高玲麗 潘春晨 鮑堅強 孫敬武

耳聾是一種極其復雜的高度遺傳異質(zhì)性疾病，病因主要包括遺傳與環(huán)境因素，但是以遺傳因素為主(60%)；根據(jù)病變累及范圍分為綜合征型聾和非綜合征型聾。同樣的耳聾表型可以由不同基因變異導致，或者同一基因可以導致不同的耳聾相關(guān)臨床特征[1]，同一個基因突變既能引起綜合征型聾，也能引起非綜合征型聾。迄今為止，已經(jīng)鑒定出121個非綜合征型聾基因，其中有49個與常染色體顯性遺傳非綜合征型聾(ADNSHL)相關(guān)[2]。在我國耳聾人群中，最常見的致病基因是GJB2、SLC26A4、mtDNA12SrRNA和GJB3，約占30%～50%[2]。既往報道MITF基因突變會引起Waardenburg綜合征和Tietz綜合征[3]，兩種疾病均為常染色體顯性遺傳性綜合征型聾。隨著新一代測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的耳聾基因被發(fā)現(xiàn)，近年來研究發(fā)現(xiàn)MITF基因突變除了導致綜合征型聾，也會引起非綜合征型聾[4,5]。本研究發(fā)現(xiàn)了一個涉及3代的非綜合征型聾家系，通過遺傳性耳聾基因芯片、耳聾基因靶向測序以及Sanger測序技術(shù)，證實該家系患者中存在MITF基因c.730G>A(p.Gly244Arg,NM_000248)突變，這是中國人群中首次檢測出MITF基因該位點突變引起非綜合征型聾，報道如下。

1 資料與方法

1.1家系資料搜集 家系調(diào)查由中國科學技術(shù)大學附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科于2019年9月5日搜集完成;家系成員居住地為安徽省，漢族。對家庭成員進行了詳細的病史采集和全身體格檢查，包括對先證者及家系成員進行完整病史(出生史、耳聾病史、家族史、外傷史、噪聲暴露史、耳毒性藥物應用史等)采集和系統(tǒng)的全身體格檢查。本調(diào)查研究獲本院倫理委員會認可，所有參與的研究對象均簽署了知情同意書，未成年人由監(jiān)護人簽署知情同意書。

1.2聽力檢測及家系圖繪制 對先證者及其家庭成員進行了純音聽閾及聽性腦干反應檢測。觀察先證者及家系患病成員行走姿態(tài)，初步排除了共濟失調(diào)或步態(tài)不穩(wěn)等前庭功能異常的癥狀；根據(jù)病史排除了外傷、藥物、噪聲暴露等聽力損失風險因素，根據(jù)家系調(diào)查和聽力結(jié)果繪制系譜圖(圖1)。

圖1 非綜合征型聾患者的家系圖譜

1.3DNA提取 采集家系中Ⅰ-4、Ⅱ-3、Ⅱ-4、Ⅱ-5、Ⅲ-3、Ⅲ-4成員的外周血各3 ml，EDTA抗凝，用血液基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技北京有限公司)提取樣本DNA，用Nanodrop2000超微量分光光度計檢測DNA的純度和濃度，取適量樣本稀釋至濃度100～200 ng/μl，其余-20 ℃保存。

1.4遺傳性聾基因檢測 應用9項遺傳性耳聾基因芯片對該家系中的Ⅰ-4、Ⅱ-3、Ⅱ-4、Ⅱ-5、Ⅲ-3、Ⅲ-4成員進行中國人群中常見的4個耳聾基因9個突變位點GJB2(35delG、176_191del16、235delC、299_300delAT)，GJB3(538C>T)，線粒體DNA 12SrRNA(1494C>T、1555A>G)，SLC26A4(2168A>G、IVS7-2A>G)的檢測。

1.5耳聾基因靶向測序 應用已知遺傳性聾基因捕獲試劑盒，對遺傳性聾相關(guān)基因編碼區(qū)及附近剪切區(qū)的DNA進行靶向測序，包括非綜合征型聾相關(guān)基因、綜合征型聾相關(guān)基因、聽神經(jīng)病相關(guān)基因及一些與耳聾相關(guān)需鑒別診斷的基因，共415個基因。方法：取3 μg基因組DNA，用1×low TE Buffer稀釋到30 ng/μl，用Covaris-S220超聲波打斷儀將基因組DNA隨機打斷成約150 bp左右的片段準備構(gòu)建文庫。對這些DNA片段按照Illumina的規(guī)定進行末端修復及添加Illumina適配元件。經(jīng)過PCR擴增，生物素標記的單鏈DNA捕獲探針與文庫DNA雜交，磁珠吸附抓取目標基因，洗脫純化富集。獲取的基因片段文庫加載到測序芯片F(xiàn)lowcell上，在Illumina NextSeq 500測序儀上對415個耳聾相關(guān)基因外顯子進行高通量測序，此項工作由北京邁基諾醫(yī)學檢驗所完成。

將原始測序數(shù)據(jù)去除污染和接頭序列，然后利用BWA軟件將過濾后的序列比對到NCBI數(shù)據(jù)庫人類基因組參考序列(hg19)上，利用GATK軟件分析得出單核苷酸變異(single nucleotide variation，SNV)和插入缺失突變(inserts and deletions，INDEL)的相關(guān)信息。然后通過ANNOVAR軟件對所有的SNP和INDEL進行注釋。篩選正常人數(shù)據(jù)庫中頻率小于0.05的突變位點，正常人數(shù)據(jù)庫包括千人基因組計劃(http://www.1000genomes.or/)、Exome Variant Server(http://evs.gs.washington.edu/EVS/)和EXAC(http://exac.broadinstitute.org/)。錯義突變使用SIFT，PolyPhen-2，MutationTaster和GERP++等軟件進行致病性預測和保守性預測，剪切位點的改變用SPIDEX軟件分析其致病性。

1.6突變驗證 利用Sanger測序驗證經(jīng)耳聾基因靶向測序得到的候選基因，進行家系共分離驗證，排除其他候選基因，最終鎖定致病基因MITF基因。針對檢出的致病基因MITF突變位點設計驗證引物。MITF擴增的引物如下：正向：5′TGTAACCAAGCACCACCTGT3′；MITF反向：5′CCACTCTGCACATGTCCAAG3′。使用貝克曼自動化工作站預設程序配置PCR擴增反應體系，并按如下步驟運行程序：96 ℃ 1 min 30 s； 96 ℃ 15 s， 50 ℃ 6 s， 60 ℃3 min 30 s，28個循環(huán)；4℃ Holds。PCR產(chǎn)物使用3130XL測序儀進行毛細管電泳測序并在ABI 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)上進行分析，再在家系成員中進行共分離驗證。并選取家系外10例聽力正常人，對患者所發(fā)現(xiàn)的可疑致病變異位點中進行人群攜帶率驗證。

1.7保守性及蛋白三維結(jié)構(gòu)分析 使用Clustal Omega軟件(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo)對多個脊椎動物蛋白序列(雞、小鼠、大鼠、人、狗和牛)進行比對。利用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org)工具進行同源建模模擬MITF蛋白的三維結(jié)構(gòu)，分析該位點突變前后對該蛋白質(zhì)功能的影響。

2 結(jié)果

2.1家系表型及聽力檢查結(jié)果 該家系共3代15人，4人患病，均診斷為先天性雙側(cè)感音神經(jīng)性聾，表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳，家系圖見圖1。先證者(Ⅲ-4),男，2歲4個月，先天性聾；姐姐(Ⅲ-3)、母親(Ⅱ-4)、外婆(Ⅰ-4)均為先天性聾；父親(Ⅱ-3)及其他家屬(Ⅰ-1、Ⅰ-2、Ⅱ-2、Ⅱ-5)聽力正常。先證者(Ⅲ-4)及姐姐(Ⅲ-3)在90 dB nHL刺激強度下雙側(cè)聽性腦干反應未引出。先證者母親(Ⅱ-4)0.25～8 kHz純音氣導平均聽閾右耳93、左耳82 dB HL；先證者外婆(Ⅰ-4)右耳68、左耳63 dB HL，均診斷為雙耳重度感音神經(jīng)性聾(表1)。

表1 家系中Ⅰ-4和Ⅱ-4成員各頻率純音聽閾(dB HL)

2.2遺傳性聾基因芯片檢測結(jié)果 家系中Ⅰ-4、Ⅱ-3、Ⅱ-4、Ⅱ-5、Ⅲ-3、Ⅲ-4成員的9項遺傳性聾基因芯片檢測結(jié)果均為野生型，未發(fā)現(xiàn)中國人群中最常見的耳聾基因位點突變。

2.3耳聾基因靶向測序結(jié)果 對先證者Ⅲ-4進行了耳聾基因Panel靶向測序，數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示其攜帶4個基因的一個單雜合變異，包括：ILDR1: c.772C>T(p.Gln258stop)、CLDN14：c.2T>C(p.Met1Thr)、MITF: c.730G>A(p.Gly244Arg)、TNC: c.473G>A(p.Arg158Lys)。

2.4變異確認及家系共分離驗證結(jié)果 Sanger測序結(jié)果證實了上述變異真實存在，對先證者全家四人檢測這四個位點的攜帶情況，發(fā)現(xiàn)先證者的3個變異，包括：ILDR1: c.772C>T(p.Gln258stop)、CLDN14: c.2T>C(p.Met1Thr)、TNC: c.473G>A(p.Arg158Lys)來源于其父親(圖2)，表明靶向測序所發(fā)現(xiàn)的這3個變異均與臨床表型不符合共分離現(xiàn)象。變異MITF: c.730G>A(p.Gly244Arg)來源于其母親，父親(Ⅱ-3)未發(fā)現(xiàn)該位點的變異，為野生型；隨后進一步驗證Ⅰ-4和Ⅱ-5，Ⅰ-4為突變型，Ⅱ-5為野生型，臨床表型符合家系共分離現(xiàn)象(圖3)；最終鎖定MITF為候選致病基因。利用蛋白功能預測軟件REVEL進行MITF基因變異致病性的分析，結(jié)果顯示為D(預測為有害)(表2)，提示其可能為一個潛在的致病位點。

圖2 家系成員的CLDN14、TNC、ILDR1基因的Sanger測序圖

圖3 家系成員MITF基因的Sanger測序圖

表2 MITF基因高通量測序結(jié)果分析

2.5家系外對照者變異驗證結(jié)果 選取的家系外10例聽力正常人作為對照，用Sanger測序法對先證者所發(fā)現(xiàn)的MITF基因變異(c.730G>A)進行篩查，結(jié)果均未攜帶上述變異。

2.6MITF物種保守性分析 使用Clustal Omega軟件(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo)對多個脊椎動物蛋白序列(雞、小鼠、大鼠、人、狗和牛)進行比對，結(jié)果顯示244Gly在各物種中高度保守，該突變體位于MITF的堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)區(qū)域(MITF-M亞型)中。

2.7MITF蛋白三維結(jié)構(gòu)預測 預測的MITF蛋白三維結(jié)構(gòu)(圖4，箭頭標注示突變位點)來源于MITF殘基226～257，MITF基因是一個編碼含bHLH-LZ(basic helix-loop-helix zipper)結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，與DNA結(jié)合以二聚體的形式存在，可以看出Gly244位于第二個螺旋的開頭，靠近蛋白質(zhì)-DNA界面，所以該位置的突變很可能增強MITF與非特異性DNA的結(jié)合。

圖4 MITF蛋白三維結(jié)構(gòu)模型

3 討論

MITF基因(melanocyte inducing transcription factor)在各種細胞類型的建立中起關(guān)鍵作用，主要對黑色素細胞的增殖、遷移、存活和分化至關(guān)重要，通常又被稱為該譜系的主要調(diào)控因子[7]；它是色素細胞發(fā)育的關(guān)鍵基因，通過Myc超基因家族的基本螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈(basic helix-loop-helix leucine zipper; bHLH-Zip)功能結(jié)構(gòu)域發(fā)揮作用[8]。在內(nèi)耳中，MITF基因的功能是通過酪氨酸酶調(diào)節(jié)黑色素的產(chǎn)生，并直接參與聽覺的分子過程，黑色素細胞存在于血管紋層的中間層。這些黑色素細胞(所謂的中間細胞)具有功能性Na+-K+-ATPase，該酶控制維持內(nèi)淋巴正常體積和離子濃度(循環(huán))所需的離子和物質(zhì)運輸，因此，對于調(diào)節(jié)血管紋層的完整性和維持正常的聽力至關(guān)重要。僅內(nèi)耳的黑素細胞具有此功能，而其他色素組織中的黑色素細胞則不具有這種功能[5]。在小鼠中，中間細胞的耗竭會導致耳蝸內(nèi)電位大幅降低、內(nèi)淋巴間隙嚴重變性、感覺毛細胞崩潰和損失，并伴有明顯的聽力損失[9]。

MITF/Mitf功能與人類和小鼠的許多遺傳性疾病有關(guān)[10]。既往文獻報道MITF基因缺陷與黑色素瘤[11]、眼白化病[12]、Waardenburg綜合征及Tietz綜合征[3]相關(guān)，其中，Waardenburg綜合征及Tietz綜合征為綜合征型聾。近年來隨著研究的不斷深入，有學者發(fā)現(xiàn)MITF基因突變也會導致非綜合征型聾，例如：2018年，在云南-貴州地區(qū)發(fā)現(xiàn)了一個家系中由于MITF基因雜合突變(c.718C>G, p.Arg240Gly)引起的常染色體顯性非綜合征型聾[4]。2020年，Supranee thongpradit等發(fā)現(xiàn)MITF基因純合突變(c.1022G>A, p.Arg341His)與人類常染色體隱性非綜合征型聾相關(guān)[5]。

本家系中3代4人患病，均為先天性雙側(cè)感音神經(jīng)性聾，通過病史采集與咨詢，未發(fā)現(xiàn)該家系中有皮膚毛發(fā)色素改變、虹膜異色、內(nèi)眥間距異常、上肢異常、巨結(jié)腸等，故判定該家系為非綜合征型聾家系。本研究首先對中國人群常見4個耳聾基因(GJB2、GJB3、SLC26A4和mtDNA 12SrRNA)9個突變位點進行篩查，排除了常見致病基因位點的突變；隨后，通過耳聾基因靶向測序篩選出MITF基因的一個新的突變體，并對該突變進行Sanger測序驗證，發(fā)現(xiàn)該突變與家系耳聾表型共分離，并且選擇家系外的10例正常聽力人作為對照，未發(fā)現(xiàn)該基因位點突變。本研究檢測到的變異位點c.730G>A(p.Gly244Arg, NM_000248)在人群中的攜帶率極低，且檢出者表現(xiàn)為雙耳極重度感音神經(jīng)性聾，經(jīng)該家系驗證分析，先證者及其姐姐、母親、外婆均為極重度感音神經(jīng)性聾且均攜帶該位點雜合變異；先證者之父、舅舅聽力正常，該位點無變異，表明該變異來源于先證者母親。結(jié)合家系圖可以推測，該家系的遺傳模式可能為常染色體顯性遺傳或線粒體遺傳；通過耳聾基因靶向測序未發(fā)現(xiàn)線粒體相關(guān)基因突變，故可排除線粒體遺傳，表明該家系為常染色體顯性遺傳性聾，這也與測序結(jié)果MITF基因發(fā)生雜合突變相對應。

本研究發(fā)現(xiàn)此變異位點位于bHLH-Zip結(jié)構(gòu)域[13]，最早認為此結(jié)構(gòu)域與色素細胞的發(fā)育相關(guān)，隨著研究的不斷進展，近年來發(fā)現(xiàn)，此結(jié)構(gòu)域不僅在色素細胞的發(fā)育中起作用，在耳聾患者中發(fā)現(xiàn)的突變位點也位于該結(jié)構(gòu)域[5]，表明該結(jié)構(gòu)域與耳聾的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但具體機制尚不明確。Steingrimsson等[14]在小鼠中發(fā)現(xiàn)mitf基因Gly244的突變，該位點的突變可能會潛在影響其與DNA的結(jié)合，增強與非特異性DNA的結(jié)合。經(jīng)由物種保守性分析，該位點在各物種中高度保守，結(jié)合Swiss model預測的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)圖，推測該位點的突變很可能也是通過擾亂MITF與DNA的特異性結(jié)合，從而影響MITF基因編碼的蛋白質(zhì)發(fā)揮正常功能。該變異的檢出將有助于MITF蛋白的功能分析和耳聾的基因診斷。

綜上所述，MITF基因c.730G>A(p.Gly244Arg, NM_000248)位點突變可能是本研究中非綜合征型聾家系的致病突變，這是首次在中國非綜合征型聾人群中檢測到該基因位點突變，其是一個致病突變，建議產(chǎn)前做好遺傳咨詢，降低聾兒的出生率。