對ctDNA的敏感性和特異性，比如標(biāo)記擴增深度測序(TAM-Seq)，腫瘤個體化分析深度測序法(CAPP-Seq)等；甚至檢測出有組織標(biāo)本中未檢出的基因突變，但因受技術(shù)、經(jīng)濟等層面影響，目前仍未獲得廣泛應(yīng)用。本文即通過回顧性收集安徽阜陽地區(qū)583例肺腺癌患者信息，結(jié)合基因NGS檢測結(jié)果，分析其腫瘤的一般特征；從而進一步排除混雜因素，對比不同標(biāo)本來源下的部分驅(qū)動基因二代測序檢出情況。

本次研究中，共檢測出：EGFR基因突變型為257例，突變率占比44.08%，這與Liu L P報道的46.7%[9]比較接近。作為目前研究相對充分的致癌途徑之一，EGF誘導(dǎo)EGFR胞外區(qū)進行構(gòu)象變化，進一步促進胞內(nèi)區(qū)激酶活性的形成并進行自身磷酸化，進而招募下游信號分子完成細胞信號從膜外向膜內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。其激酶結(jié)構(gòu)域突變主要發(fā)生在第18～21外顯子處(其中，以19位點缺失及L858R位點突變者居多)；本研究中該基因突變主要涉及：19外顯子124例(48.25%；其中位點缺失者117例，占45.53%)、21外顯子122例(47.47%；其中L858R突變者114例，占44.36%)、20外顯子26例(10.12%)、18外顯子8例(3.11%)；這與2020年NCCN基因組統(tǒng)計的東亞患者EGFR突變占比基本相同[10]。國內(nèi)外曾多次研究結(jié)果均顯示血液與組織標(biāo)本EGFR檢測基因突變率一致性較高[11-13]，但在本次送檢中的組織標(biāo)本對比血液、胸水等非組織標(biāo)本，可見經(jīng)內(nèi)鏡下、手術(shù)獲取標(biāo)本明顯優(yōu)于血液標(biāo)本(P=0.033，P=0.020，<0.05)?？紤]血液中ctDNA含量極低，并且在機體容量的稀釋作用下，導(dǎo)致EGFR檢出的假陰性可能大，故建議臨床上應(yīng)多次送檢外周血，以減少檢驗誤差。

ERBB2基因突變型為24例(4.12%)，以酪氨酸激酶域的7～27外顯子突變較多，本文中涉及該基因位點突變16例，其中：20外顯子12例(50.00%)，7、11、17、27外顯子均為1例(4.17%)；基因擴增10例(41.67%)。不同性別、年齡、吸煙史及腫瘤分期的基因突變率對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而標(biāo)本來源于組織、血液、胸水間均有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.024,<0.05)。檢測率由高至低依次為組織(22例，6.06%)、血液(2例，1.36%)、胸水(0例，0.00%)。經(jīng)胸水未檢出該基因陽性突變，且整體檢出率偏低，分析可能與胸水中細胞種類雜多，腫瘤細胞篩選效率低下、以及樣本量較少及或分布不均有關(guān)，且NGS方法目前仍存在技術(shù)缺陷，故不建議作胸水送檢的優(yōu)先考慮。

KRAS基因作為EGFR的下游靶分子，檢出突變38例(6.52%)，目前顯示尚無適宜的靶向用藥，但有研究分析，KRAS G12C或許是一個潛在的可用藥靶點[14]。本研究顯示男性吸煙患者該基因突變率相對較高(P<0.05)，不同標(biāo)本來源之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.178，>0.05)；ALK基因突變?yōu)?2例(3.77%)，且均含EMLK-ALK融合基因。自2007年該融合基因首次在NSCLC中被證實具有高度致瘤性以來，曾長期被認為與其他驅(qū)動基因突變存在互相排斥；但隨著檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，已經(jīng)漸被推翻，本次研究中便涉及3例同時合并有EGFR基因突變的患者，且都為女性。全部檢出突變中女性、不吸煙患者相對較高(P<0.05)，不同標(biāo)本來源之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.423，>0.05)。這可能與地區(qū)及樣本選擇偏倚、檢測手段的敏感性及個體差異、基因突變表達豐度等相關(guān)。

上述四種基因整體研究中：患者外周血檢出率均較低于組織標(biāo)本檢出率，與胸水檢出率接近；這可能與不同標(biāo)本的檢出靈敏度不一致相關(guān)。對于不同標(biāo)本的基因檢測最佳方式目前國內(nèi)外仍存在較大爭議[15]。以EGFR基因為例，目前應(yīng)用最多的外周血檢測方法是微滴數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)法(droplet digital polymerase chainraction，ddPCR)和超級擴增阻滯突變系統(tǒng)(super-amplifi refractory mutation system，super-ARMS)，二者具有操作方便、費時少等優(yōu)勢，但特異性及靈敏度均有待提高[16]；NGS相比二者，雖可同時對上百萬甚至數(shù)十億個DNA進行分析，實現(xiàn)高通量測序的目標(biāo)[17]，提高檢驗靈敏性；但其不足亦是對樣本質(zhì)量的要求性高，檢測的成本大、周期長，程序復(fù)雜[18]。不同標(biāo)本來源的最佳檢測方法不一致，導(dǎo)致臨床醫(yī)生們的經(jīng)驗總結(jié)與判斷顯得尤為重要。

綜上所述：各基因的突變情況與其部分臨床特征之間存在相關(guān)性。不同標(biāo)本來源的肺腺癌患者中部分基因突變檢測率亦存在統(tǒng)計學(xué)差異，其中以組織標(biāo)本檢出率最高，具體取材途徑之間并無明顯差異；同時受當(dāng)前檢測手段及技術(shù)的不成熟等因素影響，NGS對血液標(biāo)本的基因突變檢出率次之，在臨床上，面對承受度差、治療意愿又相對積極的肺腺癌患者，我們可嘗試多次送檢外周血進行基因檢測，以降低假陰性結(jié)果的可能，從而更精準(zhǔn)指導(dǎo)患者的后續(xù)個體化診治；另外胸腔積液因研究樣本量有限，且檢出率低，建議暫不優(yōu)先選擇NGS檢測。