魏小婉 魯美霞 高佳男 李曉博 楚荷瑩

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是呼吸系統(tǒng)發(fā)病率最高、影響力最大的一種疾病，簡稱為慢阻肺[1-3]。長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是一種長度超過200nts的非編碼轉(zhuǎn)錄本，雖不能表達遺傳信息但在細胞生物學行為及疾病的發(fā)生過程中都有十分關(guān)鍵的影響[4-5]。研究顯示慢阻肺患者的lncRNA表達水平與健康者有十分大的差別[6-9],其中就包括lncRNA MEG3。微小RNA(microRNA )是一種內(nèi)源性非編碼RNA，它可以裂解mRNA使其失活并抑制翻譯過程[10], 研究表明lncRNA可通過與miRNA相互作用參與多種病理過程[11]。有研究顯示慢阻肺患者miR-15b-5p的表達高于不吸煙的健康者[12-13]，本研究通過ENCORI(The Encyclopedia of RNA interactomes)數(shù)據(jù)庫預測出miR-15a-5p可與lncRNA MEG3相互作用。miR-15a-5p與miR-15b-5p同為miR-15家族[14]具有相似的生理作用。因此筆者預測lncRNA MEG3也可能通過miR-15a-5p介導慢阻肺的發(fā)生發(fā)展。

資料與方法

一、研究對象

選取2020年8月至2021年4月在鄭州大學第一院就診的慢阻肺患者共43例，其中急性加重期28例，穩(wěn)定期15例及健康者26例。

1 慢阻肺組入組標準：(1) 根據(jù)2020年GOLD[3]中慢阻肺的診斷標準確診為慢阻肺者。(2)急性加重期患者來源于鄭州大學第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科病房的住院病人，具有明顯的胸悶、喘息等臨床癥狀，且有因慢阻肺急性加重住院治療的需求。(3)穩(wěn)定期患者處于疾病穩(wěn)定期，沒有呼吸道癥狀短期內(nèi)迅速變差，并且3個月內(nèi)無口服皮質(zhì)醇類或抗生素史。

2 慢阻肺組排除標準：(1)患有呼吸系統(tǒng)的其他疾病(如哮喘、處于活動期的肺結(jié)核、肺膿腫、肺間質(zhì)纖維化、肺癌等)。(2)患有嚴重的肝功能衰竭，腎功能損害，心、腦血管疾病及惡性腫瘤等。(3)年齡超過85歲或小于18歲。

3 對照組：選取同期于我院檢查并符合排除標準的健康者26例為對照組，入選者均無呼吸系統(tǒng)疾病。

本研究經(jīng)鄭州大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，倫理審查編號：2021-KY-0472-003，所有患者均獲得知情同意。

二 、材料與試劑

見表1。

表1 材料與試劑

三、實驗方法

1 血液標本采集處理：使用EDTA抗凝采血管采集所納入的慢阻肺患者入院24小時內(nèi)及同期健康對照組外周靜脈血標本3～5mL，以4℃、1500rpm的速率離心10min，棄上清。血細胞用紅細胞裂解液(北京 索萊寶)裂紅2次后加入2mL無血清凍存液(蘇州 新塞美)，移至凍存管中編碼封裝，于-80℃冰箱中冷凍保存。

2 使用qRT-PCR法檢測LncRNA MEG3的表達水平：將細胞從-80℃冰箱中取出后迅速放置于37℃恒溫水浴鍋中使細胞復蘇，按照試劑說明書提取總RNA(使用總RNA快速提取試劑盒 北京 博邁德)，再根據(jù)cDNA合成試劑盒(北京 康為)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。最后按照qRT-PCR試劑盒(美國 Everbright)的使用說明，加入PCR所需試劑，在qRT-PCR儀器(美國 Thermo Fisher)上進行操作，所有樣本均重復三次。以GAPDH表達水平作為內(nèi)參照，各組患者LncRNA MEG3的表達量均采用2-ΔΔCt法計算。引物列表如下：lncRNA MEG3-F primer：GCCCTGACCTTTGCTATGCT； lncRNA MEG3-R primer：TCGACAAAGACTGACACCCC；GAPDH F primer：TGACCACAGTCCATGCCATCAC；GAPDH R primer：GCCTGCTTCACCACCTTCTTGA。

3 使用qRT-PCR法檢測miR-15a-5p的表達水平：細胞復蘇及總RNA提取同上，采用加Poly(A)尾法使用miRNA cDNA合成試劑盒(北京 康為)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。同樣根據(jù)miRNA qRT-PCR試劑盒(北京 康為)使用流程，在 PCR儀上進行反應(yīng)，所有樣本均重復三次，以U6表達水平作為內(nèi)參照，各組患者miR-15a-5p的表達量均采用2-ΔΔCt法計算。引物列表如下：hsa-miR-15a-5p F primer: CCCTAGCAGCACATAATGGTTTG；hsa-miR-15a-5p R primer: 試劑盒通用引物；U6 F primer: CTCGCTTCGGCAGCACA；U6 R primer: AACGCTTCACGAATTTGCGT。

4 采集各入組患者臨床資料：包括入院24小時內(nèi)檢驗結(jié)果、慢性阻塞性肺疾病評估測試問卷(CAT)評分，48小時內(nèi)我院肺功能檢查結(jié)果。

四、統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

一、三組患者基本資料、實驗室檢查及肺功能指標等比較

急性加重組與穩(wěn)定期組及健康對照組相比，男性多于女性，年齡較大，且BMI相對偏低。急性加重組GOLD分級多為重度、極重度，穩(wěn)定期組多為輕、中度，兩者具有顯著不同。急性加重組CAT評分顯著高于穩(wěn)定期組。肺功能檢查指標均低于處于穩(wěn)定期組患者，去年急性住院中位次數(shù)多于后者(見表2)。

二、各組患者LncRNA MEG3、miR-15a-5p指標慢阻肺組LncRNA MEG3相對表達量為1.43±1.29，高于對照組1.0±0.00(P=0.043)；miR15a-5p相對表達量為0.63±0.48，低于對照組1.0±0.00(P=0.001)。

表2 三組患者基本資料、實驗室檢查及肺功能指標等

將慢阻肺組分為急性加重組與穩(wěn)定期組，比較三組患者LncRNA MEG3、miR-15a-5p的相對表達。急性加重組LncRNA MEG3相對表達量為1.67±1.55，穩(wěn)定期組為0.99±0.29，急性加重組高于穩(wěn)定期組(P=0.04),也明顯高于對照組(P=0.16)。急性加重期miR-15a-5p相對表達量為0.60±0.39，穩(wěn)定期為0.67±0.60，急性加重組明顯低于對照組(P<0.001)。(見圖1，2)。

圖1 三組患者LncRNA MEG3表達量注：*P<0.05

圖2 三組患者miR-15a-5p表達量注：*P<0.05,****P<0.001,nsP>0.05

三、慢阻肺患者LncRNA MEG3、miR-15a-5p及其與臨床指標相關(guān)性分析

慢阻肺患者中LncRNA MEG3表達水平與miR-15a-5p成負相關(guān)(r=-0.396，P=0.02)，與CAT評分及C反應(yīng)蛋白成正相關(guān)(r分別為0.478，0.508，P分別為0.002，0.003)，與是否吸煙、住院時長、GOLD分級、肺功能指標等均無相關(guān)性(圖3-5)。

圖3 LncRNA MEG3與miR-15a-5p相關(guān)性

圖4 LncRNA MEG3與CAT評分相關(guān)性

圖5 LncRNA MEG3與CRP相關(guān)性

四、ROC曲線及Logistic回歸分析LncRNA MEG3及miR-15a-5p對慢阻肺患者的診斷能力

應(yīng)用ROC曲線分析LncRNA MEG3診斷出慢阻肺的最佳臨界值為0.804，曲線下面積為0.661(95%CI0.5239～0.7981)，靈敏度及特異度分別為76.92%及60%。應(yīng)用ROC曲線分析miR-15a-5p診斷出慢阻肺的最佳臨界值為0.56，曲線下面積為0.66(95%CI0.490～0.834)，靈敏度及特異度分別為50%及77.27%。應(yīng)用LncRNA MEG3聯(lián)合miR-15a-5p診斷出慢阻肺的曲線下面積為0.721(95%CI0.5755～0.8669)，靈敏度及特異度分別為81.82%及55%(詳見圖6～8)。單因素二元Logistic回歸分析確定了幾個影響慢阻肺發(fā)生的重要因素(因變量：慢阻肺組賦值為1，對照組賦值為0；自變量：男性賦值為1，女性賦值為0；吸煙賦值為1，不吸煙賦值為0，分類協(xié)變量以取值水平最小的作為參照)。進一步多因素Logistic回歸分析其中吸煙為慢阻肺發(fā)生的危險因素(OR20.239，95%CI0.904～11.066，P=0.001)，miR-15a-5p為保護性因素(OR0.029，95%CI1.140～9.718，P=0.002)(見表3)。

表3 Logistic回歸分析影響慢阻肺發(fā)生的因素

圖6 LncRNA MEG3診斷COPD的ROC曲線

圖7 miR-15a-5p診斷COPD的ROC曲線

圖8 LncRNA MEG3聯(lián)合miR-15a-5p診斷COPD的ROC曲線

討 論

慢性阻塞性肺疾病(COPD)大多是由于暴露于有害氣體引起的，其病理改變?yōu)闅獾纼?nèi)持續(xù)慢性高炎癥水平造成肺泡結(jié)構(gòu)破裂融合、血管內(nèi)皮受損、血管管壁增厚管腔狹窄，主要臨床特征為長期連續(xù)的氣流受限(不能完全恢復)[3]，許多因素參與了慢阻肺的發(fā)展過程，但是具體詳細的分子通路還不完全清晰。由于高通量測序技術(shù)日漸成熟，生物信息技術(shù)被越來越多的應(yīng)用于醫(yī)學領(lǐng)域，人們不斷發(fā)現(xiàn)出與慢阻肺相關(guān)的LncRNA[15]，研究表明lncRNA1(SALRNA1)可通過同時調(diào)控SIRT1/p53和SIRT1/FoxO3a兩條信號通路，介導肺泡Ⅱ型肺泡上皮細胞的衰老[16]；Tang等通過收集慢阻肺患者和非慢阻肺患者的肺組織，經(jīng)基因芯片技術(shù)挖掘與慢阻肺發(fā)病相關(guān)的lncRNA，發(fā)現(xiàn)lncRNA MEG3與LncRNA TUG1顯著上調(diào)表達[17]。LncRNA TUG1可通過上調(diào)α-SMA和纖維蛋白的表達，抑制人肺上皮細胞和肺成纖維細胞的增殖[17]，并抑制慢阻肺中miR-145-5p/DUSP6軸來促進氣道重塑[18]。研究表明lncRNA MEG3可通過miR-218介導CRP、IL-1β、IL-6和單核細胞趨化蛋白-1等炎癥因子的表達來調(diào)節(jié)香煙煙霧誘導的肺內(nèi)皮細胞凋亡和炎癥反應(yīng)[9]。本研究發(fā)現(xiàn)慢阻肺患者外周血中l(wèi)ncRNA MEG3表達水平高于健康者，與穩(wěn)定期組相比急性加重組lncRNA MEG3表達升高尤為突出，并且與炎癥因子CRP成強正相關(guān)，與CAT評分成正相關(guān)。這與既往研究結(jié)果相符，表明lncRNA MEG3可能通過促進CRP等炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生參與了慢阻肺的發(fā)生發(fā)展，并且lncRNA MEG3水平越高則患者癥狀及疾病嚴重程度越重。

據(jù)報道m(xù)iRNA可以負向調(diào)節(jié)mRNA并抑制翻譯過程，從而可以根據(jù)不同的細胞類型，不同程度的抑制蛋白質(zhì)輸出至能起作用的最佳水平[19-20]。其中miR-15a-5p不僅在包括腎癌、肝細胞癌、子宮內(nèi)膜癌等惡性腫瘤發(fā)生中起重要作用[21-22]，通過調(diào)節(jié)人體內(nèi)巨噬細胞的炎癥反應(yīng)參與敗血癥的發(fā)生[23]，還可以通過調(diào)控VEGF/p38/MMP-2信號通路誘導肺動脈高壓的發(fā)生[24]。但其在慢阻肺中的作用尚不清楚。越來越多證據(jù)表明lncRNA MEG3通過與miRNA相互結(jié)合發(fā)揮作用，本研究通過ENCORI數(shù)據(jù)庫預測出miR-15a-5p是lncRNA MEG3的潛在靶標，因此筆者預測lncRNA MEG3可能通過miR-15a-5p參與慢阻肺的發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)miR-15a-5p在慢阻肺患者中明顯的降低，且急性加重組中miR-15a-5p降低更為顯著。并且慢阻肺患者中miR-15a-5p的表達水平與lncRNA MEG3呈顯著負相關(guān)。這與Ezzie[12]的研究中miR-15b-5p在肺泡灌洗液中表達水平升高不同，其原因可能由于檢測的樣本不同，有學者報道同一患者的血漿和支氣管肺泡細胞學之間的miRNA 沒有明顯的關(guān)系[25]，并且尚未有人研究過慢阻肺患者肺組織或外周血中miR-15a-5p的表達水平，故無從得知miR-15a-5p在慢阻肺患者中的表達是否與miR-15b-5p一致。但Yuan等發(fā)現(xiàn)miR-15a-5p抑制劑可恢復細胞侵襲、凋亡的作用[26]，本研究經(jīng)過多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)miR-15a-5p是慢阻肺發(fā)生的唯一保護性因素(OR0.029，P=0.002)與此研究相符，故筆者推測慢阻肺患者miR-15a-5p的低表達可能緩解炎癥因子及細胞凋亡。通過ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)lncRNA MEG3及miR-15a-5p都對慢阻肺具有一定的診斷價值A(chǔ)UC分別為0.661、0.66。靈敏度及特異度分別為76.92%、50%及60%、77.27%。lncRNA MEG3的靈敏度高但特異性較低，而miR-15a-5p的特異性高但靈敏度較低，兩者相結(jié)合對慢阻肺有較好的診斷介質(zhì)，AUC為0.721靈敏度及特異度分別為81.82%及55%。

我們的研究中未發(fā)現(xiàn)慢阻肺患者lncRNA MEG3及miR-15a-5p的表達水平并與是否吸煙以及肺功能指標等有明顯相關(guān)性，可能是因為慢阻肺中l(wèi)ncRNA-micro RNA基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)復雜，對人體內(nèi)生物學行為的調(diào)控受多種因素的影響。并且我們收集的標本數(shù)目有限，并且臨床指標的個體差異性較大，受影響因素較多，因此其與各臨床指標的關(guān)系需進一步研究。

本研究存在一定的局限性，未來我們將通過細胞模型，基因敲除或過表達及雙熒光素酶實驗明確慢阻肺患者lncRNA MEG3與miR-15a-5p的具體傳導通路。總之，慢阻肺患者外周血中l(wèi)ncRNA MEG3表達水平升高，miR-15a-5p表達水平明顯下降并且與疾病嚴重程度相關(guān)，lncRNA MEG3聯(lián)合miR-15a-5p對慢阻肺有較好的診斷價值，我們推測LncRNA MEG3通過負向調(diào)節(jié)miR-15a-5p介導慢性阻塞性肺疾病的進展。