穆雙鋒 李敬霞 龐然然

肺癌是五大癌癥之一，世界上最常見的癌癥，也是死亡率最高的癌癥。主要分為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer cell，NSCLC)和小細(xì)胞肺癌，兩者在肺癌中占比分別為85%和15%。肺癌的治療手段主要是手術(shù)、放射、化療和分子靶向藥物治療的方式，通?；颊叱＝邮軆煞N或兩種以上的治療方式[1]。粗糠柴霉素，即Rottlerin，是一種提取自印度和中國(guó)傳統(tǒng)中藥材粗糠柴的化合物，具有驅(qū)絳蟲、治療疥瘡和皰疹的癬的作用。粗糠柴霉素是蛋白激酶 C(protein kinases C, PKC)的選擇性抑制劑[2]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，粗糠柴霉素針對(duì)很多腫瘤都有抑制作用，其在乳腺癌、前列腺癌、肝細(xì)胞癌、胃癌、肺癌的治療研究中都發(fā)現(xiàn)有顯著的抑癌效果[3-7]。p21活化激酶(p21-activated kinase 6，PAK6)在肺癌、結(jié)腸癌等癌組織中都有過量表達(dá)，促進(jìn)腫瘤發(fā)展[8-10]。干擾PAK6表達(dá)可以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的凋亡，增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的放射敏感性[11]。本研究以NSCLC A549細(xì)胞為研究對(duì)象，以不同濃度粗糠柴霉素處理和過量表達(dá)PAK6的方法來檢測(cè)粗糠柴霉素抑制A549細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡的作用機(jī)制和對(duì)放射敏感性的影響，探尋粗糠柴霉素對(duì)抑制非小細(xì)胞肺癌的臨床意義。

資料與方法

一、材料

人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549購(gòu)自ATCC；DMEM培養(yǎng)基(dulbecco's modified eagle medium)和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自Gibco公司，胰蛋白酶Trypsin、四氮唑藍(lán)(MTT)和二甲基亞礬(Dimethyl sulfoxide，DMSO)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；雙抗、抗PAK6抗體和抗GAPDH抗體購(gòu)自Abcam公司；Total RNA提取試劑盒、 real-time PCR 試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RT-PCR)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；雙染色流式法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司。

二、方法

1 細(xì)胞培養(yǎng)：A549細(xì)胞在10 % FBS+DMEM培養(yǎng)基+1% 青霉素+1% 鏈霉素的細(xì)胞培養(yǎng)液中，37℃ 5% CO2環(huán)境中常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合成單層時(shí)，用磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline，PBS)清洗三次，再用Trypsin消化傳代。

2 MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞增殖抑制率：將終濃度為0、2、4、8、16 μM的粗糠柴霉素加入A549細(xì)胞，連續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，加入 20 μL(5 g/L)MTT，反應(yīng)4 h后加入150 μL DMSO，室溫振蕩5 min溶解甲瓚結(jié)晶，在Bio-Rad全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定OD492 nm 處的吸光度(A)值，計(jì)算抑制率(%)=(對(duì)照組A均值-實(shí)驗(yàn)組A均值)/實(shí)驗(yàn)組A均值×100%。并確定半數(shù)抑制濃度的粗糠柴霉素最佳處理時(shí)間。

3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將A549細(xì)胞稀釋為密度1×106個(gè)/mL，接種于6孔板中(200 μL/孔)，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合成一層時(shí)按照Lipofectamine 2000說明書的步驟，將Lipofectamine 2000、pcDNA和pcDNA-PAK6在無血清OptiMEM培養(yǎng)液中稀釋，之后取等體積Lipofectamine 2000和pcDNA或pcDNA-PAK6輕輕混勻，靜置20 min，將混合液加至6孔板中，輕輕晃動(dòng)6孔板，混合均勻后置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6h，之后換成完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48h后收集A549細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞分為對(duì)照組、粗糠柴霉素組(8μM粗糠柴霉素處理48 h)、粗糠柴霉素+pcDNA組(轉(zhuǎn)染pcDNA后經(jīng)8μM粗糠柴霉素處理48 h)、粗糠柴霉素+pcDNA-PAK6組(轉(zhuǎn)染pcDNA-PAK6后經(jīng)8μM粗糠柴霉素處理48 h)。

4 Real-timePCR檢測(cè)mRNA的表達(dá)：按照Total RNA提取試劑盒的說明書，進(jìn)行各組A549細(xì)胞總RNA的提取，測(cè)定濃度和純度后保存于-80℃超低溫冰箱。通過反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒制備cDNA，real-time PCR試劑盒在Bio-Rad Real-time PCR儀，按照95℃ 7 min；95℃ 40s、58℃ 42s、72℃ 35s(35個(gè)循環(huán))；72℃ 10 min的程序進(jìn)行反應(yīng)，Bio-Rad公司的IQ5TM Real-time PCR Detection System分析數(shù)據(jù)。PAK6 上游引物 5′-GACTCCATCCTGCTGACCCTC-3′，下游引物 5 ′-CACCTCAGTGGCATACAAAGACC-3′；GAPDH(內(nèi)參照)上游引物 5′-AATGAAGGGGTCATTGATGG-3′，下游引物 5′-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3′。

5 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率：收集各組A549細(xì)胞，遵循Annexin V/PI 試劑盒說明書的指示，以5 μL膜聯(lián)蛋白V-FITC標(biāo)記的 (Annexin V-FITC) 和5 μL 碘化丙啶(PI)避光染色，15 min后在流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。

6 克隆形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定放射處理后細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)：取各組A549細(xì)胞細(xì)胞濃度稀釋至1×104個(gè)細(xì)胞/孔，接種于6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)過夜。然后將細(xì)胞分別暴露于不同劑量下(0、2、4、6、8Gy)進(jìn)行照射處理，照射條件：室溫照射，靶距100 cm，照射面積12.5 cm×8.5 cm，美國(guó)VarianX直線加速器。取500個(gè)細(xì)胞/皿接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，設(shè)3個(gè)重復(fù)，加入10mL培養(yǎng)液混合均勻，于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)至出現(xiàn)肉眼能清晰可見的細(xì)胞克隆(約2周)，棄去培養(yǎng)液，洗滌2次，4%冷的甲醛固定細(xì)胞15 min，棄固定液，洗滌2次，吉姆薩染色30 min，自來水清洗，室溫晾干后計(jì)數(shù)，所形成的細(xì)胞集落>50個(gè)時(shí)為有效菌落。根據(jù)單機(jī)多靶模型擬合細(xì)胞存活曲線，計(jì)算放射增敏比(SER)。計(jì)算細(xì)胞克隆形成率 = (細(xì)胞克隆數(shù)平均值/鋪板細(xì)胞總數(shù))×100%，細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)(survival fraction,SF) = 受照射細(xì)胞克隆形成率/對(duì)照細(xì)胞克隆形成率)×100%。

7 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)：將對(duì)照組、粗糠柴霉素組、粗糠柴霉素+pcDNA組、粗糠柴霉素+pcDNA-PAK6組A549細(xì)胞加入RIPA，超聲破碎抽提蛋白。蛋白以4 ∶1的比例加入5×上樣緩沖液，混勻后煮沸10 min，進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜，封閉后于4℃與500倍稀釋的一抗PAK6孵育過夜，于室溫與1 000倍稀釋的二抗孵育1h，顯影后凝膠成像系統(tǒng)掃描，以GAPDH 為內(nèi)參照，分析PAK6表達(dá)水平。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、粗糠柴霉素抑制A549增殖

粗糠柴霉素處理A549 24 h、48 h、72 h，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與粗糠柴霉素0μM組相比，2、4、8、16 μM粗糠柴霉素在24 h、48 h、72 h細(xì)胞抑制率均顯著升高(P<0.05)；與粗糠柴霉素2μM組相比，4、8、16 μM粗糠柴霉素在24 h、48 h、72 h細(xì)胞抑制率均顯著升高(P<0.05)；與粗糠柴霉素4μM組相比，8、16μM粗糠柴霉素在24h、48h、72h細(xì)胞抑制率均顯著升高(P<0.05)；與粗糠柴霉素8μM組相比，16μM粗糠柴霉素在24h、48h、72h細(xì)胞抑制率均顯著升高(P<0.05)；粗糠柴霉素抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用隨著給藥劑量的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng)(P<0.05)(見表1)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取處理時(shí)間48h，抑制率為50%左右的粗糠柴霉素濃度(8μM)用作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 不同濃度粗糠柴霉素對(duì)肺癌細(xì)胞A549抑制率的影響

二、粗糠柴霉素促進(jìn)A549凋亡

流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組凋亡率相比，8μM粗糠柴霉素處理A549細(xì)胞48h后肺癌細(xì)胞A549的凋亡率顯著增加(P<0.05)(見圖1和表2)。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)粗糠柴霉素處理后A549細(xì)胞凋亡率

表2 粗糠柴霉素對(duì)肺癌細(xì)胞A549凋亡的影響

三、粗糠柴霉素增加A549的放射敏感性

克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，隨著照射劑量的增加，粗糠柴霉素組A549的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)逐漸下降，且差異顯著(P<0.05)(見圖2)，放射增敏比為1.663，表明粗糠柴霉素可增加A549的放射敏感性(見表3)。

圖2 不同劑量照射后A549細(xì)胞的存活曲線注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

四、粗糠柴霉素抑制A549中PAK6蛋白的表達(dá)

qRT-PCR和Western blot的結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，粗糠柴霉素處理組A549細(xì)胞中PAK6的mRNA和蛋白的表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)(見圖3、表3)。

圖3 A549中的PAK6蛋白表達(dá)水平

表3 粗糠柴霉素對(duì)肺癌細(xì)胞A549中PAK6表達(dá)的影響

五、PAK6蛋白過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了粗糠柴霉素抑制A549增殖和促進(jìn)凋亡的作用

Western blot結(jié)果表明，與粗糠柴霉素組和粗糠柴霉素+pcDNA組相比，粗糠柴霉素+pcDNA-PAK6組的PAK6蛋白表達(dá)量顯著升高(見圖4)。

MTT和流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，粗糠柴霉素組細(xì)胞抑制率和凋亡率均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；粗糠柴霉素+pcDNA-PAK6組細(xì)胞抑制率和凋亡率均顯著低于粗糠柴霉素+pcDNA組(P<0.05)(見表4)。

圖4 A549細(xì)胞中的PAK6蛋白過量表達(dá)

表4 PAK6過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了粗糠柴霉素對(duì)肺癌細(xì)胞A549增殖、凋亡的作用

六、PAK6過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了粗糠柴霉素對(duì)A549的放射增敏作用

克隆形成實(shí)驗(yàn)表明，與對(duì)照組相比，隨著照射劑量的增加，粗糠柴霉素組A549的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)逐漸下降，且差異顯著(P<0.05)；與粗糠柴霉素+pcDNA組相比，粗糠柴霉素+pcDNA-PAK6組的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)顯著升高(P<0.05)(見圖5)。說明PAK6過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了粗糠柴霉素對(duì)A549的放射增敏作用。

圖5 不同劑量照射后A549細(xì)胞的存活曲線

討 論

肺癌位居世界癌癥首位，非小細(xì)胞肺癌占肺癌患者85%左右，多數(shù)患者確診時(shí)已為肺癌晚期，失去了手術(shù)根除的最佳治療機(jī)會(huì)，所以肺癌的發(fā)病率和死亡率接近，目前，手術(shù)治療、放射、化療和分子靶向藥物治療是肺癌的最主要治療方式[1]。

粗糠柴霉素被眾多研究證實(shí)，對(duì)乳腺癌[3]、前列腺癌[4]、肝細(xì)胞癌[5]、胃癌[6]、非小細(xì)胞肺癌[7]有抗腫瘤作用，本研究證實(shí)了粗糠柴霉素在適當(dāng)濃度抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖的作用，證實(shí)粗糠柴霉素對(duì)非小細(xì)胞肺癌具有潛在的臨床抑制作用。

柯蒙等研究表明，粗糠柴霉素通過下調(diào)低密度脂蛋白相關(guān)受體6(LRP6)抑制前列腺癌細(xì)胞PC-3的經(jīng)典Wnt通路，實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤發(fā)展的目的[4]。Yin等研究乳腺癌時(shí)，得出結(jié)論：粗糠柴霉素通過抑制S 期激酶相關(guān)蛋白 2(S-phase kinase associated protein 2，SKP2)表達(dá)，達(dá)到抑制乳腺癌的目的[3]。Zhao 等人發(fā)現(xiàn)粗糠柴霉素通過抑制 Hippo 通路中TAZ蛋白的表達(dá)，達(dá)到抑制非小細(xì)胞肺癌的作用[7]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)粗糠柴霉素是通過抑制PAK6表達(dá)來促進(jìn)A549凋亡，抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖的。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)論相似，都表明粗糠柴霉素是通過下調(diào)癌細(xì)胞中某些信號(hào)通路蛋白表達(dá)，來發(fā)揮增殖抑制和凋亡促進(jìn)的功能。蔡松旺發(fā)現(xiàn)，PAK6 通過重構(gòu)細(xì)胞骨架抑制非小細(xì)胞肺癌的侵襲及遷移能力[12]；本研究結(jié)果與蔡松旺的結(jié)果互補(bǔ)，同時(shí)證實(shí)了PAK6是通過抑制細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而達(dá)到抑制非小細(xì)胞肺癌的作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，粗糠柴霉素可以作為非小細(xì)胞肺癌潛在的放射增敏劑。

Brahma 等發(fā)現(xiàn)粗糠柴霉素可誘導(dǎo)胰腺癌干細(xì)胞自噬導(dǎo)致細(xì)胞死亡[13]。QI等人研究發(fā)現(xiàn)，粗糠柴霉素通過阻滯細(xì)胞周期，同時(shí)產(chǎn)生大量?jī)?nèi)源性微管相關(guān)蛋白 1 輕鏈3(LC3)-II 蛋白以及自噬小體，通過誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的凋亡[14]。Wnt通路在生長(zhǎng)發(fā)育和疾病發(fā)生過程中具有重要的作用，與各種癌癥的發(fā)生和發(fā)展更是密切相關(guān)[15-17]。PAK6可能通過Wnt通路和/或Hippo 通路影響A549的增殖、侵襲、凋亡，而粗糠柴霉素可能通過調(diào)節(jié)PAK6表達(dá)來影響Wnt通路和/或Hippo 通路，從而抑制細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡或產(chǎn)生細(xì)胞自噬，最終達(dá)到抑制非小細(xì)胞肺癌的作用。這些作用并不是通過單個(gè)信號(hào)通路或分子標(biāo)靶來實(shí)現(xiàn)的，多個(gè)分子機(jī)制的參與，使這一過程的研究充滿了挑戰(zhàn)，也為粗糠柴霉素成為臨床抗腫瘤藥物奠定了理論基礎(chǔ)。下一步將從這幾個(gè)方向著手研究粗糠柴霉素影響非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡的分子機(jī)制，探討粗糠柴霉素作為潛在的放射增敏劑在抑制非小細(xì)胞肺癌中的作用機(jī)制。