李茜童，張文德，楊亞賢，錢秀娟

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院 / 甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實驗室, 甘肅 蘭州 730070）

線蟲是一類種類龐大的物種，在自然界中僅次于昆蟲。線蟲與昆蟲之間存在普遍而廣泛的的聯(lián)系，其中少數(shù)線蟲因?qū)ハx具有較強的侵染致死力被稱為昆蟲病原線蟲 (entomopathogenic nematodes，EPNs)，通常與其攜帶的共生細菌一同引起寄主昆蟲死亡[1]，是一類帶有共生菌的專性寄生線蟲[2]。

共生細菌存在于侵染期線蟲腸道內(nèi)，該線蟲進入寄主昆蟲血腔并在其中繁殖時，寄主昆蟲體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)被分解，共生菌被釋放，大量的共生菌繁殖產(chǎn)生毒素使寄主昆蟲敗血死亡。共生菌的大量繁殖在這一過程中起到兩個作用，一是產(chǎn)生抑菌物質(zhì)(如抗生素)以抑制其他微生物的生長，為線蟲提供適宜的生長環(huán)境；二是降解其他物質(zhì)為線蟲提供營養(yǎng)[3-4]。線蟲與細菌共生關(guān)系的研究主要集中在攜帶共生菌的斯氏線蟲屬(Steinernema)與異小桿線蟲屬(Heterorhabditis)等昆蟲病原線蟲上[2,5]，其具有寄主范圍廣泛，致死速度快，寄生殺蟲效果可觀，對脊椎動物、植物、人類無害，且對環(huán)境安全、無有毒殘留物，植物不易產(chǎn)生抗藥性等特點[6]。此外，線蟲在土壤中的生存能力和擴散能力強，對害蟲(尤其是對土棲性和鉆蛀性害蟲有替代化學(xué)藥劑的潛能)具有主動搜尋能力[7-10]，其侵染期幼蟲[11]能存活1 到多個月，可進行產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)[1,12]生產(chǎn)和銷售，并廣泛應(yīng)用于害蟲的生物防治領(lǐng)域[13]。

近年來，由于草原退化導(dǎo)致的草地病、蟲、鼠害愈發(fā)猖獗，進而引起生態(tài)惡化、牧草產(chǎn)量和品質(zhì)降低，以及生物多樣性減少等問題[14]?；瘜W(xué)農(nóng)藥治理見效快卻有很大毒性，且殘留量高，雖然根據(jù)我國目前所提倡“預(yù)防為主，綜合治理”的方針，已將昆蟲病原線蟲應(yīng)用于防治多種農(nóng)林、花卉以及衛(wèi)生害蟲，并且取得了令人鼓舞的成果[1]，但在草地害蟲防治方面仍有巨大進步空間。單菌病原線蟲在產(chǎn)業(yè)和科學(xué)研究中具有重要作用。研究表明，細菌和線蟲的共生關(guān)系是具有一定程度?；缘模匆环N線蟲只能同一種細菌共生。因此，單菌線蟲的培養(yǎng)獲得尤為重要。研究制備只攜帶專化性共生菌的昆蟲病原線蟲的方法不僅能夠明確昆蟲病原線蟲與其共生菌的關(guān)系，也有利于侵染期幼蟲的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)制備，并提高昆蟲病原線蟲對草地害蟲的防治效果[15]。

本研究以從甘肅省分離誘集得到的抗低濕脅迫能力較強的卡森斯氏線蟲(Steinernema kraussei)和非耐旱性短尾異小桿線(Heterorhabditis brevicaudis)兩種昆蟲病原線蟲為研究材料，分離其攜帶的共生菌，并采用直接從大蠟螟(Galleria mellonella)體內(nèi)分離種子懷卵成蟲至純化好的?；怨采戏跤龁尉€蟲的簡易方法，以期快速準確獲得高防效的侵染期幼蟲，為昆蟲病原異小桿屬和斯氏屬線蟲的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，為高效防除害蟲提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

大蠟螟3 齡幼蟲由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護/甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實驗室保存。

1.2 供試線蟲

抗低濕脅迫能力較強的卡森斯氏線蟲0657L 和非耐旱性短尾異小桿線蟲0641TY 均由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院昆蟲生態(tài)實驗室/甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實驗室保存。

1.3 培養(yǎng)基的配制

NBTB 培養(yǎng)基：瓊脂15 g，LB 瓊脂預(yù)混干粉40 g，溴百里酚藍0.01 g，無菌水1 000 mL，搖勻。配置好培養(yǎng)液，于121 ℃，1 240 Pa 滅菌20 min，倒平板培養(yǎng)基保存?zhèn)溆谩?/p>

LB 培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉湯8 g，瓊脂15 g，酵母粉5 g，六水合氯化鎂(MgCl2·H2O) 12 g，蒸餾水900 mL，搖勻。配置好培養(yǎng)液，于121 ℃，1 240 Pa 滅菌20 min。玉米糖漿7 mL，玉米胚芽油4 mL，蒸餾水89 mL，混合均勻，加入已滅菌的培養(yǎng)液中，置于平板培養(yǎng)基保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 共生菌的分離

在兩個直徑為9 cm 的培養(yǎng)皿內(nèi)鋪墊兩層無菌濾紙，將經(jīng)過75%酒精進行體表消毒的3 齡大蠟螟(大小、生理活性基本一致)各5 頭置于其中，用移液槍分別吸取1.5 mL 密度為3.84 頭·μL-1的卡森斯氏線蟲和密度為2.82 頭·μL-1的短尾異小桿線蟲懸浮液滴至大蠟螟頭部附近體壁上，在20～25 ℃培養(yǎng)箱中放置24 h。

在超凈工作臺上，用75%酒精消毒的小剪刀將經(jīng)過線蟲侵染的大蠟螟第1 對胸足剪破，用拇指和食指從蟲體尾部向前按壓，使大蠟螟的體液從第1 對胸足傷口處流出，滴加在NBTB 平板培養(yǎng)基上。接菌環(huán)在酒精燈下滅菌，蘸取大蠟螟體液，劃Z 字型分離共生菌。用封口膜密封培養(yǎng)基，置于20 ～25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。侵染24、28、32、36、40 h 各分離一次，每次分離3 皿，培養(yǎng)后比較菌落生長情況。

1.5 共生菌的純化

卡森斯氏線蟲和短尾異小桿線蟲共生菌分別培養(yǎng)至出現(xiàn)易于挑取的單菌落，無菌條件下每8 h 挑取綠色單菌落一次，轉(zhuǎn)移至新的NBTB 平板培養(yǎng)基上，繼續(xù)劃線進行共生菌的二次純化，以此重復(fù)，直到培養(yǎng)純化出均勻的單菌落。挑取純化的初生型單菌落轉(zhuǎn)移至LB 平板培養(yǎng)基，在20 ～ 25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h 后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 單菌線蟲的制備

在兩個直徑為9 cm 的培養(yǎng)皿內(nèi)鋪墊兩層無菌濾紙，將經(jīng)過75%酒精消毒的3 齡大蠟螟各5 頭置于其中，用移液槍分別吸取1.5 mL 密度為3.84 頭·μL-1的卡森斯氏線蟲和密度為2.82 頭·μL-1的短尾異小桿線蟲懸浮液侵染大蠟螟。侵染7 d 后，在顯微鏡下用酒精燈滅過菌的昆蟲針解剖侵染至死的大蠟螟，觀察并分別挑取大蠟螟體內(nèi)的卡森斯氏線蟲和短尾異小桿線蟲懷卵成蟲各1 頭，接到長好共生菌的LB 平板培養(yǎng)基上，用封口膜密封培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每24 h 觀察一次幼蟲發(fā)育情況，連續(xù)觀察2 周。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

觀察侵染不同時間的大蠟螟體內(nèi)初次分離的共生菌在NBTB 上培養(yǎng)出單菌落的情況。

記錄懷卵成蟲在培養(yǎng)有共生菌的LB 培養(yǎng)基上的存活情況，獲得侵染期幼蟲(即3 齡幼蟲)所需最短時間和全部幼蟲形成侵染期幼蟲的時間。

2 結(jié)果與分析

2.1 共生菌的分離及純化

觀察比較兩個品系線蟲懸浮液接種大蠟螟24、28、32、36 以及40 h 后，從其體內(nèi)分離出來的共生菌的生長情況。

2.1.1 卡森斯氏線蟲專化性共生菌

卡森斯氏線蟲侵染大蠟螟24 h 后分離獲得的共生菌更易在NBTB 培養(yǎng)基上培養(yǎng)出較為均勻生長的單菌落(圖1)，便于被二次純化。

在NBTB 培養(yǎng)基上，經(jīng)過純化的卡森斯氏線蟲共生菌呈墨綠色，菌株可以吸收培養(yǎng)基中的溴百里酚藍，周圍培養(yǎng)基也呈現(xiàn)出藍色，菌株大，邊緣整齊規(guī)則，表面凸起有光澤(圖2)；在LB 培養(yǎng)基上，菌株呈現(xiàn)棕黃色。經(jīng)在黑暗條件下觀察有生物熒光，為發(fā)光桿菌屬。

圖2 卡森斯氏線蟲共生菌在NBTB 培養(yǎng)基上的菌株形態(tài)Figure 2 Morph of the symbiotic bacteria of Steinernema kraussei on NBTB

2.1.2 短尾異小桿線蟲?；怨采?/p>

從短尾異小桿線蟲侵染大蠟螟28 h 分離獲得的共生菌在NBTB 培養(yǎng)基上生長最佳(圖3)，有較均勻單菌落，便于二次純化。

圖3 短尾異小桿線蟲侵染大蠟螟28 h 分離的共生菌Figure 3 Symbiotic bacteria isolated from Galleria mellonella infected by Heterorhabditis brevicaudis for 28 hours

在NBTB 培養(yǎng)基上，經(jīng)過純化的短尾異小桿線蟲共生菌也呈墨綠色，菌株吸收培養(yǎng)基中的溴百里酚藍，但周圍的培養(yǎng)基呈明顯不規(guī)則黃色，菌株較小，邊緣稍不規(guī)則，表面較為扁平，中心有小突起(圖4)；在LB 培養(yǎng)基上，菌株也呈現(xiàn)棕黃色，經(jīng)在黑暗條件下觀察無生物熒光，為嗜線蟲桿菌屬。共生細菌種的鑒定，擬另文發(fā)表。

圖4 短尾異小桿線蟲共生菌在NBTB 培養(yǎng)基上的菌株形態(tài)Figure 4 Morph of the symbiotic bacteria of Heterorhabditis brevicaudis on NBTB

2.2 種子懷卵成蟲的培養(yǎng)及在LB 培養(yǎng)基上的培養(yǎng)

用線蟲懸浮液侵染大蠟螟24 h 后，大蠟螟患敗血癥死亡，開始膨脹，褪色。侵染1 周后，在解剖鏡下解剖大蠟螟，兩個品系線蟲懸浮液侵染的大蠟螟體內(nèi)均存在多數(shù)幼蟲及少數(shù)懷卵成蟲。分別將單頭懷卵成蟲挑取接種至 LB 培養(yǎng)基上恒溫培養(yǎng)觀察。

2.2.1 卡森斯氏線蟲

斯氏屬的種子懷卵成蟲繁殖較慢，在LB 培養(yǎng)基存活時間約為3 d，接入前兩天產(chǎn)出第二代，雖在解剖鏡下可明顯看到懷卵成蟲體內(nèi)的卵粒(圖5)，也可看到卵在母體內(nèi)孵化成幼蟲(圖6)，但并未觀察到體外有卵粒排出，第二代均以幼蟲形態(tài)鉆出懷卵成蟲體外。懷卵成蟲最短僅存活2 d，最長存活5 d 后死亡。

圖5 卡森斯氏線蟲懷卵成蟲體內(nèi)的卵粒Figure 5 Eggs in adult Steinernema kraussei

圖6 卡森斯氏線蟲懷卵成蟲體內(nèi)孵化的幼蟲Figure 6 Hatching juveniles in a gravid Steinernema kraussei female adult

2.2.2 短尾異小桿線蟲

異小桿屬的種子懷卵成蟲自接入LB 培養(yǎng)基上的存活時間約為3 d，接入后2～3 d 即產(chǎn)出下一代，繁殖速度相對較快，但下一代同樣是以幼蟲形態(tài)鉆出母體(圖7)。懷卵成蟲最短存活3 d，最長5 d 即死亡。

圖7 短尾異小桿線蟲幼蟲鉆出已死亡的母體Figure 7 Juveniles of Heterorhabditis brevicaudis emerging from the body of the dead female adult

2.3 侵染期幼蟲的形成

2.3.1 卡森斯氏線蟲

卡森斯氏線蟲侵染期幼蟲在LB 培養(yǎng)基中形成較快，最快需要2 d 時間即可觀察到侵染期幼蟲的形成。在觀察的2 周內(nèi)，可觀察到其2 齡幼蟲均可全部轉(zhuǎn)化成侵染期幼蟲，而且齡期整齊，全部轉(zhuǎn)化為侵染期幼蟲所需時間約為10 d (圖8)。

圖8 卡森斯氏線蟲侵染期幼蟲在LB 培養(yǎng)基上的形成過程Figure 8 Steinernema kraussei infective juveniles cultured on LB medium

2.3.2 異小桿線蟲

異小桿線蟲侵染期幼蟲在LB 培養(yǎng)基中較慢形成，最長需要4 d 才可觀察到侵染期幼蟲的形成。在觀察的2 周內(nèi)，可觀察到卡森斯氏線蟲2 齡幼蟲均可全部轉(zhuǎn)化成齡期整齊的侵染期幼蟲，全部轉(zhuǎn)化為侵染期幼蟲所需時間為15 d (圖9)。

圖9 異小桿線蟲侵染期幼蟲在LB 培養(yǎng)基上的形成過程Figure 9 Heterorhabditis brevicaudis infective juveniles cultured on LB medium

3 討論與結(jié)論

本研究選用了卡森斯氏線蟲和短尾異小桿線兩個品系的線蟲侵染大蠟螟，分別于接種24、28、32、36 以及40 h 大蠟螟體內(nèi)分離其共生菌，并純化成具有?；缘膯尉^察菌株生長情況，以及單菌下侵染期幼蟲誘導(dǎo)形成的情況。結(jié)果表明，卡森斯氏線蟲共生菌分離的最佳時間為接種24 h，而短尾異小桿線蟲共生菌分離的最佳時間為接種28 h。結(jié)合分析培養(yǎng)過程中菌株的形態(tài)特征和分離、純化、培養(yǎng)所需時間的差異，有力地證明了線蟲與細菌的一一對應(yīng)關(guān)系，即不同品系的線蟲其腸道內(nèi)共生菌的種類也是不同的。加之單菌培養(yǎng)制備線蟲通氣性好、產(chǎn)量高、生產(chǎn)效率高[15]，因而可以推斷這種?；阅軌蜉^好的保證昆蟲病原斯氏屬和異小桿屬線蟲的生活力、生殖力和致病力。

此外，斯氏線蟲屬和異小桿線蟲屬共生細菌均具有兩型現(xiàn)象，通稱共生細菌菌型的初生型與次生菌。在線蟲大量培養(yǎng)中，培養(yǎng)基必須接入初生型共生菌。初生型能把培養(yǎng)基中的一系列物質(zhì)轉(zhuǎn)化為適宜于線蟲生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)，而次生型則不能[16]，因此，線蟲只吸收并保留初生型共生菌[17]。

雖然在LB 培養(yǎng)基中共生細菌不能大量生長[1]，但接入異小桿屬和斯氏屬兩個不同品系的懷卵成蟲均能存活，將懷卵成蟲接入LB 培養(yǎng)基后，均能在較短時間內(nèi)產(chǎn)出下一代幼蟲。同時，可以清楚地觀察到懷卵成蟲體內(nèi)的卵，有些也可以觀察到卵在母體內(nèi)孵化成幼蟲，但并未觀察到卵被排出體外，而是以幼蟲鉆出母體，即卵可以在母體內(nèi)孵化，這種現(xiàn)象叫噬母現(xiàn)象[3]，是指卵在種子懷卵成蟲體內(nèi)孵化，幼蟲靠母體的營養(yǎng)物質(zhì)存活，當(dāng)母體營養(yǎng)物質(zhì)被消耗完后鉆出母體。這些幼蟲大多為2 齡幼蟲，或者2 齡幼蟲至侵染期幼蟲的過渡蟲態(tài)，2 齡幼蟲及過渡蟲態(tài)在LB 培養(yǎng)基上存活并發(fā)育形成侵染期幼蟲。由于LB 培養(yǎng)基上的菌落接種采用了Z 字形劃線法，線蟲會順著菌落層層擴散分布，使得培養(yǎng)獲得的侵染期幼蟲齡期整齊。

綜上所述，本研究中單菌線蟲的制備利用了昆蟲病原線蟲與細菌共生關(guān)系的?；裕ㄟ^使用兩個不同品系線蟲的懷卵成蟲，篩選到一種直接從大蠟螟體內(nèi)分離懷卵成蟲至純化好的共生菌上孵育線蟲，以快速準確獲得整齊齡期的侵染期幼蟲的簡便方法，彌補了顏珣和韓日疇[1]研究的以不同的孵育液孵育小卷蛾斯氏線蟲(S.carpocapsae)的懷卵成蟲，找到可以簡單快速從懷卵成蟲直接獲得整齊齡期的侵染期幼蟲的方法中營養(yǎng)成分介于純水和Ringer’s液中的生理鹽水及PBS 中，無法誘導(dǎo)獲得全部的侵染期幼蟲的不足；明確了昆蟲病原線蟲與其共生菌的一一對應(yīng)關(guān)系；為這兩種品系線蟲侵染期致病力的研究以及在草地害蟲安全防治中的商業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支持；為產(chǎn)品的低成本生產(chǎn)、貯存技術(shù)、質(zhì)量控制程序[18-19]，為更多植物病蟲害尋找新的防治途徑[20]打下基礎(chǔ)。為證實單菌線蟲制備方法的意義，本研究也將在后續(xù)進行單菌線蟲致病力測定。