郭青春 張杰根 高雅倩 呂永盛 周鵬飛 李欽招

大量研究發(fā)現(xiàn)COPD患者氣道炎癥反應(yīng)明顯增加，但其作用仍存在爭(zhēng)議[1-3]。誘導(dǎo)痰采樣，是一種非侵入性的檢測(cè)方法，近20年來其操作方法已經(jīng)逐漸被標(biāo)準(zhǔn)化并廣泛應(yīng)用于臨床[4-7]。霧化和吸入鹽水會(huì)增加肺部的排痰量[6]。據(jù)報(bào)道，誘導(dǎo)痰采樣方法可為80%以上的哮喘和COPD患者提供足夠高質(zhì)量的痰樣本[8-11]。誘導(dǎo)痰采樣可能會(huì)引起支氣管收縮，自發(fā)痰和誘導(dǎo)痰中的炎癥標(biāo)志物水平和細(xì)胞計(jì)數(shù)已經(jīng)被報(bào)道，且有研究發(fā)現(xiàn)，哮喘或COPD患者誘導(dǎo)痰中的細(xì)胞活性高于自發(fā)痰[12-19]。然而很少有研究探討COPD患者的誘導(dǎo)痰和自發(fā)痰樣本是否可以互換用于炎癥標(biāo)志物的分析[20]。本研究比較COPD患者誘導(dǎo)痰和自發(fā)痰標(biāo)本中趨化因子CCL5的水平，評(píng)估急性加重期患者行誘導(dǎo)痰檢查的安全性。

資料與方法

一、研究對(duì)象

本研究經(jīng)河北省涿州市醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，選取2019年6月至2020年6月我院呼吸內(nèi)科收治的COPD患者90例，其中穩(wěn)定期和急性加重期患者各45例，收集每位患者的誘導(dǎo)談和自發(fā)痰標(biāo)本，對(duì)痰標(biāo)本進(jìn)行炎癥因子檢測(cè)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者年齡>40歲；(2)所有患者均符合2020慢性阻塞性肺疾病全球倡議(GOLD)[21]指南對(duì)COPD的診斷標(biāo)準(zhǔn)：使用支氣管擴(kuò)張劑后，F(xiàn)EV1/FVC<0.70，確認(rèn)存在持續(xù)性氣流受限；(3)患者對(duì)本研究知情并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他炎性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡或其他結(jié)締組織疾病；(2)合并炎癥性腸道疾?。?3)合并惡性腫瘤或血液系統(tǒng)疾??；(4)合并嚴(yán)重心、肺、肝、腎功能不全者；(5)不能耐受誘導(dǎo)痰檢查者。

二、方法

1 痰標(biāo)本的采集和處理：采用超聲波霧化器進(jìn)行誘導(dǎo)痰的采集?；颊咴谡T導(dǎo)前30分鐘吸入200～400μg沙丁胺醇后進(jìn)行肺活量測(cè)定評(píng)估，吸入3%高滲鹽水7分鐘，收集誘導(dǎo)痰液，重復(fù)3次。在誘導(dǎo)痰之前同一時(shí)間點(diǎn)采集患者的自發(fā)痰標(biāo)本。

每克痰中加入0.1%二硫蘇糖醇4mL，冷凍保存。使用Eppendorf均質(zhì)器在4℃和600rpm/min的條件下均質(zhì)15分鐘。加入磷酸鹽緩沖液(PBS)對(duì)樣品進(jìn)行過濾，4℃、450 g/min離心15分鐘后收集上清液至0.5mL試管中蒸發(fā)，樣品置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。?jīng)過培訓(xùn)的專業(yè)人員使用臺(tái)盼藍(lán)染色評(píng)估痰液中細(xì)胞的生存能力。在采樣后30min內(nèi)對(duì)所有樣本進(jìn)行質(zhì)控，質(zhì)控合格的標(biāo)準(zhǔn)為：痰液中細(xì)胞數(shù)量>100萬個(gè)/mL，上皮細(xì)胞<20%，白細(xì)胞存活率>30%。

2 趨化因子的檢測(cè)：使用Luminex? xMAP?技術(shù)對(duì)痰標(biāo)本進(jìn)行趨化因子分析。樣本在Luminex 100儀器上進(jìn)行處理，結(jié)果由STarStation軟件收集和存儲(chǔ)。

三、統(tǒng)計(jì)方法

結(jié) 果

本研究共納入90例患者，其中男59例(65.56%)，31例(34.44%)；年齡40～72歲，平均(62.50±4.31)歲，既往吸煙史52例(57.78%)，目前吸煙史38例(42.22%)；GOLD(2020)分級(jí)：Ⅱ級(jí)27例(30.00%)，Ⅲ級(jí)53例(58.89%)，Ⅳ級(jí)(11.11%)；COPD穩(wěn)定期和急性加重期各45例，采集患者自發(fā)痰和誘導(dǎo)痰標(biāo)本各90份，誘導(dǎo)痰和自發(fā)痰樣本的平均細(xì)胞存活率均為98%。

3種炎癥標(biāo)志物中，趨化因子CCL5在急性加重期的痰標(biāo)本中顯著升高，且在自發(fā)痰中升高的水平較誘導(dǎo)痰更為顯著，而在穩(wěn)定期時(shí)與誘導(dǎo)痰樣本相比，自發(fā)痰中CCL5的升高沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其他炎癥標(biāo)志物IL-6和IL-8在不同時(shí)期誘導(dǎo)痰和自發(fā)痰樣本中的表達(dá)水平均未見明顯趨勢(shì)(見表1)。

表1 COPD急性加重期和穩(wěn)定期患者誘導(dǎo)痰和自發(fā)痰中炎癥標(biāo)志物的比較

在表2中可觀察到自發(fā)痰和誘導(dǎo)痰樣本中測(cè)量的炎癥標(biāo)志物與臨床變量間的潛在聯(lián)系。對(duì)比戒煙者，目前吸煙者自發(fā)痰中趨化因子CCL5的水平均明顯升高，在誘導(dǎo)痰中CCL5的升高水平?jīng)]有顯著地差異；而IL-6和IL-8兩種炎癥標(biāo)志物的水平在目前吸煙者和戒煙者的不同痰標(biāo)本中均沒有顯著的差異。另一方面，GOLD分級(jí)處于Ⅲ級(jí)～Ⅳ級(jí)的COPD患者自發(fā)痰和誘導(dǎo)痰中CCL5的水平明顯高于GOLD分級(jí)Ⅱ級(jí)的患者，且自發(fā)痰和誘導(dǎo)痰標(biāo)本的變化規(guī)律時(shí)相同的，其余指標(biāo)無明顯升高趨勢(shì)。

表2 吸煙、GOLD分級(jí)與COPD患者誘導(dǎo)痰和自發(fā)痰標(biāo)本中炎癥標(biāo)志物的關(guān)系

為了評(píng)估急性加重期誘導(dǎo)痰檢查的安全性，本研究計(jì)算了所有患者在誘導(dǎo)期間預(yù)計(jì)FEV1%的下降百分比，結(jié)果顯示穩(wěn)定期預(yù)計(jì)FEV1%的下降幅度(18.59±4.80)%明顯高于急性加重期(14.60±4.07)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值=4.253，P值<0.001)。無論疾病狀態(tài)和嚴(yán)重程度如何，誘導(dǎo)操作后均沒有不良事件發(fā)生。

討 論

本研究結(jié)果表明，三種不同的炎癥標(biāo)志物在誘導(dǎo)痰和自發(fā)痰中測(cè)量水平的一致性較低。在COPD急性加重期測(cè)定時(shí)，自發(fā)痰樣本中的趨化因子CCL5的水平，顯著高于誘導(dǎo)痰樣本。此外，僅在自發(fā)痰樣本中發(fā)現(xiàn)吸煙狀態(tài)與CCL5之間的有密切聯(lián)系，而GOLD分級(jí)在自發(fā)痰和誘導(dǎo)痰樣本中均與CCL5的水平相關(guān)。

有研究表明，PBS和二硫蘇糖醇可能會(huì)影響某些細(xì)胞因子的復(fù)原，從而影響樣本的測(cè)量結(jié)果[14, 22]。然而，在本研究中所有的痰標(biāo)本都使用了完全相同的處理方案，因此這應(yīng)該不會(huì)對(duì)自發(fā)痰和誘導(dǎo)痰樣本之間的測(cè)量水平產(chǎn)生不同的影響。另外，所有的炎性標(biāo)志物都是同時(shí)批量測(cè)量的，因此潛在的測(cè)量誤差大于分批檢測(cè)。我們?cè)跇?biāo)本收集結(jié)束后在同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)所有的痰液標(biāo)本都在同一個(gè)平板上進(jìn)行了檢測(cè)分析。因此，自發(fā)痰和誘導(dǎo)痰樣本之間的測(cè)量誤差應(yīng)該是一致的。第三，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)炎癥標(biāo)志物中CCL5的水平與吸煙只在自發(fā)痰中有關(guān)聯(lián)，在誘導(dǎo)痰中不相關(guān)，而GOLD分級(jí)與CCL5的關(guān)系在誘導(dǎo)痰和自發(fā)痰中均有顯著的差異。最后，在病情惡化期間即急性加重期是否選擇進(jìn)行誘導(dǎo)操作，除了基于患者血氧飽和度的水平之外，還取決于幾個(gè)主觀因素；最重要的是，患者是否愿意接受誘導(dǎo)，以及臨床醫(yī)生對(duì)不良反應(yīng)的評(píng)估。因此，從本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中不可能得出以下結(jié)論，即誘導(dǎo)痰操作在所有的病情惡化期間都是安全的。

雖然早在2002年已經(jīng)有文章提出關(guān)于自發(fā)痰和誘導(dǎo)痰樣本是否可以進(jìn)行比較的研究[6]，但目前已經(jīng)發(fā)表的研究仍較少。在一項(xiàng)關(guān)于自發(fā)痰和誘導(dǎo)痰中IL-8水平的差異性研究報(bào)告中顯示穩(wěn)定期COPD患者兩種痰中IL-8水平?jīng)]有顯著性差異[23-24]。本研究結(jié)果也證實(shí)在COPD穩(wěn)定期，IL-6和IL-8水平在自發(fā)痰和誘導(dǎo)痰中均沒有明顯的改變。此外，本研究結(jié)果還證實(shí)在急性加重期也可得到同樣的結(jié)果。而在自發(fā)痰和誘導(dǎo)痰樣本中IL-6、IL-8水平與臨床變量間的潛在聯(lián)系的研究結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)，雖然與既往吸煙的患者相比，目前吸煙的COPD患者自發(fā)痰中IL-6和IL-8的水平略高于誘導(dǎo)痰，但二者之間無明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在GOLD分級(jí)與炎癥標(biāo)志物的水平的相關(guān)性研究中也發(fā)現(xiàn)，雖然GOLD分級(jí)Ⅱ～Ⅳ級(jí)患者誘導(dǎo)痰中IL-6和IL-8的水平較自發(fā)痰略低，但其差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與以上結(jié)果不同的是，與誘導(dǎo)痰樣本相比，急性加重期時(shí)趨化因子CCL5的水平在自發(fā)痰中顯著升高，但在穩(wěn)定期時(shí)這種升高的趨勢(shì)尚不明顯。

先前的研究已經(jīng)證明，誘導(dǎo)早期采集的痰與誘導(dǎo)后期采集的痰具有不同的濃度和細(xì)胞組成[25]。位于中央氣道的痰液更可能在早期被采集，故自發(fā)痰所采集的痰液最可能來自于中央氣道；而誘導(dǎo)痰標(biāo)本所采集的痰液可能來自于更遠(yuǎn)端的氣道(如支氣管等)。研究表明，中央和遠(yuǎn)端氣道在上皮成分[26]、免疫細(xì)胞分布[25, 27-28]和可能的呼吸道微生物群組成[29]方面都有所不同。因此，從理論上講，自發(fā)痰和誘導(dǎo)痰標(biāo)本的炎癥標(biāo)志物水平很有可能存在較大的差異。然而，當(dāng)患者不能耐受誘導(dǎo)痰檢測(cè)或誘導(dǎo)操作的安全性不能確定時(shí)，自發(fā)痰可能是誘導(dǎo)痰的有效替代方案，并允許在初級(jí)醫(yī)療保健環(huán)境中進(jìn)行采樣。有研究報(bào)道，自發(fā)痰中的細(xì)胞活性比誘導(dǎo)痰中的細(xì)胞活性差[19]。在本研究中，由于從標(biāo)本采集到加工處理的時(shí)間非常短，一般控制在30分鐘以內(nèi)，故自發(fā)痰樣本的存活率與誘導(dǎo)痰樣本中的存活率均很高，平均細(xì)胞存活率約為98%。

本研究結(jié)果顯示趨化因子CCL5的測(cè)量結(jié)果的在自發(fā)痰和誘導(dǎo)痰中一致性很低，提示我們測(cè)量自發(fā)痰中炎癥標(biāo)志物的水平可能會(huì)有重要的臨床價(jià)值。此外，雖然自發(fā)痰和誘導(dǎo)痰中炎癥標(biāo)志物的比較對(duì)某些標(biāo)志物無效，但對(duì)其他標(biāo)志物如趨化因子CCL5是有效的。在之后研究中可以考慮擴(kuò)大臨床樣本量并增加測(cè)量指標(biāo)，以便于篩選出可以幫助臨床診斷和治療的有差異的生物標(biāo)志物。

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于重度COPD患者在急性加重期進(jìn)行誘導(dǎo)操作的安全性的數(shù)據(jù)仍然很少，在幾項(xiàng)研究中，誘導(dǎo)痰采集是在急性加重期進(jìn)行的，但這些研究并沒有對(duì)該過程可能產(chǎn)生的潛在不良反應(yīng)進(jìn)行報(bào)道[5, 30-31]。本研究的結(jié)果顯示無論是在COPD穩(wěn)定期還是在急性加重期間，都沒有記錄到不良事件的發(fā)生。這一結(jié)果與其他報(bào)告[32]是一致的，但本研究通過納入嚴(yán)重和非常嚴(yán)重的COPD患者來進(jìn)一步擴(kuò)大研究對(duì)象的范圍。然而，應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是，在進(jìn)行誘導(dǎo)操作前工作人員需要采取必要的預(yù)防措施，例如準(zhǔn)備充足的急救藥物，并且所有的誘導(dǎo)操作只能由經(jīng)過專業(yè)訓(xùn)練的醫(yī)務(wù)人員進(jìn)行[33]。目前的研究結(jié)果提示，在檢測(cè)穩(wěn)定期和急性加重期COPD患者痰標(biāo)本中炎癥標(biāo)志物的水平時(shí)，有必要說明采樣的方法，因?yàn)椴煌牟蓸臃椒ǐ@得的分析結(jié)果可能是不一致的。自發(fā)痰和誘導(dǎo)痰標(biāo)本中炎癥標(biāo)志物水平的比較可能因每種炎癥標(biāo)志物的不同而呈現(xiàn)不同的結(jié)果，應(yīng)該在每項(xiàng)研究中加以解決。在不可能進(jìn)行誘導(dǎo)痰采樣的情況下，與其他樣本相比，自發(fā)痰樣本可能會(huì)提供一定的臨床價(jià)值。