夏全超，張玉霞，孫明雪，陳衛(wèi)東，孫 昊，張慶昕，叢百明

(1.內蒙古民族大學農學院，內蒙古 通遼 028041；2.內蒙古自治區(qū)通遼市畜牧獸醫(yī)科學研究所，內蒙古 通遼 028000)

苜蓿(MedicagosativaL.)是世界公認的優(yōu)質高產多年生豆科牧草[1]，具有營養(yǎng)元素全面、蛋白質含量高、家畜喜食、可利用年限長的特點，被譽為“牧草之王”[2-3]，近年來在我國種植面積不斷增加，為我國畜牧業(yè)發(fā)展提供了有力保障。科爾沁地區(qū)位于內蒙古東部，該地區(qū)四季分明，降水主要集中在夏季，冬季嚴寒且降水少，并且近年來在初春時期出現(xiàn)了倒春寒現(xiàn)象，嚴重限制了苜蓿越冬[4]。苜蓿根頸是冬季苜蓿植物體最上部的休眠器官，是對凍害最敏感的部位，與苜蓿的抗寒性、再生性等均有密切關系，因此在苜蓿越冬和春季返青時的發(fā)枝萌芽過程中發(fā)揮著極其重要的作用[5]。磷元素是植物生長發(fā)育必不可少的生命元素，同時也是植物合成磷脂、核酸、ATP等重要物質的主要原料，在植物的光合作用、呼吸作用、脂肪代謝、糖代謝及氮代謝等生理生化過程中起著不可替代的作用[6]。植物細胞膜中的磷脂可與蛋白質、糖類等物質相互作用，緩解低溫冷凍引起的細胞脫水，保護生物膜的穩(wěn)定，在植物抗寒性方面有重大作用[7]。有研究表明磷能提高植物體內可溶性蛋白、脯氨酸、可溶性糖類等物質濃度從而提高植物抗寒能力[8]。土壤中磷的總量大約在0.02%～0.2%[9]，與其他大量元素相比含量較低[10]。雖然土壤中含有一定量的有效磷和無效磷[11-13]，但傳統(tǒng)磷肥主要施用在土壤表面，并且磷在土壤中的流動性差又極易被固持，導致植物對土壤中的磷元素利用率很低，進而影響植物的生長及生理代謝[14-15]。但是過量施入磷肥又會造成浪費和環(huán)境污染，因此，本研究針對苜蓿栽培生產中磷素與苜蓿根系空間分布匹配性差的問題，探討不同施磷深度對苜蓿根頸含氮物質及抗寒性的影響，旨在為苜蓿抗寒高產栽培中磷肥的高效管理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于內蒙古通遼市開魯縣東風鎮(zhèn)林輝草業(yè)公司基地(121°31′E，43°60′N)，該地區(qū)屬于溫帶大陸性半干旱氣候，四季分明，夏季炎熱多雨，冬季干旱少雪，≥10℃年積溫為3 000℃～3 200℃，年平均氣溫5.8℃，無霜期140～150 d，年平均降水量約370 mm，年平均風速3.1～4.3 m·s-1，土壤有機質含量為64.10 mg·kg-1，堿解氮含量為35.88 mg·kg-1，全氮含量44.01 mg·kg-1，速效磷含量3.59 mg·kg-1，速效鉀含量77.89 mg·kg-1。

1.2 試驗設計

1.2.1 大田試驗設計 供試材料為‘北極熊’紫花苜蓿品種(M.sativa‘Gibraltar’)，由北京百思特有限公司提供。該品種的秋眠級為2.0級，幼苗強壯、根系發(fā)達、多葉率高，是抗寒性能非常突出的苜蓿品種。試驗采用隨機區(qū)組設計，于2020年7月1日播種，播種量為22.5 kg·hm-2，行距為30 cm，小區(qū)面積為3 m×5 m=15 m2。播種前一次性施入氯化鉀(100 kg·hm-2K2O)為基肥。磷肥用量為225 kg·hm-2(P2O5)，共設置5個施磷深度：施土地表面(S0)、距離地表7.5 cm(S1)、15 cm(S2)、22.5 cm(S3)、30 cm(S4)，并設置不施磷肥作為對照(CK)，每個處理設置3次重復，共18個小區(qū)，磷肥均作為基肥于播種前一次性施入，施磷方式為開溝條施。試驗田灌水使用指針式噴灌，并正常進行田間管理。于封凍前11月15日挖取長勢一致的苜蓿根系(越冬器官)，帶回室內進行低溫處理，取苜蓿根系距離地表0～2 cm部位，測定含氮物質含量和相對電導率。

1.2.2 低溫處理 參照朱愛民等[16]的試驗方法，每個處理取50株長勢均勻一致的苜蓿根頸，平均分成4份，其中1份放入4℃冰箱中儲存(低溫冷藏)，將另外3份苜蓿根系用蒸餾水沖洗干凈，先用20 cm×30 cm的脫脂純棉布包裹，均勻噴灑3 mL蒸餾水使棉布保持濕潤，再用30 cm×30 cm的錫箔紙包裹，放入可程式恒溫恒濕試驗箱分別進行-10℃、-20℃、-30℃低溫處理(低溫冷凍)?？沙淌胶銣睾銤裨囼炏湓O置為：以4℃為起點，先以4℃·h-1的速率降溫，在目標溫度下保持6 h，后以4℃·h-1的速度升溫至4℃，取出后在4℃下放置12 h，與冷藏處理材料(4℃)同時測定根頸相對電導率、可溶性蛋白、游離氨基酸和脯氨酸含量。

1.3 測定指標及方法

相對電導率(REC)采用DDS電導率儀測定法進行測定[17]，可溶性蛋白(SP)含量采用考馬斯亮藍 G-250 法測定[17]，脯氨酸(Pro)含量采用酸性茚三酮法測定[17]，游離氨基酸(AA)含量采用水合茚三酮法測定[17]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用WPS 2019軟件整理數(shù)據(jù)和繪制圖表，用DPS 7.0軟件進行方差顯著性分析及相關性分析，采用二因素試驗統(tǒng)計分析Duncan新復極差法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 施磷深度對苜蓿相對電導率的影響

如表1所示，S0處理的苜蓿根頸相對電導率在不同低溫脅迫處理下均小于CK，說明施磷能降低苜蓿根頸相對電導率。不同施磷深度處理之間，以S2施磷深度處理的相對電導率在不同低溫脅迫處理下均達到最小值，說明該施磷深度最有利于減少細胞液外滲程度，降低細胞膜透性；隨著處理溫度的降低，苜蓿根頸的相對電導率不斷增加，且在-30℃下達到最大值，說明隨著低溫脅迫處理溫度的降低，苜蓿根頸細胞膜透性增加，電解質外滲液增多，細胞膜破壞更嚴重。

表1 施磷深度對苜蓿根頸相對電導率的影響/%

2.2 施磷深度對苜蓿可溶性蛋白含量的影響

如表2所示，S0處理的苜蓿根頸可溶性蛋白含量在不同低溫脅迫處理下均顯著高于CK(P<0.05)，在4℃、-10℃、-20℃和-30℃處理下分別較CK增長了33.32%、61.66%、36.11%和37.46%，說明與不施磷相比，施用磷肥能提高苜蓿根頸內的可溶性蛋白含量。不同施磷深度處理之間，S2處理的可溶性蛋白含量在不同低溫脅迫處理下均較高，說明S2(距離土壤表面15 cm施磷)處理最有利于苜蓿根頸中可溶性蛋白的積累。3個低溫脅迫處理下，隨著脅迫溫度的降低，苜蓿根頸可溶性蛋白含量也逐漸降低，-10℃低溫脅迫處理下的可溶性蛋白含量均顯著高于其他溫度處理(P<0.05)，說明-10℃低溫脅迫處理最有利于增加苜蓿根頸中的可溶性蛋白含量，更有利于維持細胞滲透勢。

表2 施磷深度對苜蓿根頸可溶性蛋白含量的影響/(mg·g-1)

2.3 施磷深度對苜蓿脯氨酸含量的影響

如表3所示，S0處理的苜蓿根頸脯氨酸含量在不同低溫脅迫處理下均顯著高于CK(P<0.05)，在4℃、-10℃、-20℃和-30℃處理下分別較CK增長了75.47%、112.50%、84.29%和172.95%，說明與不施磷相比，施用磷肥能提高苜蓿根頸內的脯氨酸含量。不同施磷深度處理之間，S0、S1和S2處理的脯氨酸含量在不同低溫脅迫處理下均較高，說明施表面、距離土表10cm或15 cm，均有利于苜蓿根頸中脯氨酸的積累。且S1、S2和S3施磷深度處理下，-10℃、-20℃和-30℃低溫脅迫處理間的苜蓿根頸脯氨酸含量均無顯著性差異(P<0.05)。綜上說明S1和S2磷肥施用深度處理能促進苜蓿根頸中的脯氨酸積累，且受低溫脅迫溫度變化的影響較小。

表3 施磷深度對苜蓿根頸脯氨酸含量的影響/(μg·g-1)

2.4 施磷深度對苜蓿游離氨基酸含量的影響

如表4所示，S0處理的苜蓿根頸可溶性蛋白含量在4℃、-10℃、-20℃低溫脅迫處理下均顯著高于CK(P<0.05)，分別較CK增長了42.03%、16.07%和32.56%，說明與不施磷相比，施用磷肥能提高苜蓿根頸內的游離氨基酸含量。3個低溫脅迫處理下，隨著脅迫溫度的降低，苜蓿根頸游離氨基酸含量也逐漸降低，-10℃處理下的游離氨基酸含量在不同施磷深度處理下均顯著高于其他溫度處理(P<0.05)，其中S0、S1和S2處理的游離氨基酸含量顯著高于S3和S4處理，說明施表面、距離土表10 cm或15 cm均有利于提高苜蓿根頸中游離氨基酸含量。而-30℃低溫脅迫處理的游離氨基酸含量顯著低于其他低溫脅迫處理(P<0.05)，數(shù)值接近于0，說明-30℃低溫脅迫已導致苜蓿根頸細胞中游離氨基酸無法積累。

表4 施磷深度對苜蓿根頸游離氨基酸含量的影響/(mg·g-1)

2.5 相對電導率與苜蓿根頸中的含氮保護物質相關性分析

如表5所示，4℃處理下，脯氨酸含量與游離氨基酸含量呈極顯著正相關(P<0.01)。-10℃低溫脅迫處理下，相對電導率與可溶性蛋白呈極顯著負相關(P<0.01)，與脯氨酸含量呈顯著負相關(P<0.05)；脯氨酸含量與可溶性蛋白含量呈顯著正相關(P<0.05)；-20℃低溫脅迫處理下，可溶性蛋白與脯氨酸和游離氨基酸含量呈極顯著正相關(P<0.01)；脯氨酸含量與游離氨基酸含量呈極顯著正相關(P<0.01)；-30℃低溫脅迫處理下，相對電導率與可溶性蛋白含量呈極顯著負相關(P<0.01)，游離氨基酸含量與可溶性蛋白含量呈顯著正相關(P<0.05)，與脯氨酸含量呈極顯著正相關(P<0.01)。表明苜蓿根頸可溶性蛋白含量的增加有利于降低相對電導率，而低溫脅迫下苜蓿根頸中的含氮保護物質含量相互作用、相互促進增長或轉化，提高苜蓿的抗寒性。

表5 相對電導率與苜蓿根頸中含氮保護物質的相關性

3 討 論

低溫脅迫條件下，植物細胞膜受損，膜透性增大，嚴重時會導致細胞死亡，因此相對電導率可以用作反映植物受傷害程度及植物抗寒能力強弱的指標[18-19]。程嘉惠等[20]的研究結果表明，草莓葉片相對電導率隨著脅迫溫度下降而上升，與本研究結果一致。并且本研究結果表明，-10℃、-20℃和-30℃ 3個不同低溫脅迫處理下，相對電導率均在S2處理(施磷深度為15 cm)時最低，表明根頸在此深度下受傷害程度最低。

可溶性蛋白是植物所有蛋白組分中最活躍的一部分，可溶性蛋白的含量可以反映各種蛋白類調節(jié)物質的水平，也能在一定程度上反映出植物體的總代謝情況，是用來衡量植物對逆境脅迫抗性的重要參考指標[21]。本試驗研究結果表明，隨著脅迫溫度的降低，苜蓿根頸可溶性蛋白含量表現(xiàn)為先上升后下降的變化趨勢，且在-10℃下達到最大值。楊振亞等[22]的研究結果表明5個雷竹變型可溶性蛋白含量均隨溫度的降低呈先升高后降低的趨勢，與本研究結果一致。本研究結果表明，在S2處理時苜蓿根頸可溶性蛋白含量最高，說明15 cm施磷深度最有利于可溶性蛋白的積累，促進氮素代謝，以維持細胞一定的代謝活性和脅迫抵抗能力。

游離氨基酸是參與蛋白質等含氮化合物合成與分解過程的含氮保護物質，其含量的多少可反映植物體內的氮素代謝情況[23]。脯氨酸既可以作為氮源，又可以作為滲透調節(jié)物質，維持細胞滲透勢，保護生物大分子結構，調節(jié)細胞內pH值[24-26]。本試驗研究表明施用磷肥處理的苜蓿根頸脯氨酸含量在不同低溫脅迫處理下均顯著高于CK(P<0.05)，與王天等[8]的研究結果基本一致。并且本研究中，-10℃處理下的脯氨酸和游離氨基酸含量在不同施磷深度處理下均顯著高于4℃溫度處理，且均在S0和S2處理下數(shù)值最高，說明適當深度增施磷肥有利于低溫脅迫下苜蓿根頸中脯氨酸與游離氨基酸的積累；增強細胞保水能力，保護蛋白分子與酶的活性，減輕膜脂過氧化程度，在植物抗寒性方面有著極其重要的作用[27]。

目前實際牧草生產中施用磷肥時，多采用拋施的方式，即施到土壤表面，或在播種時隨種子一并施入到距離土表3～5 cm處，因此易發(fā)生土壤磷流失多、植物吸收少的問題。但是根據(jù)本研究結果顯示，距離土壤表面15 cm處施用磷肥最有利于提高苜蓿含氮保護物質含量，此深度下苜蓿根系密集，可最大限度地縮減苜蓿根系與肥料的距離，擴大了苜蓿根系與磷肥的接觸面積，磷肥的供需匹配性變好[5]，進而促進較深土層中苜蓿根系與養(yǎng)分接觸，提高對磷肥的吸收和利用效率，促進苜蓿越冬器官內脯氨酸、游離氨基酸和可溶性蛋白等含氮保護物質的積累，提高苜?？购芰Α?/p>

4 結 論

綜上所述，-10℃、-20℃和-30℃ 3個不同低溫脅迫處理下，S2(施磷深度為15 cm)處理下苜蓿根頸相對電導率達到最小值，可溶性蛋白含量達到最大值；-10℃處理下的脯氨酸和游離氨基酸含量在不同施磷深度處理下均與4℃處理達到顯著性差異(P<0.05)，其中在S0和S2處理下數(shù)值最大；綜合以上說明距離土壤表面15 cm施用磷肥的S2處理最有利于提高低溫脅迫下紫花苜蓿氮代謝關鍵酶活性和增加其氮積累，降低相對電導率，增強苜?？购浴Ｒ虼私ㄗh于距離土壤表面15 cm處施用磷肥，促進苜蓿安全越冬。