黃敏 徐超逸 陳海燕 朱旦華 梁宗文 段萍

[摘要] 目的 檢測miR-30b在子宮內膜異位癥中的表達水平，并探究miR-30b對子宮內膜異位癥的治療作用。 方法 2018年7月至2020年7月在溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院手術獲取的27例子宮內膜異位癥患者病理組織為子宮內膜異位癥組，15例子宮肌瘤患者子宮內膜組織為正常子宮內膜組。實時定量PCR（qRT-PCR）檢測組織中miR-30b的表達量。培養(yǎng)人原代子宮內膜間質細胞（HESCs），5-乙炔基-2′-脫氧尿苷摻入（EdU）法來檢測miR-30b對細胞增殖能力的影響。根據(jù)starBase 2.0軟件預測與miR-30b相互作用的長鏈非編碼RNA（lncRNA），使用qRT-PCR初步驗證該lncRNA在異位內膜中的表達量及與miR-30b的相互關系。進一步建造子宮內膜異位癥SD大鼠模型，在活體實驗水平，使用miR-30b的模擬物來驗證miR-30b對子宮內膜異位癥異位囊腫的治療作用。 結果 與正常子宮內膜（EN）相比，miR-30b在子宮內膜異位癥（EC）中的表達顯著下降。miR-30b的外源性過表達抑制了HESCs的增殖能力，同時，下調miR-30b的表達量可促進HESCs的增殖能力。StarBase 2.0軟件預測lncRNA OIP5-AS1與miR-30b有多個結合位點，與正常內膜比較，lncRNA OIP5-AS1在異位內膜中表達上調，且與miR-30b的表達量呈負相關。此外，在子宮內膜異位癥的大鼠模型中，miR-30b模擬物顯著抑制子宮內膜異位癥異位囊腫的生長。 結論 miR-30b在異位子宮內膜中低表達且抑制HESCs的增殖能力，可能成為子宮內膜異位癥潛在的治療靶點。

[關鍵詞] 子宮內膜異位癥;miR-30b;lncRNA OIP5-AS1;增殖;SD大鼠

[中圖分類號] R711.7? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2022）04-0035-05

[Abstract] Objective To detect the expression level of miR-30b in endometriosis and explore the therapeutic effect of miR-30b on endometriosis. Methods All specimens were obtained during surgery in the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University from July 2018 to July 2020. Quantitative real-time PCR （qRT-PCR） was used to detect the expression of miR-30b in tissues. The pathological tissues of 27 patients with endometriosis were extracted as the endometriosis group， and the endometrial tissues of 15 patients with uterine fibroids were extracted as the normal endometrium group. Human primary endometrial stromal cells （HESCs） were cultured， and 5-ethynyl-2′-deoxyuridine incorporation （EdU） assay was used to detect the effect of miR-30b on cell proliferation ability. Long non-coding RNAs （lncRNAs） that interact with miR-30b were predicted according to starBase 2.0 software. The expression of this lncRNA in ectopic endometrium and its interrelationship with miR-30b were preliminarily validated using qRT-PCR. Furthermore，a SD rat model of endometriosis was constructed. At the in vivo level， miR-30b mimics were used to validate the therapeutic effect of miR-30b on endometriotic ectopic cysts. Results The expression of miR-30b was significantly decreased in ectopic endometrium （EC） compared with normal endometrium （EN）. Exogenous overexpression of miR-30b inhibited the proliferation ability of HESCs. Meanwhile， down-regulation of miR-30b expression promoted the proliferation ability of HESCs. StarBase 2.0 software predicted that lncRNA OIP5-AS1 had multiple binding sites with miR-30b， and lncRNAOIP5-AS1 was up-regulated in ectopic endometrium compared with normal endometrium， and was negatively correlated with the expression of miR-30b. In addition， in a rat model of endometriosis，we observed that miR-30b mimics significantly inhibited the growth of endometriotic ectopic cysts. Conclusion miR-30b is lowly expressed in ectopic endometrium and inhibits the proliferation of HESCs， which may become a potential therapeutic target for endometriosis.

[Key words] Endometriosis; miR-30b; LncRNAOIP5-AS1; Proliferation; SD rat

子宮內膜異位癥（簡稱內異癥）的特征是子宮內膜樣組織種植在子宮腔以外的部位，常見于卵巢、子宮骶韌帶及子宮直腸陷凹，引起盆腔包塊、進行性加重的痛經(jīng)、性交痛及不孕等[1]。異位的子宮內膜在盆腹腔內能夠成為病灶，必須經(jīng)過粘附、侵襲和血管形成的三部曲，得以達到“生根、生長、生病”，與腫瘤的生物學行為類似[2-3]。近年來內異癥的發(fā)病率呈上升趨勢，約有10%～15%的育齡期女性受其困擾，嚴重危害女性的身心健康，并增加經(jīng)濟負擔。主要的治療手段為藥物聯(lián)合手術治療，但術后5年復發(fā)率達15%～50%[4]。因此，尋找新的治療靶點目前仍然是臨床的迫切需求。

miRNAs是一類小的非編碼RNA（約20～24個核苷酸），可在轉錄后水平控制許多下游信使RNA（mRNA）的表達。微小RNA與mRNA的3′非翻譯區(qū)（UTR）相互作用，誘導翻譯抑制或RNA降解[5]。越來越多的證據(jù)表明，miRNAs參與多種細胞功能，包括細胞增殖、凋亡、遷移、血管生成和分化[6]。其中miR-30b在許多腫瘤中顯著下調，并通過影響細胞生物學功能而抑制腫瘤發(fā)生[7]。但是，miR-30b在子宮內膜異位癥中的表達和功能仍然是未知的。

長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類長度大于200 nt的RNA，可以作為“分子海綿”與mRNA競爭性結合miRNA，發(fā)揮內源性競爭RNA（ceRNA）的作用，與細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移密切相關[8]。lncRNA OIP5-AS1是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA。一些學者對其在某些種類腫瘤中的表達狀態(tài)和功能作用進行研究。Zou等[9]發(fā)現(xiàn)LncRNA OIP5-AS1在結直腸癌（CRC）細胞中抑制細胞活力并促進放射誘導的細胞凋亡。LncRNA OIP5-AS1通過調節(jié)肝細胞癌中miR-3163/VEGFA促進細胞增殖和遷移并誘導血管生成[10]。但其在內異癥中從未被報道。

本研究旨在驗證miR-30b在內異癥中的表達水平及對人子宮內膜間質細胞（HESCs）增殖能力的影響。初步探討miR-30b是否通過ceRNA機制與lncRNA OIP5-AS1相互作用調控內異癥的發(fā)生發(fā)展。此外，本研究建立子宮內膜異位癥大鼠模型，進一步驗證miR-30b在活體水平對內異癥的作用，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗器械及主要試劑

普通手術器械及眼科剪（溫州長風有限公司）;miR-30b模擬物、抑制劑及其各自的陰性對照藥品（廣州銳博生物科技有限公司）;TRIzol試劑盒（Invitrogen，美國卡爾斯巴德）;NanoDrop ND-1000分光光度計（Nanodrop Technologies，美國威爾明頓）;反轉錄試劑盒（Toyobo Co，日本）;Ham′s F12/DMEM（Gibco BRL，美國馬里蘭州蓋瑟斯堡）;10%胎牛血清（Gibco BRL，美國馬里蘭州蓋瑟斯堡）;細胞培養(yǎng)瓶（BD Biosciences，美國）;Lipofectamine 2000（Life Technologies，美國）。

1.2 研究對象

1.2.1 臨床標本? 收集2018年7月至2020年7月在溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院行腹腔鏡手術及術后病理證實為子宮內膜異位癥患者的27例新鮮異位內膜組織，取15例非子宮內膜異位癥的子宮肌瘤患者新鮮正常子宮內膜組織。納入研究27例的內異癥患者組年齡25～39歲，平均（30.8±2.34）歲，15例正常內膜組年齡26～40歲，平均（32.50±2.19）歲。兩組研究對象年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。所有患者的排卵情況正常，月經(jīng)周期正常，并且至少在3個月內沒有給予性激素藥物治療。所有組織樣品均在溫州醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院手術時收集。將樣品儲存在液氮中以備后用。本研究的所有方案均已獲得溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的批準（倫理批準號：LCKY2020-88），所有書面知情同意書均由患者在參與本研究前簽署。

1.2.2 實驗動物? 選取性成熟雌性SD大鼠25只，6～8周齡，體重180～200 g，均購自溫州醫(yī)科大學實驗動物中心，動物許可證號：SCXK（浙）2015-0001。給予標準光照（12 h光照，12 h黑夜），室內溫度18～22℃，濕度40%～50%，標準飼料和水。實驗結束后，所有大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉安樂死。研究經(jīng)動物倫理委員會批準執(zhí)行。

1.3 實驗方法

1.3.1 RNA提取和實時定量PCR? 使用TRIzol試劑從冷凍組織中提取總RNA，并用200 ml無核酸酶的水洗脫，NanoDrop ND-1000分光光度計檢測RNA濃度，樣品在260/280的吸光度比要求在1.8～2.0。取2 μg總RNA于反轉錄試劑盒中進行反轉錄反應。將反轉錄產(chǎn)物在PCR擴增儀中進行擴增，反應條件為94℃ 10 min預變性;95℃ 30 s、60℃ 20 s、72℃ 20 s，循環(huán)40次。以小核RNA（snRNA）U6作為內參，使用2-DDCt方法計算miR-30b的相對表達水平。

1.3.2 人原代子宮內膜間質細胞（HESCs）的分離培養(yǎng)? 人原發(fā)性子宮內膜間質細胞（HESCs）按照先前描述的方法分離[16-17]。用含2%青霉素-鏈霉素的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）沖洗異位子宮內膜（EC）組織，然后將其切成約1 mm3的碎片，并在含HEPES（25 mmol/ml），1%鏈霉素-青霉素，膠原酶Ⅳ（1 mg/ml，15 U/mg）和脫氧核糖核酸酶（0.1 mg/ml，1500 U/mg）的水浴中放置4 h。通過400目的過濾器（Falcon，美國紐約）分離子宮內膜間質細胞，并用Ham′s F12/DMEM（1∶1），熱滅活的10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素混合液懸浮子宮內膜間質細胞。將細胞置入75 cm2的細胞培養(yǎng)瓶中，在含5% CO2的37℃的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。利用波形蛋白的免疫組織化學染色進行細胞純度鑒定。

1.3.3 細胞轉染? miR-30b模擬物，miR-30b抑制劑及其各自的陰性對照購自廣州銳博生物。使用Lipofectamine 2000進行miRNA轉染。miR-30b抑制劑及其對照組的濃度為100 nmol，miR-30b模擬物及其對照組的濃度為50 nmol。

1.3.4 細胞增殖能力測定? 使用EdU（5-乙炔基-2′-脫氧尿苷）摻入測定法檢測細胞增殖能力。先將HESCs在無血清培養(yǎng)基中饑餓24 h。轉染48 h后，使用EdU分析試劑盒檢測細胞增殖能力。通過將EdU陽性細胞的數(shù)量除以DAPI染色的細胞總數(shù)，可以計算出EdU陽性細胞的百分比。所有實驗至少重復3遍。

1.3.5 子宮內膜異位癥大鼠模型的建立及動物給藥? 子宮內膜異位癥大鼠模型是根據(jù)先前的研究，通過對大鼠子宮內膜的自體移植建立的[16]。用2%戊巴比妥（2 g/100 ml）麻醉大鼠，在下腹部切一個大約1 cm的小切口，并逐層打開腹腔。左右兩側結扎左子宮角，切除中間部分，然后放入冷培養(yǎng)基中。去除脂肪組織，并小心地將子宮內膜與子宮肌層分開。將子宮內膜切成約5 mm×5 mm的兩段。在腹壁的每一側分離出皮下間隙，并將兩個子宮內膜片分別放置在左和右間隙中，使子宮內膜面向腹肌。術后每4天皮下注射0.1 mg/（kg·d）的苯甲酸雌二醇，共3次注射以促進自體移植物的生長。公式V=1/2（L×W2）用于計算異位子宮內膜異位囊腫的體積。將大鼠分為兩組，并向子宮內膜異位囊腫中注入等體積的核酸溶液。模擬物對照組和miR-30b模擬物組注射1 nmol RNA;抑制劑對照組和miR-30b抑制劑組注射2.5 nmol RNA。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用Graphpad Prism 5.0統(tǒng)計學軟件進行分析，所有實驗均重復3次。計量資料用（x±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-30b在子宮內膜異位癥中低表達

miR-30b在眾多疾病中表達量下降，但在子宮內膜異位癥中的表達量尚未報道。為了解miR-30b在子宮內膜異位癥中的作用，使用實時定量PCR分析異位子宮內膜（EC）組織和正常子宮內膜（EN）組織中miR-30b的表達水平。miR-30b在正常子宮內膜組（n=15）表達量為（0.88±0.13），而在異位子宮內膜組（n=27）的表達量為（0.39±0.05），較正常子宮內膜組顯著下降（P=0.0005）。見圖1。

2.2 miR-30b抑制人原代子宮內膜間質細胞的增殖能力

為進一步探討miR-30b在子宮內膜異位癥中的生物學功能，培養(yǎng)人原代子宮內膜間質細胞（HESCs）。使用miR-30b模擬物陰性對照及miR-30b模擬物轉染HESCs，上調miR-30b表達量，如封三圖1顯示，EdU增殖實驗結果顯示模擬物對照組增殖陽性的細胞比率為（0.048±0.003）%，而模擬物組增殖陽性的細胞比率為（0.036±0.001）%，細胞增殖能力較細胞對照組顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明miR-30b過表達可以抑制HESCs的增殖能力;與此同時，使用miR-30b抑制劑及其陰性對照inhibitor NC轉染HESCs，下調miR-30b表達量，miR-30b抑制物對照組增殖陽性的細胞比率為（0.027±0.000）%，miR-30b抑制物組增殖陽性的細胞比率為（0.055±0.005）%，miR-30b抑制劑組增殖能力較對照組明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見表1。以上結果均表示miR-30b可以抑制HESCs的增殖能力。

2.3 在內異癥中miR-30b與lncRNA OIP5-AS1的表達呈負相關

lncRNA OIP5-AS1的基因ID為 ENSG000002 47556，本研究通過starBase軟件（starbase.sysu.edu.cn）進行生物信息學分析，圖2A所示，預測miR-30b與OIP5-AS1在RNA水平的不同段堿基序列有多個結合位點。圖2B顯示，qRT-PCR驗證lncRNA OIP5-AS1的表達量，正常子宮內膜組lncRNA OIP5-AS1的相對表達量為（1.64±0.54），而在異位子宮內膜中的相對表達量為（3.90±0.64），與正常子宮內膜組相比，lncRNA OIP5-AS1在異位內膜中的表達顯著上升，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.0171）。圖2C顯示，本研究進一步用Pearson相關性分析表明，與正常內膜相比lncRNA OIP5-AS1在異位子宮內膜中表達與miR-30b表達量呈負相關。

2.4 miR-30b抑制大鼠子宮內膜異位癥模型的異位囊腫生長

為進一步驗證miR-30b在子宮內膜異位癥中的作用，本研究建立子宮內膜異位癥大鼠模型，分別將miR-30b模擬物（n=6）及其陰性對照mimic NC（n=6）的核酸混合液注射至大鼠的異位囊腫，5 d一次，共20 d。將異位囊腫離體后，觀察到模擬物對照組異位囊腫體積為（20.61±0.77）cm3，miR-30b模擬物組異位囊腫體積為（11.97±1.09）cm3。見表2。與模擬物對照組相比，miR-30b模擬物組的異位囊腫體積明顯縮?。▓D3A），圖3B所示，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。表明miR-30可以抑制子宮內膜異位癥異位囊腫的生長，對子宮內膜異位癥有一定的治療作用。

3 討論

子宮內膜異位癥是一種常見的婦科疾病，影響全球大約1.76億的育齡期婦女[11]。然而，到目前為止，其發(fā)病機制未明，手術去除病灶及性激素藥物治療為主要的治療手段，但高復發(fā)率和嚴重的副作用使其治療效果大打折扣[4，12]。所以尋找一種高效且副作用小的治療手段迫在眉睫。miRNA是一類含20～25個核苷酸的單鏈非編碼RNA，參與多種細胞功能，如細胞遷移、侵襲、增殖、凋亡、分化等[13-14]，并在子宮內膜異位癥中扮演重要作用[15]。許多研究表明，miR-30b在多種疾病中差異表達，并調節(jié)這些疾病的發(fā)生和過程，包括膀胱癌[16]、胃癌[17]及結直腸癌[18]，但miR-30b在子宮內膜異位癥中的作用尚未被報道。

本研究觀察到與正常子宮內膜相比，miR-30b在異位內膜組織中的表達量顯著下降。進一步提取人原代子宮內膜間質細胞，結果顯示，上調miR-30b抑制子宮內膜間質細胞的增殖能力，而下調miR-30b則促進細胞的增殖能力，表明miR-30b可以抑制子宮內膜間質細胞的增殖，進而可以在一定程度上治療子宮內膜異位癥。lncRNA是另一類非編碼RNA，可以作為“分子海綿”與mRNA競爭性結合miRNA，發(fā)揮內源性競爭RNA（ceRNA）的作用，進而參與細胞的眾多生物學功能[19-20]，因此本研究猜測miR-30b也通過與某個lncRNA競爭性結合影響內異癥的發(fā)生發(fā)展。starBase軟件預測了miR-30b與lncRNA OIP5-AS1間存在的多個結合位點，并初步驗證miR-30b與lncRNA OIP5-AS1的負相關關系，提示miR-30b與lncRNA OIP5-AS1有可能通過ceRNA機制在內異癥中發(fā)揮作用，miR-30b/lncRNA OIP5-AS1海綿體亦有可能是內異癥的發(fā)病機制之一。在未來，本研究將使用熒光素酶報告實驗及RNA沉淀等實驗進一步驗證miR-30b與lncRNA OIP5-AS1的關系。為了在活體實驗中驗證miR-30b的治療作用，本研究建立子宮內膜異位癥的大鼠模型，結果表明miR-30b模擬物抑制了異位囊腫的生長，進一步驗證miR-30b可以一定程度上治療子宮內膜異位癥。

綜上所述，miR-30b在子宮內膜異位癥中低表達，且與lncRNA OIP5-AS1的表達呈負相關。在體外水平抑制HESC的增殖能力，在活體實驗中抑制子宮內膜異位囊腫的生長，提示miR-30b可能是子宮內膜異位癥治療的新靶標，且miR-30b/OIP5-AS1海綿體為內異癥的發(fā)病機制提供了一定的理論依據(jù)。

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（收稿日期：2021-02-19）