林曉宇 韋芳玉 覃江圓 葉莞麗 易健啟 陳慧英 劉金蘭 覃繼新 蘇紀(jì)平

GABAA受體(GABA type A receptors，GABAARs)是神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性受體，介導(dǎo)GABA發(fā)揮快速的突觸抑制作用，與興奮性受體共同維持神經(jīng)元和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的興奮-抑制平衡[1]。GABAARs在胞膜表達，存在內(nèi)化與外化的動態(tài)平衡，當(dāng)胞膜GABAARs表達下降，興奮-抑制失衡，將導(dǎo)致神經(jīng)元興奮毒性，從而介導(dǎo)多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如腦缺血、癲癇等。維持GABAARs在細胞膜上的動態(tài)平衡受多個環(huán)節(jié)、多種因素的影響，包括受體自身的翻譯后修飾以及受體轉(zhuǎn)運等，其中，與GABAARs相互作用的橋尾蛋白(gephyrin)對受體內(nèi)化具有重要作用。橋尾蛋白(gephyrin)與GABAARsα1-3、γ2亞基直接結(jié)合或共定位，負責(zé)將GABAARs錨定在細胞膜上，敲除橋尾蛋白后突觸后膜的GABAARs減少。橋尾蛋白的功能與其C域上存在多個磷酸化修飾位點有關(guān)，研究證明，糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK3β)磷酸化修飾橋尾蛋白S270位點[2～4]，C域上絲氨酸S270磷酸化增強會減弱微小抑制性突觸后電流，抑制S270磷酸化增加GABAARs突觸后密度[2]。盡管有報道耳蝸存在橋尾蛋白[5]，但是，關(guān)于橋尾蛋白在聽覺神經(jīng)系統(tǒng)的作用卻知之甚少。

Qin等[6]發(fā)現(xiàn)水楊酸鈉(sodium salicylate，SS)抑制螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元(spiral ganglion neurons，SGNs)膜上的GABAARs表達，可逆地抑制GABAARs電流，SGNs興奮毒性與SS誘導(dǎo)的GABAARsβIII亞基S383磷酸化增強有關(guān)，然而，GABAARs磷酸化后的內(nèi)化與橋尾蛋白的關(guān)系尚不清楚?？紤]在SS作用下，SGNs中的橋尾蛋白S270磷酸化增強，介導(dǎo)GABAARs的內(nèi)化增強，使膜上GABAARs表達減少，從而介導(dǎo)SGNs的興奮毒性作用;鋰離子通過競爭性結(jié)合GSK3β活性需求的Mg2+位點抑制GSK3β，體外1～2 mM的鋰離子濃度即可抑制GSK3β活性[7]，故可通過LiCl抑制S270磷酸化觀察GABAARs內(nèi)化是否恢復(fù)。本研究擬采用實時熒光定量PCR和免疫印跡技術(shù)，觀察 SS作用下，SGNs膜表面GABAARsα2亞基及其總蛋白、橋尾蛋白的表達，繼而探索橋尾蛋白S270磷酸化如何影響GABAARs內(nèi)化，進一步探討GABAARs內(nèi)化的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 新生2～3天SD大鼠12只，雌雄不分，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，大鼠隨機分成四組：對照組、5 mM SS處理組(SS組)、1 mM LiCl處理組(Licl組)、5 mM SS聯(lián)合1 mM LiCl處理組(SS+LiCl組)，每組3只。

1.2主要試劑與儀器 主要試劑：10×多聚賴氨酸、100×青鏈霉素混合液、1×磷酸鹽緩沖液(PBS)、鼠抗GAPDH購自北京索萊寶公司；DMEM/F-12培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%含EDTA胰蛋白酶購自美國Gibco公司；SS購自美國Sigma公司，LiCl購自上海阿拉丁公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京全式金公司，Mem-PERTMPlus Membrane Protein Extraction Kit膜蛋白提取試劑盒、PageRulerTMPrestained Protein Ladder，10 to 180 kDa購自美國Thermo Fisher公司；Trizol 、SYBR Green PCR試劑盒購自美國Invitrogen公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天公司；兔抗GABRA2(GABAARsα2)抗體購自美國Abcam公司，兔抗Gephyrin抗體購自上海酶聯(lián)公司，鼠抗Gephyrin phospho-S270購自德國SYSY公司，山羊抗兔或者山羊抗鼠熒光二抗購自美國CST公司。主要儀器：NanoDrop One 超微量核酸蛋白測定儀、細胞恒溫培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher公司，StepOne Plus qPCR反應(yīng)儀購自美國ABI公司，電泳槽購自美國BIO-RAD，紅外掃描儀購自美國Odyssey公司。

1.3實驗方法

1.3.1SGNs原代培養(yǎng)與藥物處理 各組SD大鼠用75%酒精消毒頭頸部皮膚，斷頭后對半剪開并剔除腦組織，放4 ℃PBS備用。在解剖顯微鏡下，用顯微鑷將耳蝸完整取出，進一步去除基底膜和螺旋韌帶，剩下富含SGNs的蝸軸；將蝸軸在顯微鏡下撕碎之后，放進0.25%含EDTA的胰酶中消化，之后終止消化、離心，倒掉上清液，加入含胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基進行重懸，將細胞種植到用多聚賴氨酸預(yù)包被的培養(yǎng)皿上，放進細胞恒溫培養(yǎng)箱。細胞培養(yǎng)48 h后，SS組、LiCl組和SS+LiCl組分別用5 mM SS、1 mM LiCl、5 mM SS聯(lián)合1 mM LiCl處理 1 h，對照組不予處理。

1.3.2實時熒光定量PCR(RT-qPCR) 檢測各組GABAARsα2亞基、橋尾蛋白基因表達的改變。用Trizol提取各組細胞總RNA之后，測定所提取的總RNA濃度和純度，按照全式金逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟，將樣本的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；采用SYBR Green熒光染料法對目的基因和內(nèi)參基因進行擴增，引物序列由上海生工公司進行合成(表1)，用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達量。

表1 相關(guān)基因的引物序列

1.3.3免疫印跡試驗(Western blot，WB) 檢測各組GABAARsα2膜蛋白和總蛋白表達的改變、橋尾蛋白及其S270位點磷酸化的改變。用膜蛋白提取試劑盒提取膜蛋白，用RIPA裂解液提取總蛋白，之后BCA試劑盒測定蛋白濃度，100 ℃金屬浴熱變性6 min；用10%SDS-PAGE凝膠電泳，每孔加入55 μg樣品，根據(jù)蛋白Marker指示位置及目的蛋白分子量切膠，之后轉(zhuǎn)膜、封閉，按照目的蛋白的抗體說明書比例稀釋一抗，4 ℃孵育條帶過夜；第二天用TBST洗膜3遍，每遍8 min，按照1∶15 000比例稀釋熒光二抗，在室溫孵育1.5 h，之后用TBST洗膜3遍，每遍8 min；最后用Odyssey紅外掃描儀掃描條帶，用Image-J軟件計算條帶密度值。橋尾蛋白S270磷酸化以橋尾蛋白總量標(biāo)化，其余條帶以GAPDH作為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1各處理組GABAARsα2亞基、gephyrin基因表達變化 RT-qPCR結(jié)果顯示，SS組、LiCl組、SS+LiCl處理組，GABAARsα2亞基基因表達較對照組無明顯變化(F=1.764，P>0.05)，各處理組gephyrin基因表達與對照組比較均無明顯差異(F=0.802，P>0.05)(表2)。

2.2各組Western blot檢測結(jié)果 SS組細胞膜表面GABAARsα2亞基較對照組表達顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.003<0.01)，總蛋白較對照組表達無明顯變化(P=0.68>0.05)(圖1，表3)，與RT-qPCR結(jié)果一致，提示SS作用下GABAARs發(fā)生內(nèi)化。SS組gephyrin總蛋白比對照組稍上升，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.183>0.05)，gephyrin S270位點磷酸化較對照組顯著增強(圖2，表3)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000 135<0.001)，提示SS作用下，GABAARs內(nèi)化的同時，gephyrin S270位點磷酸化增強。

SS+LiCl組gephyrin S270位點磷酸化較SS組減弱(P=0.036<0.05)，較對照組顯著增強(P=0.003<0.01)(圖2，表3)，提示SS部分經(jīng)由GSK3β增強gephyrin S270磷酸化修飾。同時，SGNs膜表面GABAARs α2亞基較SS組上調(diào)(P=0.027<0.05)，較對照組表達稍下調(diào)(圖1，表3)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.176>0.05)，提示LiCl逆轉(zhuǎn)SS對GABAARsα2亞基的內(nèi)化作用。

LiCl組GABAARs α2亞基膜蛋白、總蛋白、gephyrin、gephyrin S270磷酸化與對照組比較均無明顯變化(圖1、2，表3)。

圖1 各組GABAARsα2亞基膜蛋白、總蛋白的表達

圖2 各組橋尾蛋白S270磷酸化、橋尾蛋白總蛋白的表達

表2 各組GABAAR α2亞基、橋尾蛋白 mRNA相對表達量

表3 各組GABAAR α2亞基膜蛋白、總蛋白及橋尾蛋白 S270磷酸化、總蛋白相對表達量

3 討論

前期研究發(fā)現(xiàn)SGNs中GABAARs 的α2亞基在α亞單位族中表達量最高[8]，提示新生大鼠GABAARs中α2亞基為主要成分之一。此外，研究證實含α2亞基的GABAARs與GABA遞質(zhì)親和力高[9]，提示α2亞基在GABAARs抑制性效能中有重要作用，其功能可能在SGNs興奮毒性中發(fā)揮重要作用。因而，本研究通過觀察α2亞基的改變了解GABAARs的變化。

胞膜表面GABAARs數(shù)量影響突觸的抑制效能，特別是內(nèi)化增強，可導(dǎo)致膜上受體數(shù)量減少，抑制性傳遞減弱，如：蝸背側(cè)核、下丘、聽皮層等突觸前GABA分泌減少或伴隨突觸后甘氨酸受體、GABAARs減少參與耳鳴[10]，在SS誘導(dǎo)的耳鳴模型中，聽皮層中椎體神經(jīng)元突觸后微小抑制電流減弱(miniature inhibitory postsynaptic currents，mIPSCs)[11]，SGNs也被證實是SS首要作用靶點[12]。前期研究也發(fā)現(xiàn)SS可逆地抑制SGNs GABAARs電流[13]，本研究中，在 SS處理后1 h，SGNsGABAARα2亞基的mRNA和總蛋白無明顯改變，但是膜蛋白降低，證實了SS作用下，SGNs 中GABAARs發(fā)生了內(nèi)化。

GABAARs內(nèi)化之前，需要先從突觸的位置側(cè)向擴散到突觸外，其中涉及突觸GABAARs與橋尾蛋白結(jié)合的減弱[14]。橋尾蛋白與GABAARsα2亞基胞內(nèi)段的336～347氨基酸序列直接結(jié)合[15]。在海馬神經(jīng)元中過表達顯性抑制橋尾蛋白，觀察到突觸GABAARs數(shù)量減少[16]，除了數(shù)量上影響GABAARs在膜上的錨定，橋尾蛋白C結(jié)構(gòu)域翻譯后修飾亦能影響GABA能效能[17]，其中S270位點的磷酸化對橋尾蛋白聚集GABAARs具有較強和多方面的影響，該位點分別受GSK3β和周期蛋白依賴性激酶5(cyclin-dependent kinase 5，CDK5)的調(diào)控，Tyagarajan等[2]發(fā)現(xiàn)，GSK3β磷酸化Ser270與GABAARs簇密度降低有關(guān)。Kuhse等研究顯示CDK5依賴collybistin蛋白磷酸化Ser270[18]，抑制CDK5與GABAARsγ2簇密度的降低相關(guān)[19]；發(fā)生在同一個位點的磷酸化卻發(fā)揮不同效應(yīng)，提示該位點磷酸化具有重要功能，兩種激酶協(xié)調(diào)該位點的功能保持穩(wěn)定或者尚存其他未知影響因素。

橋尾蛋白是否在SS作用下對SGNs 中GABAARs內(nèi)化過程起作用尚未知。本研究結(jié)果顯示SS作用下SGNs中橋尾蛋白的蛋白表達較對照組稍上調(diào)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能是細胞的代償作用，外界環(huán)境作用下，蛋白的翻譯后修飾相比蛋白合成對蛋白功能的影響更加迅速靈敏，同時觀察到SS作用下橋尾蛋白S270磷酸化較對照組顯著增強，提示S270磷酸化增強可能參與GABAARs內(nèi)化。研究發(fā)現(xiàn)GSK3β磷酸化修飾橋尾蛋白S270位點[2～4]，GSK3β與神經(jīng)元的興奮毒性有關(guān)，抑制GSK3β可以保護神經(jīng)元[20]，提示GSK3β可能參與了SS作用下橋尾蛋白S270磷酸化。本研究通過GSK3β抑制劑LiCl處理SGNs，之后聯(lián)合SS處理，觀察到聯(lián)合處理組S270位點磷酸化減弱，并且GABAARs內(nèi)化得到減弱，證實了橋尾蛋白S270磷酸化依賴于GSK3β。LiCl組S270磷酸化與對照組無明顯變化，可能與S270位點同時接受CDK5磷酸化有關(guān)[18]，但從LiCl聯(lián)合SS作用之后S270磷酸化減弱以及受體內(nèi)化改善的角度考慮SS主要通過GSK3β途徑；下一步研究需要進一步明確GSK3β的具體作用。本研究結(jié)果提示S270磷酸化增強影響了GABAARs在膜上的動態(tài)平衡，但是S270磷酸化增強到什么程度才會使GABAARs內(nèi)化還需要進一步量化。

綜上所述，本研究證實SS誘導(dǎo)SGNs GABAARs內(nèi)化，GSK3β依賴的橋尾蛋白S270磷酸化增強參與該內(nèi)化過程，抑制橋尾蛋白S270磷酸化可以改善GABAARs內(nèi)化，靶向橋尾蛋白磷酸化可以為耳鳴的防治提供新的方向。