李金紅 李子杰 王帥 秦嶺

右美托咪定(dexmedetomidine,DEX)是一種α2受體激動(dòng)劑，與常用的γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)受體介導(dǎo)的麻醉劑機(jī)制不同。DEX的優(yōu)點(diǎn)是具有鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛作用的同時(shí)，不會(huì)引起呼吸抑制。DEX誘導(dǎo)鎮(zhèn)靜的另一個(gè)重要特性是患者易于喚醒[1]；正因?yàn)檫@一特性使DEX能夠成為廣泛應(yīng)用于清醒的開顱手術(shù)等許多種治療或診斷過程中重要的鎮(zhèn)靜劑[2]。然而DEX誘導(dǎo)的鎮(zhèn)靜作用對(duì)腦神經(jīng)電活動(dòng)影響尚不完全清楚。腦電圖(EEG)是檢查大腦電活動(dòng)的客觀指標(biāo)，應(yīng)用EEG檢測由周期性聲音刺激引起的伽馬段(30～80 Hz)腦電振蕩被稱為聽性穩(wěn)態(tài)反應(yīng)(ASSR)，它是評(píng)估中樞神經(jīng)系統(tǒng)的感覺和認(rèn)知功能的一種有效方法[3]。特別是40 Hz click-train誘發(fā)的伽馬頻段頻率范圍內(nèi)的ASSR已廣泛用于精神疾病的臨床檢查[4,5]和動(dòng)物的神經(jīng)藥理實(shí)驗(yàn)[6,7]。ASSR也常被應(yīng)用于監(jiān)測臨床麻醉過程中患者的覺醒程度[8]，然而，DEX對(duì)ASSR的影響仍然未知。本研究利用在體電生理記錄方法，比較小鼠接受DEX腹腔注射前后大腦聽皮層ASSR的變化，探討大腦感覺中樞神經(jīng)電活動(dòng)與DEX誘導(dǎo)的鎮(zhèn)靜作用的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)選用8只6～8周齡C57BL/6小鼠(北京維通利華)。所有動(dòng)物均在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)條件下繁殖飼養(yǎng)，動(dòng)物可自由進(jìn)食飲水。所有實(shí)驗(yàn)方案按中國醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)的要求執(zhí)行(IACUC倫理審查號(hào)：CMU2019126)。所有手術(shù)均在全身麻醉狀態(tài)下進(jìn)行。

1.2材料和儀器 1.27 mm 2*6雙排直針排母(深圳市鷹嘴豆科技有限公司)；M1.0*L2.0螺絲釘(62513，深圳瑞沃德有限公司)；銀絲電極(A-M Systems)；生理鹽水(吉林省都邦藥業(yè)股份有限公司)；右美托咪定(江蘇恒瑞股份有限公司)；2%異氟烷(深圳瑞沃德有限公司)；4%水合氯醛(上海精析化工科技有限公司)；硫酸阿托品溶液(天津金耀藥業(yè)有限公司)；抗生素(源葉生物)；牙科水泥(日進(jìn)齒科材料有限公司)；小鼠腦立體定位儀(DW2000)；高速顱骨鉆(78001，深圳瑞沃德有限公司)；多通道前置放大器(PBXPreamplifer)；揚(yáng)聲器(K701,AKG,奧地利)；D/A轉(zhuǎn)換器(PCI-6052E，美國 National Instruments 公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1電極植入 應(yīng)用2%異氟烷對(duì)小鼠進(jìn)行吸入麻醉，腹腔注射硫酸阿托品(0.1 mg/kg)抑制呼吸道腺體分泌。手術(shù)過程中時(shí)刻監(jiān)測小鼠體溫，應(yīng)用溫控電熱毯使其維持在37 ℃左右。將小鼠固定在小鼠腦立體定位儀上，剪開皮膚，暴露顱骨前囟，根據(jù)Paxions &Watson腦圖譜定位聽皮層位置(AP:2.5～3.5 mm,ML:+3.5～4.0 mm,DV:-2～2.5 mm)，用骨鉆在該位點(diǎn)鉆孔，置入導(dǎo)管，用牙科水泥固定好導(dǎo)管后，再將銀絲電極由導(dǎo)管植入到聽皮層，同時(shí)在小腦處鉆一個(gè)1 mm小孔擰入螺絲釘，將銀絲電極緊密纏繞在螺絲釘上作為接地點(diǎn)，用牙科水泥對(duì)銀絲電極進(jìn)行固定。術(shù)后腹腔注射抗生素(頭孢呋辛，30 mg/kg,連續(xù)注射3天)防止感染，待小鼠恢復(fù)1周后再進(jìn)行電生理記錄。

1.3.2電生理記錄和聲音刺激 小鼠恢復(fù)1周后，放入隔聲屏蔽室內(nèi)的記錄箱(20 cm×20 cm×30 cm)中，將記錄線與小鼠頭部電極相連，每次15分鐘，連續(xù)4天使小鼠適應(yīng)記錄環(huán)境，第5天開始記錄。在自由清醒的條件下記錄小鼠正常局部場電位(local field potential, LFP)8～10分鐘后，腹腔注射DEX(80 μg/ kg，溶于0.9%NaCl溶液)；注射30 min后，再次重復(fù)記錄小鼠LFP。應(yīng)用click-train聲刺激評(píng)估ASSR，單個(gè)click是持續(xù)時(shí)間為0.2 ms的矩形脈沖, click-train持續(xù)500 ms，頻率為40 Hz。聲刺激通過置于實(shí)驗(yàn)箱頂部的揚(yáng)聲器播放，強(qiáng)度調(diào)整為70 dB SPL；每個(gè)記錄單元中，以2～5 s的隨機(jī)間隔重復(fù)120 次。將微電極輸出與前置放大器相連,由數(shù)字信號(hào)處理器接受前置放大器的輸出后，通過帶通濾波器提取0～300 Hz局部場電位(LFP)信號(hào)導(dǎo)入到MATLAB進(jìn)行分析。

1.3.3電生理數(shù)據(jù)分析 使用基于短時(shí)傅里葉變換算法對(duì)click-train誘發(fā)的LFP進(jìn)行時(shí)頻分析，通過eeglab工具箱(https://sccn.ucsd.edu/eeglab/index.php)提供的多維窗方法計(jì)算得到平均能量(MTP)和鎖相因子(PLF)。MTP是一次記錄中120次聲音刺激誘發(fā)的LFP在時(shí)域中能量的平均值，以聲音刺激后與聲音刺激前的比值表示(刺激后/刺激前)。PLF描述多次聲音刺激中LFP在時(shí)間和頻率上的相位一致性，將時(shí)頻分析中每一個(gè)時(shí)間窗的結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行平均，得到結(jié)果值位于0～1之間，0代表沒有同步性，1代表完全同步。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS(18.0，2010。Chicago：SPSS，Inc。)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)顯著性確定為P<0.05，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤[9，10]。

2 結(jié)果

植入電極手術(shù)成功并符合電生理記錄要求的C57BL/6小鼠共8只，共獲得16次有效的神經(jīng)電生理記錄數(shù)據(jù)用于處理分析；其中2.1、2.2、2.3是同一只實(shí)驗(yàn)鼠的代表性結(jié)果，2.4中是8只實(shí)驗(yàn)鼠的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。

2.1DEX對(duì)40 Hz click-train誘導(dǎo)的聽皮層LFP的影響 自由清醒狀態(tài)下，記錄AC的LFP，在刺激開始時(shí)表現(xiàn)出較大的波動(dòng)，隨后在整個(gè)刺激期間出現(xiàn)清晰的振蕩(ASSR，圖1a)，而在腹腔注射DEX后，再次記錄聽皮層(AC)的LFP，發(fā)現(xiàn)LFP在click-trains刺激開始時(shí)僅顯示出較弱的波動(dòng)，并且同步性較差(圖1b)。圖1a和1b表示在DEX注射前后從AC記錄的平均LFP的示例。為了研究聲音刺激所誘發(fā)的腦電，使用35～45 Hz帶通濾波器來分析LFP(圖1c和1d)，可見在腹腔注射DEX后，40 Hz ASSR比DEX注射前更弱。

圖1 DEX注射前后AC區(qū)記錄的40 Hz click-train誘發(fā)LFP的平均值 給藥前后AC區(qū)ASSR的代表性LFP波形圖。a和b為未進(jìn)行濾波的LFP; c和d為進(jìn)行35～45 Hz的濾波后顯示出40 Hz的LFP。頂部的垂直線代表click-train刺激

2.2DEX對(duì)多次重復(fù)記錄的LFP一致性的影響 為了表明腹腔注射DEX前后聲音刺激誘發(fā)的腦電反應(yīng)一致性的影響，本研究分別將注射前后的120次LFP記錄結(jié)果疊加繪制在同一圖中(圖2)。注射DEX前的LFP比注射后的LFP排列更為整齊，顯示出較強(qiáng)的一致性。

圖2 DEX注射前后LFP的一致性 給藥前后AC區(qū)ASSR的代表性120次LFP記錄的疊加結(jié)果圖。a. DEX注射前誘發(fā)的120次LFP記錄的疊加結(jié)果,其中白色正弦曲線為120次LFP記錄結(jié)果的平均值; b. DEX注射后誘發(fā)的LFP

2.3DEX對(duì)ASSR的定量指標(biāo)的影響 用MTP和PLF對(duì)DEX注射前后40 Hz click-train誘導(dǎo)的LFP進(jìn)行定量評(píng)測(圖3)。圖3a顯示了圖1a中所列舉的LFP的 MTP分析結(jié)果，可見其在40 Hz處呈現(xiàn)清晰的紅色條帶，說明40 Hz click-train在聽皮層誘發(fā)出較強(qiáng)的ASSR反應(yīng);而其能量在DEX注射后明顯降低(圖3b),PLF的結(jié)果也顯示出類似的趨勢(圖3c和d)。為了在DEX前后的結(jié)果之間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較，計(jì)算了所有測試動(dòng)物的平均MTP和PLF。

圖3 DEX注射前后ASSR的定量分析 給藥前后AC區(qū)代表性MTP和PLF; a. 注射DEX前的MTP; b. DEX注射后的MTP; c. DEX注射前的PLF; d. DEX注射后的PLF

2.4DEX對(duì)ASSR統(tǒng)計(jì)結(jié)果的影響 在刺激時(shí)間窗口0～0.55 s以及35～45 Hz頻率范圍內(nèi)對(duì)頻譜時(shí)間函數(shù)中的值取平均值,圖4顯示了在8只實(shí)驗(yàn)鼠中記錄的MTP和PLF的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤。與DEX注射前相比，DEX注射后的MTP和PLF均顯著降低(配對(duì)t檢驗(yàn)Lt7=2.858，P<0.05；t7=2.507，P<0.05)。

圖4 DEX注射前后ASSR的統(tǒng)計(jì)分析 a. DEX注射前后MTP的變化; b. DEX注射前后PLF的變化 (n=8,配對(duì)t檢驗(yàn),*表示P<0.05)

3 討論

ASSR是一種大腦神經(jīng)元對(duì)周期性聲音刺激產(chǎn)生的同步電反應(yīng)信號(hào)，這種誘發(fā)性腦電振蕩信號(hào)與刺激信號(hào)的時(shí)間相位始終保持一致。臨床常用的 MEG/EEG 方法都可以記錄可靠的ASSR信號(hào)。

ASSR的起源尚無統(tǒng)一結(jié)論，大部分研究認(rèn)為經(jīng)皮腦電圖記錄的ASSR產(chǎn)生于大腦皮層，主要是初級(jí)和次級(jí)聽覺皮層神經(jīng)元，除此之外腦干和前腦等結(jié)構(gòu)也對(duì)ASSR的產(chǎn)生有輔助作用[11]。為了測量更高精度的ASSR信號(hào),有研究采用了LFP記錄方法，通過植入于實(shí)驗(yàn)小鼠腦內(nèi)AC區(qū)記錄LFP可以直接反映出大腦皮層神經(jīng)元的電活動(dòng)狀態(tài)，減少了肌肉收縮、動(dòng)脈搏動(dòng)等信號(hào)的干擾[12]。此前已有動(dòng)物和人的研究，比較了10、20、40、80 Hz等不同頻率聲音刺激所誘發(fā)的ASSR,結(jié)果證實(shí)40 Hz聲音刺激誘導(dǎo)的ASSR反應(yīng)最強(qiáng)[13,14]，故本研究采用40 Hz 聲音刺激。調(diào)幅聲音(amplitude modulated, AM)和脈沖聲音序列(click-train)是誘發(fā)ASSR的兩種常用刺激類型;AM音是通過使用正弦波在時(shí)域?qū)β曇粽穹M(jìn)行調(diào)制，從而使聲音的振幅隨時(shí)間的變化而出現(xiàn)連續(xù)有節(jié)律的變化。Click-train刺激由時(shí)間短而頻率廣的脈沖音(click)組成,因此在頻域上，AM音只有一個(gè)峰值而click-train音具有多個(gè)峰值。聽皮層由不同的亞區(qū)構(gòu)成，各亞區(qū)對(duì)聲音刺激頻率的反應(yīng)敏感性不同,而AM音刺激的頻率范圍窄，只有較小的AC區(qū)域產(chǎn)生腦電反應(yīng)；click作為廣譜頻率刺激會(huì)誘發(fā)較大范圍的AC區(qū)產(chǎn)生腦電反應(yīng)，使記錄到的ASSR反應(yīng)強(qiáng)度更強(qiáng)[12];所以本研究采用click-train刺激。

既往研究表明，ASSR是監(jiān)測麻醉過程中覺醒狀態(tài)的良好生物指標(biāo)[15]。本研究結(jié)果進(jìn)一步證明DEX等鎮(zhèn)靜劑也可以對(duì)ASSR產(chǎn)生抑制性作用。DEX是一種廣泛使用的鎮(zhèn)靜劑，作用于α2受體，通過抑制藍(lán)斑(LC)中去甲腎上腺素的釋放，可以發(fā)揮鎮(zhèn)靜效果[16]。先前對(duì)自發(fā)性腦電圖的研究發(fā)現(xiàn)，DEX引起的鎮(zhèn)靜作用可以誘發(fā)紡錘波振蕩(12～15 Hz)的出現(xiàn)[1]，類似于非快速眼動(dòng)(NREM)睡眠2期中常見的腦電波形[17]。紡錘波被認(rèn)為起源于丘腦中的GABA能網(wǎng)狀核[18]，DEX誘導(dǎo)紡錘波的產(chǎn)生可能因?yàn)镈EX改變了LC到丘腦的投射。與紡錘波不同，伽馬振蕩與大腦皮層的高級(jí)認(rèn)知活動(dòng)有關(guān)，例如：感覺門控、注意力、知覺和運(yùn)動(dòng)控制等[19]。研究發(fā)現(xiàn)，DEX可以持續(xù)降低鎮(zhèn)靜和麻醉恢復(fù)期的自發(fā)腦電伽馬振蕩[1]。本研究結(jié)果進(jìn)一步表明感覺刺激所誘發(fā)的伽馬振蕩也被DEX降低。與以前的研究相比，本研究有以下幾個(gè)優(yōu)勢：①使用40 Hz click-train作為聽覺刺激，誘發(fā)了AC中ASSR的可靠響應(yīng)，ASSR具有更高的信噪比、相位一致性和可重復(fù)性；②整個(gè)記錄過程包含100多次測試，歷時(shí)僅8至10分鐘，這更便于臨床應(yīng)用，特別適用于兒童和依從性較差的患者。

本研究通過對(duì)ASSR的定量分析，結(jié)果顯示MTP和PLF在注射DEX后顯著降低，提示ASSR可作為一種客觀可靠的腦電生理指標(biāo)來監(jiān)測DEX的作用效果；但尚不清楚不同劑量下的DEX對(duì)ASSR的MTP和PLF的影響程度是否存在差異，有待后續(xù)研究。此外，ASSR的MTP和PLF降低，提示皮層神經(jīng)元電活動(dòng)的同步性被DEX干擾；先前的研究表明，皮層中有兩種重要的神經(jīng)元類型，即興奮性神經(jīng)元和快速放電的小清蛋白(PV)抑制性中間神經(jīng)元，以及兩種特定的受體類型，即γ-氨基丁酸受體(GABAA)的A亞型和谷氨酸能受體的NMDAR亞型，它們對(duì)于神經(jīng)元電活動(dòng)的同步性至關(guān)重要，并參與40 Hz ASSR的產(chǎn)生[15]。然而，仍然不清楚哪種類型的細(xì)胞和受體是DEX的主要靶標(biāo)，需要在將來進(jìn)一步研究和探討。