王宗建，夏培仁，夏維婕，滕金玲

摘要：某戶外購900頭育肥豬，體重約25kg，引進(jìn)一周后發(fā)病。病豬主要表現(xiàn)發(fā)燒、氣喘，用替米考星、多西環(huán)素等藥物治療效果不佳，發(fā)病率上升，重者死亡，造成一定損失。針對此類病情，作者進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查、臨床觀察、實體解剖及實驗室診斷，確診該病例是由豬偽狂犬病和副豬嗜血桿菌病混合感染引起，通過采取綜合措施控制了病情。

關(guān)鍵詞：豬偽狂犬病;副豬嗜血桿菌病;臨床癥狀;剖檢變化;gE抗體;細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定

1臨床癥狀

病豬精神不振，食欲降低或廢絕，發(fā)燒，體溫39.5～41℃，咳嗽，氣喘，關(guān)節(jié)腫脹，患處手感發(fā)熱或有波動感，跛行，有些病例表現(xiàn)叫聲嘶啞，眼神呆滯，后驅(qū)搖擺，走路不穩(wěn)。重癥病例張口氣喘，食欲廢絕，衰竭而死，病程7～10d。

2剖檢變化

頜下淋巴結(jié)腫大硬化，壞死，切面呈紅白相間（圖1）;咽部組織水腫;扁桃體充血呈暗紅色，有白色豆粒狀或片狀壞死灶（圖2）;氣管內(nèi)有豐富的血性黏稠液體或泡沫;肺臟腫大，充血，表面有白色壞死病灶，灶周暗紅，病健部分界明顯;肺臟被膜表面覆有黃白色纖維素滲出物;心包積水;胸腔積水;腹腔內(nèi)有纖維素滲出物附著;肝臟腫大，變硬，上有白色壞死灶（圖3）;腎臟有少量出血點，體積無變化;脾臟上有多量刺狀或點狀白色壞死灶;腸系膜淋巴結(jié)腫大壞死，呈紅白相間的大理石樣病變，質(zhì)地硬化;腹股溝淋巴結(jié)水腫，切面呈血色點狀壞死灶;髖關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)內(nèi)有大量黃白色黏稠液體（圖4）。

疑似診斷：結(jié)合臨床癥狀、剖檢病變綜合診斷，該豬群疑似感染豬偽狂犬病和副豬嗜血桿菌病。為進(jìn)一步確診，進(jìn)行了實驗室診斷。

3實驗室診斷

3.1細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定[1]

確保整個實驗過程嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作。

1）病料采集：無菌采集該病死豬的氣管、肺臟和關(guān)節(jié)液于滅菌容器內(nèi)備用。

2）實驗材料：胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、麥康凱瓊脂、普通營養(yǎng)瓊脂、NAD（V因子）、新生牛血清、細(xì)菌微量生化反應(yīng)管、革蘭氏染色試劑。

3）實驗步驟：用滅菌接種環(huán)挑取氣管內(nèi)容物、肺臟深部刮取物、關(guān)節(jié)液三種病料分別接種在三個加有5%牛血清+0.005%NAD的 TSA在平板上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。

菌落形態(tài)：三個平板上均長有光滑、圓形、邊緣整齊、灰白色、半透明、中等大小的菌落。

培養(yǎng)特性：用滅菌接種環(huán)挑取該分離菌單個典型菌落分別接種在5%牛血清+TSA +0.005%NAD平板、5%牛血清+TSA平板、普通營養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板上，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，觀察：該菌只能在TSA+牛血清+NAD（V因子）平板上良好地生長，其余三種平板均無細(xì)菌生長，說明此菌為“嗜V因子生長菌”。

革蘭氏染色鏡檢：挑取典型菌落，革蘭氏染色后顯微鏡下觀察，該菌呈多形性，絲狀、纖細(xì)長桿菌、纖細(xì)短桿菌、小球桿菌或小球菌為淡紅色的革蘭氏陰性菌（G-）。

生化試驗鑒定：該菌尿素酶試驗陽性、接觸酶試驗陽性，氧化酶試驗陰性。能發(fā)酵蔗糖、葡萄糖，不發(fā)酵山梨醇、甘露醇。

根據(jù)以上鑒定結(jié)果判定，該菌為副豬嗜血桿菌。

3.2豬偽狂犬野毒感染檢測[2]

1）組織病原學(xué)檢測

①樣本制備：無菌采集病死豬的頜下淋巴結(jié)、扁桃體、腦、脾臟適量，混合研磨、離心、制備，取上清液備用;②實驗操作步驟（略）。用豬偽狂犬病毒（gE基因）實時熒光PCR檢測試劑盒（世紀(jì)元亨）檢測上述組織中豬偽狂犬病毒gE基因。結(jié)果判定：被檢樣品閾值（Ct值）≤30并出現(xiàn)特定擴(kuò)增曲線的為PRV陽性;③檢測結(jié)果：該樣本Ct值=20.37<30并出現(xiàn)特定擴(kuò)增曲線，PRV核酸陽性，表明該豬感染偽狂犬野毒。

2）豬偽狂犬病毒gE抗體檢測

①需要抽取樣本量（n）的確定。根據(jù)公式n={1-（1-α）1/D}×{N-（D-1）/2}，計算n=58（其中，N-群體數(shù)量=900，P-預(yù)期流行率=5%，M-檢測方法（ELISA）敏感性=98%，α-置信水平=95%，D=N×P×M）;②樣本制備：用5mL一次性采血器，豬前腔靜脈采血，隨機抽取58份血樣，3，000r/min，離心5min，制備血清;③實驗操作步驟（略）。采用IDEXX豬偽狂犬病病毒gE抗體ELISA檢測試劑盒。使用前，所有試劑和微量包被反應(yīng)板一律恢復(fù)至室溫（18～26℃），并通過輕輕渦旋、旋轉(zhuǎn)或顛倒混勻。整個實驗過程嚴(yán)格操作程序，且不同的樣本和試劑使用不同的吸頭。結(jié)果有效性：陰性對照N（OD650）的平均值（0.873）減去陽性對照P（OD650）的平均值（0.162）等于0.711，大于0.300，試驗成立。計算S/N值，即樣品S（OD650）與陰性對照N（OD650）的平均值之比。結(jié)果判定：被檢樣本S/N值≤0.60的，該樣本判為陽性，即被偽狂犬野毒感染;被檢樣本S/N值>0.60，該樣本判為陰性;被檢樣本0.60