劉思佳，謝靜

益黃散治療小兒慢性腹瀉的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

劉思佳，謝靜*

湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208

采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討益黃散治療小兒慢性腹瀉的分子作用機(jī)制，為臨床用藥提供依據(jù)。通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）挖掘益黃散藥物有效成分，導(dǎo)入PubChem、SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫預(yù)測有效成分潛在靶點(diǎn)；在GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索小兒慢性腹瀉靶點(diǎn)，將有效成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集，并繪制中藥-有效成分-疾病網(wǎng)絡(luò)。通過STRING 11.0數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，運(yùn)用Cytoscape3.8.1軟件Network analyzer功能整合并構(gòu)建藥物成分-靶點(diǎn)-疾病的多層次網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。通過DAVID數(shù)據(jù)庫對交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集及KEGG通路富集分析。收集并篩選益黃散有效成分19個(gè)、藥物靶點(diǎn)541個(gè)，小兒慢性腹瀉疾病靶點(diǎn)2574個(gè)，二者交集靶點(diǎn)134個(gè)，其中PIK3CA、STAT3、VEGFR、AKT1、EGFR等基因靶點(diǎn)相互作用明顯。GO功能富集得到生物過程條目358個(gè)，細(xì)胞成分條目4個(gè)，分子功能條目42個(gè)；KEGG通路富集共計(jì)82條信號通路，主要調(diào)控癌癥途徑、癌癥中蛋白聚糖、Ras信號通路、PI3K-Akt信號通路、局灶性粘連、MAPK信號通路等。本研究揭示了益黃散在小兒慢性腹瀉治療中多途徑、多靶點(diǎn)、多成分的作用特點(diǎn)，可為后續(xù)研究提供理論基礎(chǔ)。

益黃散；腹瀉；小兒慢性腹瀉；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；信號通路；靶點(diǎn)

小兒慢性腹瀉（infantile chronic diarrhea）是嬰幼兒常見病、多發(fā)病，病程＞2個(gè)月者為慢性腹瀉，若病情遷延不愈可影響小兒生長發(fā)育，是造成兒童生長發(fā)育障礙的主要原因。目前臨床治療小兒慢性腹瀉多用腸道黏膜保護(hù)劑或腸道微生態(tài)制劑改善腸道微生態(tài)環(huán)境，從而實(shí)現(xiàn)止瀉[1]。

益黃散出自宋代錢乙《小兒藥證直訣?卷上?脈診治法》，又名補(bǔ)脾散，方中青皮、陳皮、丁香理氣祛濕，訶子收斂固澀，甘草調(diào)中補(bǔ)益，全方行氣祛濕，則脾氣自運(yùn)[2]。益黃散現(xiàn)代常用于治療嬰幼兒腹瀉、小兒消化不良，改善機(jī)體免疫力等[3]。明代萬全評價(jià)益黃散“治脾胃寒濕太甚，神品之藥也。以補(bǔ)脾胃之虛誤矣”。萬全在錢乙對小兒體質(zhì)辨為“易虛易實(shí)，易寒易熱”的基礎(chǔ)上提出“脾常不足”，指出“脾胃虛弱，萬病峰起”，脾胃功能直接關(guān)系小兒機(jī)體健康及生長發(fā)育[4]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究益黃散中各藥物成分，探討益黃散治療小兒腹瀉的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 益黃散有效成分及靶點(diǎn)篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）[5]收集益黃散中陳皮、丁香、訶子、青皮4味藥的有效成分，因甘草為常用佐使藥，本文不予討論。根據(jù)人體藥物的吸收、分布、代謝、排泄、毒性參數(shù)，以口服生物利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18為條件進(jìn)行主要有效成分篩選[6]。

1.2 中藥有效成分靶點(diǎn)預(yù)測與疾病靶點(diǎn)預(yù)測

通過PubChem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi. nlm.nih.gov/）[7]獲取中藥有效成分結(jié)構(gòu)，并保存為SDF格式，將其導(dǎo)入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstargetprediction.ch/）[8]中進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，剔除無法預(yù)測的有效成分。

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫[9]（https://www. genecards.org/），以“infantile chronic diarrhea”為檢索詞進(jìn)行檢索，獲取疾病靶點(diǎn)。

1.3 藥物-疾病共同靶點(diǎn)獲取

在生物信息學(xué)在線網(wǎng)站（http://bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/Venn/）導(dǎo)入中藥有效成分預(yù)測靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的相關(guān)基因數(shù)據(jù)，繪制韋恩圖，交集靶點(diǎn)為藥物成分-疾病共同靶點(diǎn)。

1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫（http://www.string-db.org）[10]，選用Multiple proteins工具，物種組織設(shè)定為“homo sapiens”，設(shè)置默認(rèn)參數(shù)值，篩選出網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵靶點(diǎn)，獲得交集靶點(diǎn)的蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖。將PPI網(wǎng)絡(luò)CSV格式文件導(dǎo)入Cytoscape3.8.1軟件[11]，繪制中藥-有效成分-疾病網(wǎng)絡(luò)。對網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)信息進(jìn)行計(jì)算，在工具Analyze Network中調(diào)整degree值，以節(jié)點(diǎn)degree值反映靶點(diǎn)作用大小，根據(jù)degree值對靶點(diǎn)進(jìn)行篩選分析。利用BisoGenet插件3.3.0對藥物-疾病-靶點(diǎn)進(jìn)行PPI構(gòu)圖分析。

1.5 生物通路分析

將篩選后得到的共同靶點(diǎn)通過WebGesstalt數(shù)據(jù)庫（https://www.webgestalt.org/#）[12]進(jìn)行基因本體論（GO）分析，限定物種為“homo sapiens”進(jìn)行ORA（over-representation analysis）分析，設(shè)定顯著性水平＜0.05，獲得藥物靶點(diǎn)的生物過程，分別導(dǎo)出細(xì)胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）、生物過程（biological process，BP）條目進(jìn)行分析，進(jìn)行加權(quán)集合覆蓋分析后繪制火山圖。

利用DAVID數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）[13]進(jìn)行京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析，收集＜0.01、最小計(jì)數(shù)為3、富集因子＞1.5的條目，對排名前20位的通路與靶點(diǎn)整合構(gòu)建通路圖。

2 結(jié)果

2.1 益黃散有效成分及對應(yīng)靶點(diǎn)

通過TCMSP共檢索出益黃散有效成分314個(gè)，其中陳皮63個(gè)、青皮18個(gè)、丁香117個(gè)、訶子116個(gè)，剔除無化學(xué)結(jié)構(gòu)及靶點(diǎn)的有效成分，經(jīng)篩選后得到符合標(biāo)準(zhǔn)的有效成分19個(gè)，其中包括陳皮5個(gè)（MOL000359、MOL004328、MOL005100、MOL005815、MOL005828），丁香4個(gè)（MOL000358、MOL000422、MOL000449、MOL000098），青皮4個(gè)（MOL001803、MOL004328、MOL005100、MOL005828），訶子6個(gè)（MOL009135、MOL001002、MOL009149、MOL009137、MOL006826、MOL009136）。通過PubChem數(shù)據(jù)庫獲取益黃散有效成分對應(yīng)靶點(diǎn)541個(gè)。

2.2 疾病靶點(diǎn)及交集靶點(diǎn)

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫篩選獲得小兒慢性腹瀉靶點(diǎn)2574個(gè)，設(shè)置Relevance score＞4.902935028（兩倍中位數(shù)），經(jīng)篩選后得到645個(gè)靶點(diǎn)，取中藥有效成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)交集，得到交集靶點(diǎn)71個(gè)（見圖1）。

圖1 益黃散-小兒慢性腹瀉基因靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫，設(shè)置minimum required interaction score為最高置信度0.9，隱去游離節(jié)點(diǎn)后，得到71個(gè)節(jié)點(diǎn)、155條連線關(guān)系，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖（見圖2）。71個(gè)節(jié)點(diǎn)的平均degree值為4.37，節(jié)點(diǎn)越大，degree值越高，連線越多，表示蛋白之間的關(guān)系越緊密[14]。PPI網(wǎng)絡(luò)顯示，共有靶蛋白的節(jié)點(diǎn)58個(gè)，表示相互作用的線155條，其中血管內(nèi)皮生長因子（VEGFA）與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、編碼p53蛋白（TP53）等相互作用。

2.4 GO功能富集分析結(jié)果

BP富集結(jié)果共計(jì)358個(gè)，主要富集于跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的正調(diào)控、對藥物的反應(yīng)、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路、蛋白質(zhì)自磷酸化、肽基酪氨酸磷酸化、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、積極調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞運(yùn)動的正調(diào)控，氧代謝過程、神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)、類固醇代謝過程、DNA轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控、從RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、從RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化、積極調(diào)節(jié)GTPase活性、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。見圖3。

圖2 益黃散治療小兒慢性腹瀉靶點(diǎn)PPI核心網(wǎng)絡(luò)

圖3 益黃散治療小兒慢性腹瀉GO功能富集生物過程分析

CC富集結(jié)果共4個(gè)，主要富集于內(nèi)體、復(fù)合物的組成部分，見圖4。

圖4 益黃散治療小兒慢性腹瀉GO功能富集細(xì)胞組分分析

MF富集結(jié)果共42個(gè)，富集于蛋白質(zhì)結(jié)合、ATP結(jié)合、磷脂酰肌醇-4,5-雙磷酸3-激酶活性、相同的蛋白質(zhì)結(jié)合、鋅離子結(jié)合、蛋白質(zhì)均二聚活性、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、激酶活性，見圖5。

圖5 益黃散治療小兒慢性腹瀉GO功能富集分子功能分析

2.5 KEGG通路富集分析結(jié)果

KEGG通路富集共計(jì)82條信號通路，主要富集于癌癥途徑、癌癥中蛋白聚糖、腎素-血管緊張素（Ras）信號通路、PI3K-Akt信號通路、局灶性粘連、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、人皰疹病毒（EB）感染、缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）信號通路、甲型流感等。根據(jù)“Term”選取log10值排名前20位的結(jié)果將其進(jìn)行可視化。見圖6。

圖6 益黃散治療小兒慢性腹瀉KEGG富集分析

3 討論

3.1 益黃散治療小兒慢性腹瀉的應(yīng)用

小兒慢性腹瀉發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前認(rèn)為其病因分為感染性因素和非感染性因素，感染性因素包括病毒、細(xì)菌、真菌等病原菌感染，非感染性因素則包括氣候因素或長期飲食喂養(yǎng)不當(dāng)及免疫功能低下等。由于小兒胃腸功能尚未發(fā)育完全，小腸黏膜被病毒或其他病原微生物直接侵襲，導(dǎo)致腸道微生態(tài)平衡及腸黏膜完整性被破壞，引起腸道內(nèi)電解質(zhì)和水運(yùn)轉(zhuǎn)出現(xiàn)失調(diào)，導(dǎo)致腹瀉[15]。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，益黃散具有促進(jìn)免疫蛋白IgA、IgG表達(dá)，提高炎癥控制效果，改善機(jī)體免疫功能的功效[16]。

腹瀉屬于中醫(yī)學(xué)“泄瀉”范疇，中醫(yī)認(rèn)為腹瀉的發(fā)生與脾虛密切相關(guān)，脾氣健運(yùn)則外邪不侵。錢乙注重脾胃氣機(jī)升降，善用甘溫運(yùn)化之藥。益黃散方中陳皮、青皮專理肝脾宿痰、燥濕理氣，丁香溫中止嘔，訶子澀腸止瀉，甘草補(bǔ)脾和胃。小兒脾常不足，脾胃未臻完善，飲食不知節(jié)制，乳食積滯于內(nèi)，選用益黃散取其運(yùn)脾為貴之意。江育仁教授提出“故欲健脾者旨在運(yùn)脾，欲使脾健，則不在補(bǔ)而貴在運(yùn)也”的學(xué)術(shù)思想[17]?，F(xiàn)代小兒脾胃病中虛弱不足者明顯減少，但飲食不節(jié)導(dǎo)致脾胃功能失健者大增，運(yùn)脾法受到各醫(yī)家重視與運(yùn)用。

3.2 關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)果分析

對益黃散治療小兒慢性腹瀉PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治隹芍?，PIK3CA、表皮生長因子受體（EGFR）、VEGFA、STAT3、AKT1、TP53的degree值較大，說明益黃散的生物活性成分與這些蛋白質(zhì)的結(jié)合率較高。對交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，核心靶點(diǎn)主要富集于跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路、對藥物的反應(yīng)、蛋白質(zhì)自磷酸化等生物過程。PIK3CA主要參與免疫相關(guān)、炎癥相關(guān)、凋亡抑制、能量代謝等信號通路。EGFR靶點(diǎn)表達(dá)在人腸上皮細(xì)胞的基底外側(cè)表面膜上[18]。小兒慢性腹瀉易伴隨腸道炎癥，腸道菌群失調(diào)，嚴(yán)重時(shí)可引起局部缺血，發(fā)生微循環(huán)障礙。酪氨酸激酶受體（ErbB）抑制劑可抑制腸上皮細(xì)胞EGFR信號傳導(dǎo)，降低腸上皮的生長和修復(fù)能力，導(dǎo)致腸黏膜萎縮和分泌性腹瀉。激活EGFR有助于修復(fù)腸道黏膜上皮細(xì)胞，吸收腸液，緩解腹瀉。VEGFA是一種能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖與遷移的因子，與炎性指標(biāo)、疾病活動及功能指標(biāo)具有正相關(guān)性，參與固有免疫調(diào)節(jié)，VEGFA能促進(jìn)血管生成，改善腸道缺血缺氧環(huán)境[19]。信號傳導(dǎo)及STAT3與自身免疫疾病、復(fù)發(fā)性感染等疾病有關(guān)，對輔助性T細(xì)胞17的分化有重要作用。STAT3是一類位于染色體17q21區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子，EGFR刺激DNA結(jié)合蛋白酶的STAT3產(chǎn)生反應(yīng)，其激活引發(fā)的炎癥反應(yīng)可能導(dǎo)致腸上皮屏障功能失調(diào)，以及與電解質(zhì)和水運(yùn)輸失調(diào)相關(guān)的腸道炎癥，從而導(dǎo)致腹瀉[20]。研究表明，microRNA可通過靶向抑制STAT通路分子STAT3蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制腸道病毒71的核酸和蛋白復(fù)制[21]。AKT1廣泛表達(dá)于人體各個(gè)組織，參與細(xì)胞生存及生長調(diào)控，在細(xì)胞的生長與凋亡中起到重要作用。AKT1可能是通過提高細(xì)胞因子活性、促進(jìn)病變細(xì)胞凋亡以達(dá)到治療小兒慢性腹瀉的目的[22]。

3.3 通路與生物過程分析

KEGG通路富集分析結(jié)果表明，益黃散涉及的主要炎癥通路有PI3K-Akt信號通路、HIF-1信號通路、MAPK信號通路。PI3K-Akt信號通路對細(xì)胞代謝具有多樣化的下游效應(yīng)，可直接調(diào)控營養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和代謝酶，調(diào)節(jié)關(guān)鍵的代謝過程，在腸道炎癥中發(fā)揮重要作用[23]。腹瀉的發(fā)生與炎癥反應(yīng)、腸道內(nèi)微環(huán)境變化密切相關(guān)[22]。PI3K信號通路一旦被激活，引起Akt磷酸化，進(jìn)而通過p53非依賴方式抑制細(xì)胞凋亡。鑒于炎癥因子與凋亡存在一定相關(guān)性，推測益黃散治療小兒慢性腹瀉可能通過促進(jìn)PI3K-Akt信號通路表達(dá)，抑制腸道上皮細(xì)胞凋亡，控制腸炎發(fā)生[22]。腹瀉在缺血缺氧的腸道疾病中十分常見，有研究表明，HIF-1是一種普遍存在的缺氧反應(yīng)因子，是黏膜損傷期間腸道屏障保護(hù)的關(guān)鍵因素，參與多種有助于維持屏障完整性的機(jī)制，可以控制腸黏膜上皮離子和水運(yùn)輸[24]。小兒慢性腹瀉可能引起機(jī)體微環(huán)境甚至腸道菌群的變化，腸道菌群與腹瀉的發(fā)生互為因果，機(jī)體局部缺血缺氧可激活HIF-1通路，增加基因表達(dá)。MAPK信號通路是引起機(jī)體胃腸動力功能紊亂及參與促炎因子應(yīng)答的關(guān)鍵通路，參與炎癥調(diào)控、應(yīng)激反應(yīng)等過程[25]，與細(xì)胞反應(yīng)的組織損傷有關(guān)。因此益黃散可能通過某些重要蛋白靶點(diǎn)調(diào)控PI3K-Akt信號通路、HIF-1信號通路、MAPK信號通路等，在抑制腸道炎癥反應(yīng)、減輕腸道損傷、保護(hù)腸道黏膜、改善機(jī)體微環(huán)境等方面發(fā)揮重要作用。

中藥對疾病的干預(yù)作用具有“多因微效”綜合調(diào)節(jié)的特點(diǎn)[26]，中藥化學(xué)成分復(fù)雜且復(fù)方組合形式多樣，各中藥成分之間彼此協(xié)調(diào)作用。本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，探討益黃散治療小兒慢性腹瀉機(jī)制，為中醫(yī)藥多途徑、多靶點(diǎn)、多成分治療疾病提供理論依據(jù)。但本文結(jié)果尚缺乏相關(guān)動物實(shí)驗(yàn)及臨床驗(yàn)證，有待進(jìn)一步研究。

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Study onPowder for the Treatment of Infantile Chronic Diarrhea Based on Network Pharmacology

LIU Si-jia, XIE Jing*

(Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China)

To study the molecular mechanism ofPowder for the treatment of infantile chronic diarrhea with network pharmacology; To provide basis for clinical medication.The active components ofPowder were dug from TCMSP, and then PubChem and SwissTargetPrediction databases were imported to predict potential targets of active components; the targets of infantile chronic diarrhea were searched in GeneCards database, the intersection of active component targets and disease targets was taken, and the Chinese materia medica-active components-disease network was drawn. The protein - protein interaction network was constructed by STRING 11.0 database and Cytoscape3.8.1 Network analyzer was used to integrate and construct the multi-level network relationship of medicine composition-target-disease. GO function enrichment and KEGG pathway enrichment analysis of intersection targets were carried out through DAVID database.Totally 19 active components, 541 medicine targets ofPowder, 2 574 disease targets of infantile chronic diarrhoea, and 134 intersection targets of the two were collected and screened, among which the gene targets of the PIK3CA, STAT3, VEGFR, AKT1, and EGFR were obvious. GO function enrichment resulted in 358 biological process entries, 4 cell component entries and 42 molecular function entries;KEGG pathway was enriched with 82 signaling pathways, mainly regulating cancer pathway, proteoglycan in cancer, Ras signaling pathway, PI3K - Akt signaling pathway, focal adhesion, MAPK signaling pathway, etc.This study reveals the multi-channel, multi-target and multi-component characteristics ofPowder in the treatment of infantile chronic diarrhea, so as to provide a theoretical basis for follow-up research.

Powder;diarrhea; infantile chronic diarrhea; network pharmacology; signaling pathway; target

劉思佳,謝靜.益黃散治療小兒慢性腹瀉的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究[J].中國中醫(yī)藥圖書情報(bào)雜志,2022,46(2):9-14.

R272；R285

A

2095-5707(2022)02-0009-06

10.3969/j.issn.2095-5707.2022.02.002

湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)國內(nèi)一流建設(shè)學(xué)科（4901-0200002002）

劉思佳，E-mail: 1250479541@qq.com

謝靜，E-mail: 982100692@qq.com

（2021-08-05）

（修回日期：2021-09-06；編輯：魏民）