王翠玲，劉信燚，王亞會，張爭，王治東，周鋼橋,

研究報告

MCM2通過抑制p53信號通路促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲

王翠玲1，劉信燚1，王亞會2，張爭1，王治東3，周鋼橋1,3

1. 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所，蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點實驗室，國家蛋白質(zhì)科學(xué)中心，北京 102206 2. 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院生命組學(xué)研究所，蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點實驗室，國家蛋白質(zhì)科學(xué)中心，北京 102206 3. 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850

微小染色體維持蛋白2 (minichromosome maintenance protein 2, MCM2)的異常表達(dá)與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。為探索基因?qū)δ懝馨┘?xì)胞腫瘤生物學(xué)行為的影響及其潛在的作用機(jī)制，本研究首先采用cell counting kit-8 (CCK-8)、平板細(xì)胞克隆形成、Transwell和Invasion實驗證實，可促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力；流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，可加快細(xì)胞周期進(jìn)程，抑制細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步通過對膽管癌組織RNA測序數(shù)據(jù)集的分析發(fā)現(xiàn)，基因與p53信號通路的激活顯著負(fù)相關(guān)。采用實時定量PCR (quantitative real time polymerase chain reaction, qRT-PCR)和蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blotting, WB)實驗發(fā)現(xiàn)，在膽管癌細(xì)胞中可顯著下調(diào)和的mRNA和蛋白表達(dá)水平，顯著上調(diào)和的mRNA和蛋白表達(dá)水平。采用流式細(xì)胞術(shù)、qRT-PCR和WB實驗進(jìn)一步證實基因依賴于p53通路發(fā)揮影響膽管癌細(xì)胞周期和凋亡的功能。最后，通過分析的表達(dá)水平與膽管癌患者臨床預(yù)后的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，在膽管癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，且其高表達(dá)與患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)。綜上所述，本研究初步揭示可能通過抑制p53信號通路促進(jìn)膽管癌的發(fā)生發(fā)展，并提示的高表達(dá)與膽管癌的不良預(yù)后顯著相關(guān)，為未來膽管癌新的臨床診治措施的研發(fā)提供了理論依據(jù)。

膽管癌；MCM2；細(xì)胞增殖；細(xì)胞遷移；細(xì)胞侵襲；細(xì)胞周期；細(xì)胞凋亡；p53

微小染色體維持蛋白2 (minichromosome main-tenance protein 2, MCM2)是組成 MCM復(fù)合體的六種蛋白質(zhì)之一。MCM復(fù)合物是一種穩(wěn)定的異六聚體，在DNA復(fù)制過程中發(fā)揮重要的作用。在細(xì)胞周期的S期，細(xì)胞周期激酶激活MCM復(fù)合物，從而引發(fā)DNA復(fù)制的啟動[8]。以往研究已發(fā)現(xiàn)，MCM2的異常與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。例如，顯著促進(jìn)口腔癌、胃癌、結(jié)腸癌和乳腺癌細(xì)胞的生長、遷移和侵襲；并且，MCM2在這些惡性腫瘤組織中顯著高表達(dá)，并與較差的預(yù)后顯著相關(guān)[9,10]。分子機(jī)制研究顯示，MCM2可通過p53通路抑制卵巢癌細(xì)胞凋亡，從而增加卵巢癌細(xì)胞對卡鉑的敏感性[11]。然而，迄今為止，MCM2在膽管癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚未被報道。因此，本研究旨在探索 MCM2對膽管癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、周期和凋亡等腫瘤生物學(xué)行為的影響，并進(jìn)一步探索其作用機(jī)制和臨床相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系

人源膽管癌細(xì)胞系Huh28、RBE和人源胚腎細(xì)胞系HEK293T均來自于本實驗室細(xì)胞庫。

1.2 實驗試劑

主要包括細(xì)胞培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM)及細(xì)胞傳代所用的0.25%胰蛋白酶(北京細(xì)工生物科技有限公司)；細(xì)胞培養(yǎng)用的胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)(北京百諾威生物科技有限公司)；siRNA 轉(zhuǎn)染試劑盒(廣州銳博生物科技有限公司)；CCK-8 (cell counting kit-8,CK04)檢測試劑盒(北京莊盟國際生物基因科技有限公司)；mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)；SYBR Green熒光定量試劑盒(美國Kapa Biosystem公司)；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(eBioscience? Annexin V Apo-ptosis Detection kit-APC)(美國賽默飛公司)；兔源二抗(1:2000; CW0102M, CWBIO)和小鼠源二抗(1:3000; CW0103M, CWBIO)(北京康為世紀(jì)生物有限公司)；GAPDH抗體(1:1000; 60004-1-Ig, Proteintech)，p53抗體(1:4000; 10442-1-AP, Proteintech)，BAX抗體(1:800; 50599-2-Ig, Proteintech)，BCL2抗體(1:1500; 12789-1-AP, Proteintech)，CCND1抗體(1:1000; 60186-1-Ig, Proteintech) (武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；MCM2 抗體(1:1500; No. 3619T, CST)(美國CST公司)；自行配制的細(xì)胞核染料碘化丙啶(propidium iodide, PI; 1 mg/mL)和磷酸鹽緩沖液(phosphate buf-fer saline, PBS)等。

1.3 細(xì)胞系培養(yǎng)

HEK293T、Huh28和RBE細(xì)胞均使用含有10% FBS和1%青、鏈霉素雙抗的DMEM進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：37℃，5%CO2，并保持一定的濕度。

1.4 慢病毒包裝及靶細(xì)胞感染

將病毒包裝質(zhì)粒(pMD2.G, psPAX2)分別與目的質(zhì)粒pLVX-Puro-Flag-和對照載體pLVX- Puro-Flag，按照質(zhì)量1∶2∶3的比例共轉(zhuǎn)染于HEK293T細(xì)胞中，6 h后更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后收集上清液，用0.45 μm濾器過濾，分裝。然后，在Polybrene (5 μg/mL)介導(dǎo)下，使用收集的病毒上清液感染目的細(xì)胞Huh28和RBE，12 h后更換完全培養(yǎng)基，48 h后加入終濃度為500 μg/mL的嘌呤霉素進(jìn)行篩選，將篩選出的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.5 siRNA轉(zhuǎn)染

采用銳博riboFECT? CP轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染。將siRNA、轉(zhuǎn)染試劑共同孵育0～15 min后，滴加至目的細(xì)胞Huh28和RBE中，37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h后用于后續(xù)實驗。和的siRNA序列由銳博生物科技有限公司合成，序列為：si-Ctrl：5?-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3?；si--#1：5?-GTCGCAGTTTCTCAAGTAT-3?；si--#2：5?-CTGTCATCCTAGCCAACCA-3?；si-：5?-GAA-GAAAATTTCCGCAAAA-3?。

1.6 蛋白質(zhì)提取及蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blotting, WB)實驗

收集對照組和實驗組細(xì)胞，用PBS洗2次，加入含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，置于冰上裂解30 min，12,000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清至新的離心管中，按比例加入適量的蛋白上樣緩沖液，煮沸10 min，得到細(xì)胞總蛋白樣品。配制適宜濃度的SDS-PAGE膠，隨后進(jìn)行上樣、電泳和轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜完畢后將含有目的蛋白的醋酸纖維膜置于含5% 脫脂乳的封閉液中，室溫封閉1～2 h。4℃條件下孵育一抗過夜，TBST漂洗3次，每次5 min，二抗室溫孵育2 h，再用TBST洗3次，最后進(jìn)行顯影。

在礦體資源量雙對數(shù)坐標(biāo)圖上（圖3），大噸位礦體對應(yīng)于較高的分維值(D3=1.22531)；小規(guī)模礦體對應(yīng)于較低的分維值(D1= 0.01114)；中等規(guī)模的礦體中對應(yīng)于分維值D2= 0.1160。與礦體的三個成礦階段相對應(yīng)。當(dāng)D > 1時,說明礦床儲量規(guī)模的分布相對比較集中，中間儲量的礦床比較發(fā)育[3]。因此，肖家山礦區(qū)大噸位礦體有一部分尚未被發(fā)現(xiàn)，仍具有一定的找礦前景。

1.7 CCK-8細(xì)胞增殖實驗

收集處于生長對數(shù)期的細(xì)胞，計數(shù)細(xì)胞后調(diào)整細(xì)胞密度，按每孔2000個細(xì)胞接種于96孔板，每組3個重復(fù)，細(xì)胞培養(yǎng)一定時間后加入含10% CCK-8試劑的無血清DMEM培養(yǎng)基，采用酶標(biāo)儀在450 nm 處檢測吸光度值，收集數(shù)據(jù)，根據(jù)記錄的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析并繪制細(xì)胞生長曲線。

1.8 平板細(xì)胞克隆形成實驗檢測細(xì)胞增殖

取對數(shù)生長期的細(xì)胞消化重懸，按照每孔1000個細(xì)胞接種至6孔板，每組3個重復(fù)，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)8～14 d后取出，使用甲醇固定15 min，0.5%結(jié)晶紫染色20 min，清洗晾干后對6孔板中的細(xì)胞克隆進(jìn)行拍照、計數(shù)和統(tǒng)計分析。

1.9 細(xì)胞遷移和侵襲實驗

對于遷移實驗，將處于對數(shù)生長期的實驗組和對照組細(xì)胞接種至6孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h。然后更換不含血清的DMEM培養(yǎng)基饑餓18 h，隨后消化細(xì)胞，用不含血清的DMEM重懸并計數(shù)。在Transwell上室中鋪7×104個細(xì)胞，在Transwell下室中加入500 μL含有20% FBS的DMEM，培養(yǎng)24～36 h后，取出小室，用PBS清洗1次，甲醇固定15 min，0.5%結(jié)晶紫染色20 min，洗去多余染液，小心擦拭小室內(nèi)部未發(fā)生遷移的細(xì)胞并晾干，在顯微鏡下對穿過小室的細(xì)胞進(jìn)行拍照計數(shù)。對于侵襲實驗，使用加入Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室，其余操作同遷移實驗。

1.10 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期

收集對照組和實驗組細(xì)胞，PBS清洗2次，隨后用 300 μL PBS 重懸后懸滴置700 μL預(yù)冷的無水乙醇中，–20℃固定，過夜。過夜后離心，用PBS清洗1次，將細(xì)胞置于含有200 μg/mL核糖核酸酶 A和1 mg/mL PI 的PBS中，室溫避光孵育15 min。采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞DNA含量，采用ModFit 軟件分析細(xì)胞周期數(shù)據(jù)。

1.11 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

取處于對數(shù)生長期的實驗組和對照組細(xì)胞，以5×105個/孔的密度接種于6孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h。收集細(xì)胞，PBS洗2遍，加入200 μL PBS稀釋的結(jié)合緩沖液，5 μL Annexin V-APC染色液，5 μL PI染色液重懸細(xì)胞，室溫避光孵育15 min。采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，采用FlowJo軟件分析數(shù)據(jù)。

1.12 RNA的提取及實時定量PCR實驗

提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。根據(jù)SYBR Green熒光定量試劑盒說明書進(jìn)行實時定量PCR (quantitative real time polymerase chain reac-tion, qRT-PCR)實驗。以肌動蛋白基因()為內(nèi)參，使用2–??Ct法對mRNA的定量結(jié)果進(jìn)行歸一化處理。所有PCR實驗均進(jìn)行熔解曲線分析，以排除非特異性擴(kuò)增。PCR引物由華大基因公司合成，引物信息見表1。

1.13 通路富集分析

為探索在膽管癌發(fā)生、發(fā)展過程中的分子機(jī)制，本研究下載了國際癌癥基因組圖譜計劃(the cancer genome atlas, TCGA)數(shù)據(jù)庫中36例膽管癌(cholangiocarcinoma, CHOL)患者的mRNA測序數(shù)據(jù)(包括36個癌組織和9個癌旁組織)。根據(jù)癌組織中基因mRNA表達(dá)的中位數(shù)值(9.85)，將36例患者分為高表達(dá)組(≥9.85,= 18)和低表達(dá)組(<9.85,= 18)兩組。使用NetworkAnalyst進(jìn)行基因差異表達(dá)分析，共得到588個顯著差異表達(dá)基因(顯著性定義為：倍數(shù)變化[fold change] > 1.5,0.05)。進(jìn)一步采用Enrichr，對上述588個基因進(jìn)行KEGG和BioGarta通路富集分析，校正后< 0.05的通路被認(rèn)為是顯著富集的通路。此外，本研究采用基因集富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA)對高表達(dá)組和低表達(dá)組進(jìn)行通路富集分析，使用MSigDB (7.4版本)中的信號通路，樣本置換檢驗1000次，以FDR < 0.2作為差異顯著性的評價標(biāo)準(zhǔn)。為了進(jìn)一步驗證通路富集分析結(jié)果，本項研究還下載高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus database, GEO)中30例膽管癌的mRNA測序數(shù)據(jù)(編號：GSE107943，包括30個癌組織和27個癌旁組織)。根據(jù)癌組織中基因mRNA表達(dá)的中值(8.54)，將30例病人分為高表達(dá)組(≥8.54,= 15)和低表達(dá)組(<8.54，= 15)兩組，使用NetworkAnalyst進(jìn)行基因差異表達(dá)分析，共得到768個顯著差異表達(dá)的基因(顯著性定義同上)，進(jìn)一步采用Enrichr對差異表達(dá)基因進(jìn)行通路富集分析。還采用GSEA對高表達(dá)組和低表達(dá)組進(jìn)行通路富集分析。

表1 用于實時定量PCR實驗的引物信息

F: 上游引物；R: 下游引物。

1.14 臨床相關(guān)性分析

為探索基因在膽管癌組織中的異常表達(dá)情況及其與膽管癌病人預(yù)后的相關(guān)性，本研究分析了 TCGA數(shù)據(jù)庫和GEO數(shù)據(jù)庫(GSE107943)中膽管癌患者的mRNA測序數(shù)據(jù)和臨床資料數(shù)據(jù)。分析了這兩個數(shù)據(jù)集中MCM2在癌和癌旁組織間的差異表達(dá)情況，進(jìn)一步根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)集的膽管癌組織中基因mRNA表達(dá)的中值(9.85)分為高表達(dá)(≥9.85,= 18)和低表達(dá)(<9.85,= 18)兩組，分析了的表達(dá)與患者總體生存期和無病生存期的相關(guān)性。

1.15 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0和GraphPad(v6)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗組間數(shù)據(jù)的比較采用Student’s檢驗。癌和癌旁組織間基因的mRNA差異表達(dá)分析采用GraphPad軟件(v6)的Student’s檢驗?；?mRNA表達(dá)值與臨床病理信息的相關(guān)性分析使用GraphPad軟件(v6)的2檢驗。Kaplan-Meier法用于繪制生存曲線，兩組間生存率的差異分析采用GraphPad軟件(v6)中的Log-rank檢驗。所有統(tǒng)計學(xué)檢驗中，< 0.05視為具有顯著性意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 敲低MCM2可顯著抑制膽管癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲

采用特異性靶向基因的siRNA轉(zhuǎn)染Huh28和RBE細(xì)胞，獲得瞬時敲低的細(xì)胞株。隨后，采用CCK-8和平板細(xì)胞克隆形成實驗，探索敲低對膽管癌細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果顯示，敲低能夠顯著抑制Huh28和RBE細(xì)胞的增殖(< 0.001；圖1：A和B)。本研究還采用Transwell和Invasion實驗，探索敲低對膽管癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。結(jié)果顯示，敲低能夠顯著抑制Huh28和RBE細(xì)胞的遷移和侵襲能力(< 0.001；圖1C)。

2.2 過表達(dá)MCM2可顯著促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲

本研究采用pLVX-Puro-Flag-質(zhì)粒構(gòu)建了穩(wěn)定過表達(dá)的Huh28和RBE細(xì)胞株。結(jié)果顯示，過表達(dá)能夠顯著促進(jìn)Huh28和RBE細(xì)胞的增殖能力(< 0.001；圖2：A和B)。此外，過表達(dá)可顯著促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力(< 0.001；圖2C)。

2.3 MCM2可顯著促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的周期進(jìn)程

細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動的基本過程，細(xì)胞周期紊亂是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要生物學(xué)機(jī)制之一[12,13]。為了探索的異常表達(dá)對膽管癌細(xì)胞周期的影響，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)，觀察在Huh28和RBE中擾動基因后細(xì)胞周期的變化。結(jié)果顯示，敲低后，處于G1期的Huh28和RBE細(xì)胞數(shù)量顯著增加，處于S期的細(xì)胞數(shù)量顯著減少，而處于G2/M期的細(xì)胞數(shù)量無顯著改變(< 0.001；圖3A)。反之，過表達(dá)能顯著減少處于G1期的Huh28和RBE細(xì)胞數(shù)量，增加S期的細(xì)胞數(shù)量，而對G2/M期的細(xì)胞數(shù)量無顯著影響(< 0.01；圖3B)。以上結(jié)果提示，能夠顯著促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的周期進(jìn)程。

圖1 敲低MCM2后可顯著抑制膽管癌細(xì)胞系的增殖、遷移和侵襲能力

A：敲低可顯著抑制Huh28細(xì)胞的增殖能力；B：敲低可顯著抑制RBE細(xì)胞的增殖能力；C：敲低可顯著抑制Huh28和RBE細(xì)胞的遷移和侵襲能力。采用雙側(cè)Student’s檢驗，**：< 0.01；***：< 0.001。

2.4 MCM2可顯著抑制膽管癌細(xì)胞的凋亡

腫瘤細(xì)胞凋亡異常也是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要生物學(xué)機(jī)制之一[14]。為了探索的異常表達(dá)對膽管癌細(xì)胞凋亡的影響，采用AnnexinⅤ-APC/PI 染色法，檢測擾動基因后對Huh28和RBE細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，敲低后可顯著促進(jìn)Huh28和RBE細(xì)胞的凋亡(< 0.01；圖4A)；而過表達(dá)后則顯著抑制Huh28和RBE細(xì)胞的凋亡(< 0.05；圖4B)。

2.5 MCM2影響膽管癌細(xì)胞的p53信號通路

以往的研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌中，基因可通過抑制p53信號通路而發(fā)揮癌基因的功能[15]。為了驗證在膽管癌中是否也通過調(diào)控p53信號通路而發(fā)揮癌基因的功能，本團(tuán)隊分別從TCGA數(shù)據(jù)庫(CHOL,= 36)和GEO數(shù)據(jù)庫中(GSE107943,= 30)下載了膽管癌組織的mRNA測序數(shù)據(jù)集，并分別根據(jù)對應(yīng)數(shù)據(jù)集癌組織基因mRNA表達(dá)水平的中位數(shù)值，將樣本分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。隨后，采用NetworkAnalyst[16]軟件，篩選兩組間顯著差異表達(dá)的基因(fold change > 1.5,< 0.05)。由此，本研究在TCGA數(shù)據(jù)集和GSE107943數(shù)據(jù)集中，分別得到588個和768個顯著差異表達(dá)的基因。進(jìn)一步，采用Enrichr[17]分別對上述兩個差異表達(dá)基因集進(jìn)行通路富集分析，結(jié)果均顯示，這些差異表達(dá)基因顯著富集于p53信號通路(圖5A)。基因集富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA)結(jié)果也顯示，的表達(dá)與p53通路的活性顯著負(fù)相關(guān)(圖5B)。總之，通過上述生物信息學(xué)分析，初步提示在膽管癌細(xì)胞中顯著抑制p53信號通路。

圖2 過表達(dá)MCM2可顯著促進(jìn)膽管癌細(xì)胞系的增殖、遷移和侵襲能力

A：過表達(dá)顯著促進(jìn)Huh28細(xì)胞的增殖能力；B：過表達(dá)顯著促進(jìn)RBE細(xì)胞的增殖能力；C：過表達(dá)顯著促進(jìn)Huh28和RBE細(xì)胞的遷移和侵襲能力。采用雙側(cè)Student’s檢驗，：< 0.001。

2.6 MCM2通過抑制p53信號通路而發(fā)揮癌基因的功能

p53通路是重要的抑癌信號通路，該通路可通過調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程和/或細(xì)胞凋亡等多個重要的生物學(xué)進(jìn)程來發(fā)揮抑癌作用[18]。前文通過生物信息學(xué)分析，已初步提示可調(diào)控p53信號通路。隨后，進(jìn)一步在mRNA和蛋白水平驗證是否影響p53及其下游相關(guān)靶分子的表達(dá)。qRT-PCR和WB結(jié)果顯示，敲低后，、促凋亡因子的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)，而凋亡抑制因子、細(xì)胞周期蛋白D1()的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào)(< 0.01；圖6：A和B)。反之，過表達(dá)可顯著下調(diào)和的表達(dá)水平，上調(diào)和的表達(dá)水平(< 0.05；圖6：C和D)。上述結(jié)果初步揭示，基因在膽管癌細(xì)胞中抑制p53通路。

圖3 MCM2可顯著促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的周期進(jìn)程

A：敲低使Huh28和RBE細(xì)胞發(fā)生S期阻滯；B：過表達(dá)顯著促進(jìn)Huh28和RBE細(xì)胞的周期進(jìn)程。PI：碘化丙啶(propidium iodide)。采用雙側(cè)Student’s檢驗，**：< 0.01；***：< 0.001。

2.7 MCM2通過抑制p53信號通路而影響膽管癌細(xì)胞的周期和凋亡

上述實驗已證明了可促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程，并抑制膽管癌細(xì)胞的凋亡，同時證實了能夠抑制及其下游相關(guān)靶分子的表達(dá)。為了進(jìn)一步證明是否依賴于p53發(fā)揮促癌功能，首先采用特異性靶向和的siRNA轉(zhuǎn)染Huh28和RBE細(xì)胞，獲得同時敲低和的細(xì)胞株。通過qRT-PCR和WB實驗，在Huh28和RBE細(xì)胞中，驗證及其下游相關(guān)靶分子的mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在敲低的情況下，敲低對及其下游相關(guān)靶分子、、的mRNA和蛋白表達(dá)水平均無顯著影響(< 0.05；圖7A)。同時，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測敲低后，進(jìn)一步敲低對Huh28和RBE細(xì)胞的周期和凋亡的影響。結(jié)果顯示，在敲低的情況下，敲低對膽管癌細(xì)胞的周期和凋亡均無顯著影響(< 0.01；圖7：B和C)。上述結(jié)果初步提示，依賴于p53信號通路而發(fā)揮影響膽管癌細(xì)胞周期和凋亡的功能。

圖4 MCM2顯著抑制膽管癌細(xì)胞凋亡

A：敲低顯著促進(jìn)Huh28和RBE細(xì)胞凋亡；B：過表達(dá)顯著抑制Huh28和RBE細(xì)胞凋亡。PI：碘化丙啶(propidium iodide)；Annexin V：膜聯(lián)蛋白V。采用雙側(cè)Student’s檢驗，*：< 0.05；**：< 0.01；***：< 0.001。

2.8 MCM2在膽管癌組織中高表達(dá)且與患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)

為了探索的異常表達(dá)與膽管癌病人臨床預(yù)后的相關(guān)性，本項研究下載了TCGA數(shù)據(jù)庫(CHOL：癌組織= 36，癌旁組織= 9)和GEO數(shù)據(jù)庫(GSE107943：癌組織= 30，癌旁組織= 27)中膽管癌患者的RNA測序數(shù)據(jù)和/或臨床信息。通過差異表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)在膽管癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織(< 0.0001；圖8A)。回顧性分析顯示，癌組織中的表達(dá)水平與其年齡、性別和患者的病理分期無顯著相關(guān)性(表2)。進(jìn)一步的生存分析顯示，高表達(dá)組的膽管癌患者其總體生存率和無病生存率均低于低表達(dá)組(邊緣統(tǒng)計學(xué)意義，= 0.086；圖8B)。上述結(jié)果進(jìn)一步提示在膽管癌中可能發(fā)揮癌基因的功能，并且提示可能是膽管癌不良預(yù)后的候選標(biāo)志物。

3 討論

膽管癌是起源于膽管上皮細(xì)胞、具有高度侵襲性的惡性腫瘤[19]。近年來，膽管癌的發(fā)病率和死亡率均呈逐漸上升趨勢[3]。鑒定膽管癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)基因，闡明癌癥的發(fā)病機(jī)制，將為膽管癌的防治提供理論依據(jù)。本研究在膽管癌細(xì)胞系中初步探索了基因?qū)δ懝馨┘?xì)胞的增殖、遷移、侵襲、細(xì)胞周期和凋亡的影響，并通過初步的生物信息學(xué)分析和功能實驗，提示了該基因可通過p53信號通路促進(jìn)膽管癌的發(fā)生發(fā)展，且其高表達(dá)與膽管癌患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)。

圖5 MCM2基因可顯著抑制p53信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

A：從TCGA(TCGA-CHOL,= 36)和GEO數(shù)據(jù)庫中(GSE107943,= 30)獲取膽管癌的RNA測序數(shù)據(jù)集，并根據(jù)對應(yīng)數(shù)據(jù)集的癌組織中基因mRNA表達(dá)水平的中位數(shù)值分為高表達(dá)和低表達(dá)兩組。隨后，采用NetworkAnalyst軟件在TCGA和GSE107943數(shù)據(jù)集中篩選高、低表達(dá)兩組間顯著差異表達(dá)的基因(fold change > 1.5,< 0.05)，分別得到588個和768個顯著差異表達(dá)的基因。進(jìn)一步采用Enrichr對顯著差異表達(dá)的基因集進(jìn)行KEGG和BioCarta通路富集分析，結(jié)果均提示顯著富集于p53信號通路。B：GSEA富集分析p53的一系列參與調(diào)控細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的靶基因，p53下游負(fù)向調(diào)控細(xì)胞衰老、凋亡和細(xì)胞周期的靶基因顯著富集于正相關(guān)區(qū)域(靠左邊)，提示促進(jìn)抑制衰老、凋亡和細(xì)胞周期阻滯相關(guān)基因的表達(dá)。TCGA：際癌癥基因組圖譜計劃(the cancer genome atlas)；GEO：高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus database)；GSEA：基因集富集分析(gene set enrichment analysis)；NES：標(biāo)準(zhǔn)化富集分?jǐn)?shù)(normalized enrichment score)。< 0.05為顯著富集。

圖6 MCM2對p53及其相關(guān)靶基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響

A：敲低上調(diào)Huh28細(xì)胞的和的mRNA和蛋白表達(dá)水平，下調(diào)和的mRNA和蛋白表達(dá)水平；B：敲低上調(diào)RBE細(xì)胞的和的mRNA和蛋白表達(dá)水平，下調(diào)和的mRNA和蛋白表達(dá)水平；C：過表達(dá)下調(diào)Huh28細(xì)胞的和的mRNA和蛋白表達(dá)水平，上調(diào)和的mRNA和蛋白表達(dá)水平；D：過表達(dá)下調(diào)RBE細(xì)胞的和的mRNA和蛋白表達(dá)水平，上調(diào)和的mRNA和蛋白表達(dá)水平。采用雙側(cè)Student’s檢驗，*：< 0.05；**：< 0.01；***：< 0.001。

MCM2是MCM復(fù)合物成員之一。已有研究發(fā)現(xiàn)，MCM2可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡和衰老過程，當(dāng)MCM2表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞的增殖能力顯著下降[20]。MCMs在復(fù)制起始過程中具有解旋酶活性，可通過調(diào)控細(xì)胞周期內(nèi)復(fù)制起始點發(fā)揮作用[21]。已有研究報道，MCM蛋白可以通過影響多種細(xì)胞功能、DNA合成和轉(zhuǎn)錄來促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[22]。例如，基因參與肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和細(xì)胞周期等過程，且的高表達(dá)與肺癌患者的較低生存率顯著相關(guān)[23]。肝癌組織的蛋白質(zhì)組學(xué)分析也發(fā)現(xiàn)，在肝癌組織中顯著高表達(dá)，敲低后可顯著抑制CCND依賴性激酶途徑，從而引起HepG2細(xì)胞周期發(fā)生S期阻滯、抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[24]。然而，在膽管癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制一直未見報道。本項研究發(fā)現(xiàn)能夠顯著促進(jìn)膽管癌細(xì)胞系的增殖、遷移和侵襲能力；并且，能顯著促進(jìn)膽管癌細(xì)胞系的細(xì)胞周期進(jìn)程、抑制細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果均提示在膽管癌中可能發(fā)揮癌基因的功能。

本研究發(fā)現(xiàn)，在膽管癌細(xì)胞中，MCM2能夠顯著下調(diào)p53和BAX的表達(dá)水平，上調(diào)BCL2和CCND1的表達(dá)，且MCM2依賴于p53通路發(fā)揮癌基因的功能。那么，MCM2可能通過何種途徑抑制p53通路？已知MCM復(fù)合物是一種DNA解旋酶，在DNA復(fù)制過程中發(fā)揮重要的作用。越來越多的研究提示，MCM復(fù)合物還與其他生物學(xué)過程密切相關(guān)[25]。例如，MCM復(fù)合體能夠與RNA聚合酶II或特定的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生相互作用，從而在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮功能[26]。其中，MCM2已被報道能與RNA聚合酶II結(jié)合而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控的功能[27,28]。由此，本團(tuán)隊推測，MCM2可能通過上述途徑在轉(zhuǎn)錄水平抑制p53通路。有趣的是，已有研究報道，在低氧條件下的多種細(xì)胞類型中，MCM蛋白能夠直接與轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α結(jié)合，并通過增強(qiáng)HIF-1α的蛋白酶體降解而負(fù)向調(diào)控HIF-1的轉(zhuǎn)錄活性[29]。已知HIF-1α能夠直接與p53基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)的表達(dá)[30]。綜上所述，MCM2可能通過與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用形成轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物，從而在轉(zhuǎn)錄水平影響的表達(dá)。但針對MCM2與p53通路間的具體調(diào)控機(jī)制，還需進(jìn)一步的實驗研究。

圖7 MCM2依賴于p53通路影響膽管癌細(xì)胞的周期和凋亡

A：Huh28和RBE細(xì)胞中，在敲低的情況下，敲低對、和的mRNA和蛋白表達(dá)無影響；B：Huh28和RBE細(xì)胞中，在敲低的情況下，敲低對細(xì)胞周期進(jìn)程無顯著影響；C：Huh28和RBE細(xì)胞中，敲低的情況下，敲低，不影響細(xì)胞凋亡。PI：碘化丙啶(propidium iodide)；Annexin V：膜聯(lián)蛋白V。采用雙側(cè)Student’s檢驗，*：< 0.05；**：< 0.01；***：< 0.001。

圖8 MCM2的異常表達(dá)及其與膽管癌患者總體生存率和無病生存率的相關(guān)性

A：在膽管癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織；B：生存曲線圖顯示與低表達(dá)的膽管癌患者相比，高表達(dá)的膽管癌患者具有更低的總體生存率(左)和無病生存率(右)。HR：風(fēng)險比(hazard ratio)；差異表達(dá)分析采用GraphPad(v6)的Student’s檢驗；Kaplan-Meier法用于繪制生存曲線，兩組間生存率的差異分析采用GraphPad(v6)的Log-rank檢驗。< 0.05為有顯著性差異。

表2 膽管癌組織中MCM2基因的mRNA表達(dá)水平與臨床特征和社會人口學(xué)因素的相關(guān)性分析

根據(jù)美國癌癥聯(lián)合會和國際抗癌聯(lián)盟的TNM (tumor-node-metastasis)分期，可將腫瘤分為I、II、III和IV期；值采用2檢驗計算，< 0.05為差異具有顯著性意義。

總之，本研究初步探索了在膽管癌細(xì)胞中的功能和作用機(jī)制，初步提示其可能通過抑制p53通路而發(fā)揮癌基因的作用，并且評價了其作為膽管癌患者預(yù)后標(biāo)志物的潛在價值，為未來膽管癌新的臨床診治措施的研發(fā)提供了理論依據(jù)。

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MCM2 promotes the proliferation, migration and invasion of cholangiocarcinoma cells by reducing the p53 signaling pathway

Cuiling Wang1, Xinyi Liu1, Yahui Wang2, Zheng Zhang1, Zhidong Wang3, Gangqiao Zhou1,3

The abnormal expressions of minichromosome maintenance protein 2 (MCM2) are closely related to the development of various kinds of cancers. We aimed to explore the functions and potential molecular mechanisms ofgene in cholangiocarcinoma (CCA) cell lines (Huh28 and RBE). First, the cell counting kit-8 (CCK-8), plate clone formation, transwell and invasion assays showed thatpromotes the proliferation, migration and invasion of CCA cells. Flow cytometry assays showed thatsignificantly promotes the cell cycle, and inhibits the apoptosis of CCA cells. Further, by analyzing the RNA sequencing data of cholangiocarcinoma, we found thatgene is significantly negatively correlated with p53 signaling pathway. Quantitative real time polymerase chain reaction (qRT-PCR) and Western blotting (WB) assays confirmed thatin CCA cells significantly down-regulated the mRNA and protein expression levels ofand, and up-regulated the mRNA and protein expression levels ofand. Flow cytometry, qRT-PCR and WB assays confirmed thatpromotes CCA through p53 pathway. Finally, we found thatis up-regulated in CCA tissues compared to the matched non-tumor cholangiocarcinoma tissues, and the high expressions ofare significantly associated with the poor clinical outcomes of CCA patients. In conclusion, this study revealed thatpromotes the development of CCA by reducing the p53 pathway, and its high expression levels predict poor prognosis in CCA patients. These results provide a theoretical basis for the development of new clinical diagnosis and treatment of cholangiocarcinoma in the future.

cholangiocarcinoma; MCM2; proliferation; migration; invasion; cell cycle; apoptosis; p53

2021-12-20;

2022-01-18;

2022-01-29

國家自然科學(xué)基金項目(編號：31771397)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31771397)]

王翠玲，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：放射醫(yī)學(xué)。E-mail: 1376544094@qq.com

周鋼橋，博士，研究員，研究方向：醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)。E-mail: zhougq114@126.com

10.16288/j.yczz.21-426

(責(zé)任編委: 謝小冬)