陸 倩，魏 巖，安忻蕾，閆紫煙

（新疆農業(yè)大學草業(yè)學院, 新疆 烏魯木齊 830052）

植物果實(種子)的二型性(seed dimorphism)或多型性(seed polymorphism)就是指在同一株植物上結出兩種或多種類型的形態(tài)結構、生理特性等方面存在明顯差異的種子的現象，是植物母體遺傳特性與環(huán)境因素改變共同作用的結果[1]。具有二型性或多型性種子植物的出現，意味著植物在萌發(fā)和休眠反應及其他生殖策略上會產生差異，大大地提高了植物在干旱、鹽堿地區(qū)和擾動強烈地區(qū)的生存能力[2]。

紫花地丁(Viola philippica)是堇菜科(Violaceae)堇菜屬的多年生植物，同一個植株在不同時期會出現兩種形態(tài)完全不同的花——開放花(chasmogamous,CH)與閉鎖花(cleistogamous, CL)[3-6]，因此能形成二型性種子即CH 種子和CL 種子[7-8]。CH 在早春時期(4 月中到4 月中下旬)開花，花期較短，顏色艷麗呈紫色，觀賞價值高；CL 在5 月初到9 月初開花，無花瓣，花期較長，持續(xù)開花，持續(xù)結實，是極好的園林綠化植物[8-10]。由于其具有持續(xù)結實、持續(xù)散布種子的特性，會造成種子損失，給種子生產帶來困難，必須分批分期進行果實采集，以獲取種子。目前關于紫花地丁二型性的研究集中在花部結構性狀、授粉機制[10]、繁殖對策、繁殖特征[7]和萌發(fā)行為[11-12]上。研究表明紫花地丁新成熟的兩種類型種子均具有較高的萌發(fā)率[11]，且不同成熟度種子的萌發(fā)率不同[12]。關于紫花地丁兩種類型果實的發(fā)育進程以及不同成熟度種子的形態(tài)與萌發(fā)特性是否存在差異尚未見報道。

本研究通過觀察紫花地丁CH 果實和CL 果實的發(fā)育進程，比較兩種類型不同成熟度種子的形態(tài)特征與萌發(fā)特性，弄清果實形態(tài)與種子活力的對應關系，為紫花地丁種子確定最佳采摘時期，防止和減少果實開裂造成種子損失提供科學依據。

1 研究材料與方法

1.1 研究材料與樣地

無蟲害且發(fā)育良好的CH 和CL 紫花地丁果實分別在2020 年5 月初與6 月初采收于準噶爾盆地南緣(43°80′ N，87°56′ E，830 m)，該地區(qū)屬中溫帶荒漠區(qū)，屬中溫帶大陸性干旱氣候[13]，該地5 月日均最高氣溫24 ℃，日均最低氣溫13 ℃。6 月份溫度上升，日均最高氣溫29 ℃，日均最低氣溫19 ℃ (圖1)。本研究所用氣象資料來源于烏魯木齊氣象局2020年氣象資料。

圖1 烏魯木齊5 月和6 月氣溫日變化Figure 1 Urumqi's daily temperature change in May and June

1.2 研究方法

1.2.1 果實不同發(fā)育時期與種子形態(tài)

隨機選取20 株紫花地丁，分別在每個月月初采用掛牌法對同一天開花狀態(tài)一致的花進行標記。在花期后進入果期時觀測果實發(fā)育進程，每天觀測一次，果熟期每天觀測3 次，直至果實成熟(果實完全直立開裂種子尚未彈出)。記錄不同成熟度果實的發(fā)育時間并收集果實和種子。

隨機選取收集果期不同成熟度的果實和種子各20 粒，設3 次重復。觀察其顏色、形狀，用游標卡尺測量果柄長度、果實和種子的長度(底部到尖端的長度)和寬度(最寬位置的長度)，測量值精確到0.01 mm，用萬分之一電子天平測種子的鮮重和干重，計算含水量。

測定鮮重及干重：將種子剝出，以1 000 粒為一組設4 次重復，稱量CH 與CL 不同成熟度種子的重量(鮮重)，自然風干15 d 后測定千粒重(干重)，計算種子含水量[11]。

1.2.2 種子萌發(fā)與活力

在25 ℃/35 ℃適宜條件下進行光照處理(黑暗12 h/光照12 h)[14]，選取不同成熟度的紫花地丁CH種子和CL 種子各100 粒，將25 粒種子置于鋪有2 張濾紙的培養(yǎng)皿(9 cm)中，4 組重復做相同處理。每24 h 觀測一次并記錄種子萌發(fā)數，以連續(xù)5 d 沒有種子萌發(fā)視為萌發(fā)結束。種子萌發(fā)試驗完成后，計算萌發(fā)率、萌發(fā)指數、活力指數。

萌發(fā)率＝(發(fā)芽種子數/供試種子總數) × 100% ；

式中：Gt為在第t天的種子發(fā)芽數，Dt為相對應的種子發(fā)芽天數。

式中：S為苗長，苗長為試驗時間內供試種子的根長+芽長。

1.2.3 數據統(tǒng)計與分析

使用SPSS 20.0 軟件對樣本數據進行分析，用單因素(one-way ANOVA)和雙因素(two-way ANOVA)方差分析驗證不同成熟期紫花地丁果實和種子的差異性，顯著性水平的判斷依據P＜ 0.05。采用GraphPad Prism 6.01 軟件繪制圖表。

2 結果分析

2.1 不同發(fā)育階段果實和種子的形態(tài)特征變化

CH 果實的發(fā)育時間長于CL 果實，但果實的發(fā)育階段形態(tài)特征相似(表1)，根據不同發(fā)育階段紫花地丁CH 和CL 果實與種子的形態(tài)變化，將果實未豎起緊貼果柄呈0°，果實顏色為淺綠色，剝開果皮種子呈白色透明狀或乳白色的狀態(tài)記為Ⅰ期；果實豎起與果柄呈60°，種子呈淡黃色記為Ⅱ期；果實與果柄呈大于60°但未垂直，種子呈黃色記為Ⅲ期；果實與果柄垂直，種子呈棕黃色記為Ⅳ期，在Ⅱ～Ⅳ期果實顏色均為翠綠色；果實豎起未完全直立與果柄呈120°，果實顏色由綠變黃，種子呈淺褐色記為Ⅴ期；果實與果枝呈150°，種子呈褐色記為Ⅵ期；果實直立但未開裂與果柄呈180°，此時果實表皮為灰白色，種子呈黑色記為Ⅶ期；果實直立且剛開裂，但種子尚未彈出此時種子呈黑色記為Ⅷ期，共8 個時期。

CH 和CL 果實成熟度、果實和種子的顏色及種子形態(tài)的變化趨勢基本一致(表1)。隨著發(fā)育時間的延長，兩種類型果實的果皮顏色由深變淺，種子顏色由淺變深(圖2)。對不同成熟兩種類型紫花地丁果實種子的形態(tài)測定發(fā)現，CH 和CL 果實和種子的長寬隨著發(fā)育時間的延長呈上升趨勢且在各時期CH 果實和種子的長寬都比CL 果實和種子大(圖3)。CH 和CL 果實的長度和寬度分別為8.0～9.5 mm，7.5～9.0 mm；4.5～6.0 mm，4.0～5.5 mm，均在果實即將開裂前(Ⅶ 期)達最大值分別為9.42、8.98、5.84 和5.42 mm；CH 和CL 種子的長度和寬度變化范圍均在1.8～2.0 和1.0～1.25 mm，在各時期種子長度和寬度略有增加但差異不顯著(P＞ 0.05)(圖3)。

圖2 紫花地丁不同成熟度果實及種子形態(tài)Figure 2 Fruit and seed morphology of Viola philippica at different maturation stages

圖3 紫花地丁CH 和CL 不同成熟度果實及種子的發(fā)育特性Figure 3 Developmental characteristics of fruits and seeds of Viola philippica CH and CL at different maturation stages

表1 紫花地丁發(fā)育過程中果實與種子顏色及形態(tài)變化Table 1 Changes in fruit and seed color and morphology during the development of Viola philippica

2.2 果實的發(fā)育進程

2.2.1 CH 果實的發(fā)育進程

CH 花期在4 月中到4 月中下旬，幼果經過24～29 d 發(fā)育成熟開裂。于2020 年5 月1 日開始觀察CH 果實發(fā)育進程，此時蒴果完全彎曲緊貼果枝，5 月6 日蒴果豎起且與果柄間夾角約呈60°；5 月8 日至9 日與果柄間角度變大，5 月9 日至15 日期間夾角呈垂直狀態(tài)；5 月16 日至18 日約呈120° (表1)；5 月19 日到20 日約呈150°；5 月20 日到23 日蒴果直立；5 月24 日至29 日時蒴果陸續(xù)開裂，種子彈出。

2.2.2 CL 果實的發(fā)育進程

CL 花期從5 月初到9 月初。本試驗對6 月CL果實發(fā)育進程進行觀測，發(fā)現花后經過16 d 幼果發(fā)育成熟開裂，此后果實持續(xù)開裂。2020 年6 月6 日蒴果完全彎曲緊貼果柄；6 月10 日蒴果豎起與果柄間夾角約呈60°；之后果實與果柄的角度變大，6 月15 日果實與果柄垂直；6 月16 日至19 日約呈120°；6 月21 日時約呈150°；6 月22 日早上10 時觀測蒴果直立；當天下午7 時時蒴果陸續(xù)開裂，種子彈出。

2.3 不同成熟度種子千粒重及含水量

隨著紫花地丁種子的發(fā)育，CH 種子CL 種子在Ⅰ～Ⅲ粒重顯著增加(P＜ 0.05)，Ⅳ期后千粒重趨于穩(wěn)定差異不顯著(P＞ 0.05)。且兩種類型種子千粒重均在完全成熟時(Ⅷ期)達到最高，分別為1.16 和1.13 g(圖4)。

兩種類型種子的含水量隨種子發(fā)育時間的延長均呈現顯著降低的趨勢(P＜ 0.05)。當種子完全成熟時(Ⅷ期)，CH 和CL 種子含水量均達到最低值分別為9.18%和4.10%，且CH 種子含水量高于CL 種子(圖4)。

圖4 不同成熟度紫花地丁CH 與CL 種子的千粒重和含水量Figure 4 Thousand grain weight and water content of different maturation stages of CH and CL seeds of Viola philippica

2.4 不同成熟度CH 種子和CL 種子的萌發(fā)特性

隨著種子的發(fā)育，萌發(fā)率逐漸提高，Ⅳ期之后，萌發(fā)率超過80%。CH 種子在Ⅴ期時萌發(fā)率最高達95%，CL 種子到Ⅷ期萌發(fā)率最高達96% (圖5)。在成熟度較低情況下(Ⅳ期以前)，兩種種子的萌發(fā)指數顯著提高(P＜ 0.05)。CH 種子的萌發(fā)指數在Ⅴ 期時達到最高(24.11)，是CL 種子萌發(fā)指數(15.58)的1.55 倍；CL 種子的萌發(fā)指數在Ⅷ 期時達到最高(21.95) (圖5)。CH 種子的活力指數整體呈現先增加再降低的趨勢，而CL 種子的活力指數整體呈現先增加再降低之后再增加的趨勢(圖5)。兩種種子均在Ⅳ期達最高分別為607.20 和635.46，此后保持較高水平(400.00～550.00)。在Ⅱ期～Ⅶ期CH 種子的萌發(fā)率和萌發(fā)指數均高于CL 種子；在Ⅰ期～Ⅳ期和種子完全成熟時(Ⅷ期) CH 種子的活力指數均低于CL 種子(圖5)。

圖5 不同成熟度對紫花地丁CH 和CL 種子萌發(fā)的影響Figure 5 Effect of different maturation stages on the germination of Viola philippica CH and CL seeds

3 討論

紫花地丁同一植株上既可形成CH，也能形成CL，這使得植株可產生二型性果實(種子)，CH 果實和CL 果實雖然在顏色、形狀、果實與果柄的夾角等發(fā)育階段特征相似，但發(fā)育進程時間不同，種子成熟時間也不同，CH 果實成熟時間較CL 果實成熟時間早，而CL 果實發(fā)育進程時間明顯短于CH 果實，由于6 月溫度明顯高于5 月溫度，所以兩種類型果實發(fā)育進程時間和種子成熟時間的差異可能與溫度有較大關系。CH 與CL 交配系統(tǒng)的不同也可能是導致差異的原因。

根據種子的成熟指標、形態(tài)結構以及生理特征的關聯性，在適當的時間采收種子，對提高種子產量和品質極為重要[15]。果實和種子的顏色不僅是種子成熟程度的表型指標，也可作為確定種子適宜收獲時間的最直觀指標[16-18]。一些果實和種子在發(fā)育過程中顏色會發(fā)生規(guī)律性變化。廣布野豌豆(Vicia cracca)莢果從盛花后9 d 開始分別由淺綠色變?yōu)榫G色、棕綠色、棕色，最終變?yōu)闇\棕色，種子則由綠色、黑綠色最終變?yōu)楹谏玔19]；杭芍(Paeonia lactiflora)果實在成熟過程中果皮由白綠色轉至淺綠再變?yōu)辄S綠色，最后果皮出現褐色斑塊，種子顏色由黃色變?yōu)槊S色、橘黃色變?yōu)辄S褐色，最終變?yōu)楹诤稚玔20]；羊草種子 (Leymus chinensis) 在發(fā)育期間，稃與種子的顏色也均隨著種子成熟度的提高而不斷的變化[17]。本研究中紫花地丁隨著果實的發(fā)育，果實與果柄間夾角不斷增大，果皮和種子顏色也隨成熟度的增加而呈規(guī)律性變化。在幼果時期(Ⅰ)為淺綠色，種子為乳白色；果實剛成熟時呈翠綠色(Ⅱ - Ⅳ)，種子顏色變深；果實成熟時呈灰白色(Ⅴ - Ⅷ)，種子最終變?yōu)楹谏?/p>

千粒重能直接反映出種子積累干物質的程度，通常千粒重越大，種子品質越好[17-21]。因此千粒重大、品質高的CH 種子能為物種的生存和更新提供條件[22]。隨著種子的不斷成熟，紫花地丁在Ⅳ期之后CH 和CL 種子千粒重和含水量基本穩(wěn)定，在Ⅷ期時千粒重達到最大，此時含水量對應最小，說明此時種子干物質的積累達到最大，成熟度最高。

種子的成熟度影響種子萌發(fā)率、萌發(fā)勢、活力，甚至幼苗生長等綜合指標[23]。種子萌發(fā)特性與采收時間和氣候條件等密切相關。郝楠等[24]發(fā)現，采收時間可能會影響種子的成熟度，進而影響種子的萌發(fā)水平。因此，可以通過種子成熟時種子萌發(fā)指標的變化來確定合適的收獲時間。隨著成熟度的增加，羊草種子的萌發(fā)率基本呈現出先增加后降低的趨勢，在盛花期后33 d 基本達到最高值[25]；伴隨扁穗雀麥(Bromus cartharticus)種子的發(fā)育，其內在干物質積累存在漸進過程，在盛花后32～36 d 時“江夏”扁穗雀麥種子萌發(fā)率、萌發(fā)勢、萌發(fā)指數和活力指數均達最高，“黔南”范圍較之稍寬，為花后32～42 d[26]。本研究中在Ⅱ期～Ⅶ期的CH 種子的萌發(fā)率和萌發(fā)指數均高于CL 種子，此結果與蘇雪等[11]、孫慧芳等[14]對紫花地丁CH 和CL 種子萌發(fā)特性的研究結果一致，同屬于堇菜屬的維西堇菜 (Viola monbeigii)也表現出CH 種子萌發(fā)率高于CL 種子萌發(fā)率的現象[27]。雖然紫花地丁產生的CH 種子總量少，但因其具備更高的萌發(fā)率，能產生遺傳多樣性豐富的種子，因此具有較高適合性，能更好的適應環(huán)境[28]。種子的成熟度與種子活力密切相關，王利等[29]通過對5 個常規(guī)粳稻品種的種子質量進行研究，結果顯示種子的萌芽率和活力隨成熟度的增加而升高，后隨發(fā)育時間的延長，種子會因環(huán)境條件的影響發(fā)生劣變和老化，導致萌芽率和活力出現極顯著水平降低。周海寧[30]通過對不同雜交玉米(Zea mays)的研究結果表明，玉米種子的萌芽率、萌芽勢、萌芽指數和活力指數等與種子活力密切相關的指標均隨著成熟度的增加逐漸升高并趨于穩(wěn)定，且不同成熟度種子間的活力差異顯著。隨著種子生長發(fā)育時期的不斷延長，種子活力達到最大值后，又隨著采收過遲而呈現下降趨勢[31-32]。因此種子活力是隨著種子成熟度的增加而增加，過早收獲會導致活力低，但成熟度越高，種子活力也并非越高[33]。本研究中兩種種子的萌發(fā)率、萌發(fā)指數和活力指數達最高值后隨發(fā)育時間的繼續(xù)延長，也出現下降趨勢但萌發(fā)指標仍能達到較高水平。

4 結論

根據果實不同發(fā)育階段的形態(tài)特征將紫花地丁果實(種子)劃分為8 個時期。從Ⅳ期之后果皮顏色由深變淺，由翠綠變灰白，果實內種子顏色由淺變深，由深黃變黑。果實成熟后果皮開裂，兩種類型種子的散布均為遠距離彈力散布，利于種群擴建但不利于種子收獲，應提前收獲。紫花地丁CH 果實的發(fā)育時間長于CL 果實，其果實的大小，果柄長及種子的大小、千粒重，含水量均大于CL 果實及種子。CH種子的萌發(fā)率和萌發(fā)指數均高于CL 種子。隨著果實的發(fā)育，兩種類型種子的千粒重呈先顯著上升后穩(wěn)定的趨勢，在Ⅳ期后種子萌發(fā)率、萌發(fā)指數和活力指數達最高值后有下降趨勢，但仍能達相對較高水平。在生產上，Ⅳ期之后，果實與果柄間夾角大于90°，果實顏色發(fā)黃或呈灰白色時，都可進行采收。