肝細(xì)胞癌(HCC)是一種常見的惡性腫瘤， HCC的發(fā)生與肝炎病毒感染、酗酒、化學(xué)致癌物等多種因素相關(guān)。HCC的治療包括手術(shù)、靶向治療藥物如索拉菲尼、肝移植等多種方法，但復(fù)發(fā)比例較高。白介素-2(IL-2)是一種淋巴因子，對(duì)于癌細(xì)胞有殺傷作用。microRNA是一種非編碼單鏈小RNA分子，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和凋亡等眾多生物學(xué)進(jìn)程。microRNA與靶向調(diào)節(jié)基因結(jié)合，實(shí)現(xiàn)調(diào)控靶基因蛋白的表達(dá)，microRNA的調(diào)控作用在肝癌、胰腺癌等多種腫瘤中均有體現(xiàn)

。microRNA-520b(miR-520b)被發(fā)現(xiàn)在肺癌、乳腺癌等腫瘤中表達(dá)降低，其可能對(duì)肝癌細(xì)胞也具有調(diào)控作用

，但關(guān)于miR-520b與肝癌之前的關(guān)系尚無研究報(bào)道。miR-520b可調(diào)節(jié)多種基因，包括一些炎癥因子。我們推測(cè)miR-520b可能對(duì)IL-2具有靶向調(diào)節(jié)作用。本研究擬探究miR-520b靶向IL-2調(diào)節(jié)肝細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本、細(xì)胞 收集2019年3月至2020年3月在我院手術(shù)切除并經(jīng)病理確診的42例原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者術(shù)后肝癌及其癌旁組織。患者平均年齡(54.3±4.56)歲；腫瘤直徑3.2～10.6 cm；Child肝功能分級(jí)A級(jí)20例，B級(jí)22例。標(biāo)本取材2 cm組織。患者納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理診斷確診為原發(fā)肝細(xì)胞癌，癌旁組織無癌殘留。排除標(biāo)準(zhǔn)：化療、放療患者；合并其他腫瘤者；嚴(yán)重感染者。研究獲得患者同意并通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。選擇肝癌細(xì)胞系HepG2開展細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

麋鹿小姐緊了緊懷中的酒，仿佛這是她唯一的依靠。紅色的圍巾讓這個(gè)圣誕節(jié)的夜晚顯得更有氣氛。出租車?yán)锏臏囟群芘?，她陷入了回憶中。記得酒刀先生曾?duì)她講：“溫度過高會(huì)使葡萄酒成熟速度太快，變得沒那么細(xì)膩，還縮短了葡萄酒壽命。溫度太低又會(huì)讓葡萄酒成熟非常緩慢，需要等待更長(zhǎng)時(shí)間?！彼傆X得，酒刀先生說的不止是葡萄酒，還有感情。

1.2 主要試劑 Lipofectamine

2000脂質(zhì)體購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，MTT試劑盒購(gòu)自英國(guó)Abcam公司， Annexin V-FITC/PI試劑盒試劑盒購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，Trizol總RNA抽提試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，qRT-PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司，DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司。miR-520b mimiCS和miR-NC購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。

1.3 方法

2.4 3組細(xì)胞中miR-520b的表達(dá) 見圖4。過表達(dá)組細(xì)胞中miR-520b的mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組和空白對(duì)照組(

<0.05)，提示miR-520bmimic轉(zhuǎn)染成功。

1.3.2 RT-PCR檢測(cè)miR-520b在肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞提取并測(cè)定總RNA，逆轉(zhuǎn)象合成cDNA，進(jìn)行PCR檢測(cè)。反應(yīng)引物： miR-520b上游：5′-AAAGUGCUUCCUUUUAGAGGG-3′， miR-520b下游：5′-CUCUAAAAGGAAGCACUUUUU-3′， GAPDH上游：5′-CCACTCCTCCACCTTTGAC-3′， GAPDH下游：5′-ACCCTGTTGCTGTAGCCA-3′。反應(yīng)條件95℃ 3 min,40循環(huán)：95℃ 12 s，62℃ 50 s。采用ARI7500軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

2.5 3組細(xì)胞IL-2的表達(dá) 見圖5。Western blot的結(jié)果表明，過表達(dá)組細(xì)胞的IL-2表達(dá)顯著高于對(duì)照組和空白對(duì)照組(

<0.05)。

1.3.3 免疫組織化學(xué)觀察組織標(biāo)本 常規(guī)方法操作。

2.3 miR-520b對(duì)IL-2靶向作用驗(yàn)證 見圖3。過表達(dá)組細(xì)胞中野生型IL-2的3′UTR端熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)較空白對(duì)照組低(

<0.05)。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證IL-2是miR-520b的靶基因。

1.3.5 檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲情況 ①遷移實(shí)驗(yàn)：收集生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期細(xì)胞，制成5×10

個(gè)/ml單細(xì)胞懸液。在Transwell上室加入200 μl單細(xì)胞懸液，下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液 500 μl。各組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室用PBS清洗2遍。甲醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫室溫下染色20 min，PBS 清洗3遍，顯微鏡觀察拍照，計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)量。②侵襲實(shí)驗(yàn)：參照說明書制備有基質(zhì)膠Transwell小室，其他步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

為了這件事，我發(fā)揮自身特長(zhǎng)草書唐詩(shī)一幅，到裝裱店加急仿古精裱后如期帶去，意外的賀禮，使教師職業(yè)的妹妹格外喜愛，她表示，這是錦上添花。

另外，根據(jù)式(7)得到的速度估計(jì)值vr對(duì)目標(biāo)回波進(jìn)行粗補(bǔ)償，即構(gòu)造式(8)并進(jìn)行IDFT操作即可得到目標(biāo)距離的粗估計(jì)值R0r：

1.3.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-520b對(duì)IL-2的靶向調(diào)控作用 利用TargetScan軟件預(yù)測(cè)miR-520b與IL-2的結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建野生型(WT)及突變型(MUT)IL-2的3′UTR雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)HepG2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-520b mimics和miR-NC，后用雙熒光素酶分析系統(tǒng)檢測(cè)各組細(xì)胞熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織和癌旁組織中miR-520b和IL-2的表達(dá) 見圖1。肝癌組織中miR-520b和IL-2的表達(dá)顯著低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均

<0.05)。

2.2 肝癌組織和癌旁組織中IL-2的表達(dá) 見圖2。相比于癌旁組織，肝癌組織中IL-2表達(dá)顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

<0.05)。

1.3.4 檢測(cè)細(xì)胞增殖率、細(xì)胞凋亡率及遷移實(shí)驗(yàn)中IL-2的表達(dá)水平 以MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖率；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；western blot檢測(cè)遷移實(shí)驗(yàn)中IL-2的表達(dá)水平。

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 細(xì)胞分為miR-520b過表達(dá)組(簡(jiǎn)稱過表達(dá)組)、空白對(duì)照組和對(duì)照組。常規(guī)方法復(fù)蘇HepG2細(xì)胞，根據(jù)Lipofectamine

2000說明書將miR-520b mimics及miR-NC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至過表達(dá)組和空白對(duì)照組細(xì)胞中，對(duì)照組細(xì)胞不進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，將重組IL-2添加到3組細(xì)胞中最終濃度為4 mu/L培養(yǎng)24 h。用qRT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染成功后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.6 檢測(cè)miR-520b對(duì)肝癌細(xì)胞藥物敏感性的影響 按每孔1×10

個(gè)密度將HepG2細(xì)胞接種于6孔板中，分為對(duì)照組、過表達(dá)組、藥物組(IL-2)、藥物混合組(IL-2+miR-520b)。對(duì)照組細(xì)胞不做處理，過表達(dá)組和藥物混合組細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-520b mimics，細(xì)胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h，將IL-2添加到藥物組和藥物混合組細(xì)胞中，最終濃度4 mu/L，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，采用MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖率。

如果地方官員或者企業(yè)負(fù)責(zé)人行為構(gòu)成違法或者犯罪，為了掩蓋自己的違法犯罪事實(shí)，主動(dòng)支付費(fèi)用，這種行為就不構(gòu)成敲詐勒索，因?yàn)榕u(píng)者發(fā)表的文章是建立在客觀事實(shí)基礎(chǔ)之上的，是公民行使監(jiān)督權(quán)的具體表現(xiàn)。如果地方官員或者企業(yè)負(fù)責(zé)人迫于壓力，擔(dān)心自己的名譽(yù)或者信譽(yù)受到影響，不得已向批評(píng)者支付費(fèi)用，那么，這種行為屬于敲詐勒索。我國(guó)刑法第274條規(guī)定，敲詐勒索公私財(cái)物，數(shù)額較大的，處三年以下有期徒刑、拘役或者管制；數(shù)額巨大或者有其他嚴(yán)重情節(jié)的，處三年以上十年以下有期徒刑。

在小學(xué)數(shù)學(xué)難點(diǎn)和重點(diǎn)的教學(xué)過程中，利用多媒體視音結(jié)合的特點(diǎn)，將小學(xué)數(shù)學(xué)教學(xué)的難點(diǎn)和重點(diǎn)的解題過程及方法，通過大屏幕展現(xiàn)出來，一是可以幫助學(xué)生更好地理解和掌握數(shù)學(xué)學(xué)習(xí)的重點(diǎn)和要點(diǎn)；二是可以將教學(xué)課件傳送到家長(zhǎng)的手中，在家長(zhǎng)的幫助下，讓學(xué)生溫故知新，保障學(xué)生在家時(shí)能受到同樣的教育與教學(xué)，從而促進(jìn)小學(xué)數(shù)學(xué)教學(xué)效果的提升。

2.6 miR-520b對(duì)IL-2處理后的3組細(xì)胞增殖率和凋亡率的影響 見表1。

2.7 miR-520b對(duì)IL-2處理后的3組細(xì)胞遷移和侵襲的能力影響 空白對(duì)照組與對(duì)照組比較，細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性和侵襲性無顯著差異，過表達(dá)組細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性和侵襲性低于對(duì)照組和空白對(duì)照組(

<0.05)。見圖6、7。

2.8 miR-520b對(duì)IL-2處理后的4組細(xì)胞藥物敏感性影響 見圖8。過表達(dá)組細(xì)胞與對(duì)照組比較，無顯著差異，藥物組細(xì)胞增殖率低于對(duì)照組，藥物混合組細(xì)胞增殖率較藥物組和過表達(dá)組均顯著下降(

<0.05)。

3 討論

肝癌的發(fā)生發(fā)展是長(zhǎng)期復(fù)雜的過程，它是一個(gè)多基因相關(guān)的疾病，因此采用基因靶向治療，從分子機(jī)制的角度探索治療方法是當(dāng)前肝癌治療的研究熱點(diǎn)。microRNA與癌癥發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切，可對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、遷移、侵襲產(chǎn)生影響，同時(shí)具有促癌和抑癌雙重作用影響腫瘤的進(jìn)展

。miRNA在依賴于特定組織類型的特定調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的細(xì)胞中具有不同的功能，研究表明，miR-520b是頭頸癌中的一種多功能腫瘤抑制因子

，也被證明是抑制乳腺癌、肺癌、脊柱骨肉瘤和膠質(zhì)瘤中細(xì)胞生長(zhǎng)或遷移的腫瘤抑制因子

。IL-2是重要的T細(xì)胞生長(zhǎng)因子，具有多種生物學(xué)功能，是維持機(jī)體正常免疫功能的關(guān)鍵因子，在幾乎所有腫瘤中都有表達(dá)，并對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡具有重要影響

。本研究中miR-520b和IL-2在肝癌組織表達(dá)均顯著降低，在轉(zhuǎn)染miR-520b后的肝癌細(xì)胞中miR-520b、IL-2的表達(dá)水平均增加，提示在肝癌環(huán)境下miR-520b與IL-2與肝癌的發(fā)生發(fā)展存在聯(lián)系，這與miR-520b在其他腫瘤中的表達(dá)結(jié)果具有一致性。同時(shí)我們推測(cè)miR-520b可能對(duì)IL-2存在一定的調(diào)控作用，但機(jī)制尚不清楚。

我們的競(jìng)爭(zhēng)者不僅有國(guó)內(nèi)的同行們，還有強(qiáng)勁的國(guó)外大型數(shù)字企業(yè)向國(guó)內(nèi)的大舉擴(kuò)張。這些國(guó)外大型數(shù)字企業(yè)不但擁有先進(jìn)的技術(shù)和豐富的經(jīng)驗(yàn)，還具有完善的營(yíng)銷策略。面對(duì)這些挑戰(zhàn)，我們要擺正心態(tài)，將注意力集中到自我發(fā)展上。好的競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手更能激勵(lì)我們不斷地前進(jìn)。

控制癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡是治療癌癥的主要思路。研究顯示，miR-520b對(duì)癌細(xì)胞的增殖和凋亡可產(chǎn)生影響，低表達(dá)的miR-520b可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，過表達(dá)的miR-520b 可抑制腫瘤細(xì)胞增殖

，miR-520b也可通過上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化機(jī)制抑制細(xì)胞遷移和侵襲

。還可通過靶向CD44調(diào)節(jié)腫瘤干細(xì)胞轉(zhuǎn)化來抑制頭頸癌的惡性程度

，而不同劑量的miR-520b可明顯降低肺癌A549細(xì)胞中HDAC4的表達(dá)，miR-520b抑制劑可增強(qiáng)肺癌細(xì)胞中HDAC4的表達(dá)

。IL-2具有刺激T細(xì)胞增殖和分化，促進(jìn)B細(xì)胞增殖及分泌抗體等功能

。腫瘤患者通常伴隨免疫功能的降低，表現(xiàn)為IL-2等免疫因子分泌減少，研究顯示IL-2在膀胱癌、肝癌等多種癌癥中表達(dá)降低

。本研究中利用TargetScan軟件預(yù)測(cè)miR-520b與IL-2的結(jié)合位點(diǎn)，并通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞中上調(diào)miR-520b的表達(dá)后，可明顯抑制野生型IL-2的3′UTR的熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)，提示miR-520b可對(duì)IL-2進(jìn)行直接調(diào)控，IL-2可能是miR-520b的靶基因，推測(cè)可通過增強(qiáng)miR-520b的表達(dá)來調(diào)控IL-2對(duì)肝癌實(shí)施治療。Western blot的結(jié)果提示miR-520b可能調(diào)控了IL-2表達(dá)。而轉(zhuǎn)染miR-520b后的結(jié)果，提示miR-520b可能通過靶向IL-2影響了肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)率、凋亡率、細(xì)胞遷移和侵襲。這與以往結(jié)果具有一致性。

miRNAs在癌癥耐藥的發(fā)生中也起著不可忽視的作用。有研究顯示，miR-520b可使細(xì)胞對(duì)治療藥物和輻射敏感

，其可調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的耐藥性

。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)使用IFN-α2a、GM-CSF、 IL-2 等3種因子組合處理肝癌細(xì)胞后可抑制細(xì)胞的增殖活動(dòng)

。本研究中，經(jīng)IL-2處理后的肝癌細(xì)胞在轉(zhuǎn)染了miR-520b后，細(xì)胞增殖率降低，凋亡率增加，轉(zhuǎn)移和侵襲能力均顯著降低，提示miR-520b可增強(qiáng)抑制肝癌細(xì)胞的增殖活動(dòng)，與以往研究結(jié)果相符。進(jìn)一步的藥物敏感性實(shí)驗(yàn)顯示，miR-520b聯(lián)合IL-2較單獨(dú)采用miR-520b以及單獨(dú)使用IL-2對(duì)肝癌細(xì)胞活動(dòng)的抑制作用更明顯，提示miR-520b可能通過調(diào)控IL-2影響肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、侵襲等活動(dòng)，從而影響藥物敏感性。

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