郭賀峰，何 悅，殷庭超，蔡 冬，劉信寶，張 敬，徐 彬

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院, 江蘇 南京 210095；2.福建傲農(nóng)生物科技集團(tuán)股份有限公司, 福建 漳州363000；3.福建省生豬營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 漳州 363000）

牛至(Origanum vulgare)是唇形科牛至屬多年生草本或半灌木植物，也被稱為止痢草、牛膝草、馬郁蘭、小葉薄荷等，是典型的多年生芳香植物。其分布范圍廣泛，原產(chǎn)于歐亞大陸及部分非洲地區(qū)，我國(guó)大部分省區(qū)皆有野生牛至分布[1]。牛至又可被分為6 個(gè)亞種，其中希臘牛至(O.vulgaressp.hirtum)香味濃郁、精油含量高、抑菌效果好，被廣為栽培應(yīng)用[2]。牛至用途多樣，全草皆可入藥，是一味傳統(tǒng)的中草藥，對(duì)急性腸胃炎、腹瀉等癥具有很好的療效[3]；牛至香辛味濃郁，能夠改良食物風(fēng)味，因此在西班牙、墨西哥、希臘等國(guó)被當(dāng)作香料長(zhǎng)期使用[4]；牛至花期長(zhǎng)、花型優(yōu)美、花色艷麗，既可用于觀賞，還是一種很好的蜜源植物；此外，牛至花、葉可提取芳香精油，具有較強(qiáng)的抑菌和抗氧化作用[5-7]，因此還被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物飼料添加劑，能夠保護(hù)動(dòng)物腸道健康，改善肉產(chǎn)品品質(zhì)，提高生長(zhǎng)性能，降低死亡率，減少疾病，提高飼料利用率等[8-15]。近年來(lái)，牛至干草和牛至精油的需求量逐年增加，現(xiàn)有野生牛至資源已不能滿足生產(chǎn)需求；另一方面，牛至干草價(jià)格較高，限制了其在飼料添加劑中的生產(chǎn)應(yīng)用。培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)牛至新品種是解決牛至供需矛盾與應(yīng)用瓶頸的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。

輻射誘變是一種快速培育新品種的方法，具有突變頻率高、變異范圍廣、后代性狀穩(wěn)定快、育種年限短等優(yōu)點(diǎn)[16]。牛至種子極小，千粒重僅0.1 g，可能對(duì)輻射誘變敏感，是誘變育種的理想材料。另外，牛至可以通過(guò)扦插或組培等方式擴(kuò)繁[17]，因此牛至突變體單株能夠通過(guò)營(yíng)養(yǎng)體擴(kuò)繁保留具有特殊變異性狀。

本研究以南京農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院前期篩得到的希臘牛至為材料，利用60Co-γ 射線作為輻射源處理希臘牛至種子，旨在找出適宜牛至種子的輻照劑量，獲得牛至突變體種質(zhì)資源庫(kù)，篩選出具有優(yōu)異變異表型的突變體，為牛至誘變系品種改良和選育提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)

本研究在南京航空航天大學(xué)輻照中心進(jìn)行輻照處理，輻射源為60Co-γ 射線源，裝源量為200 萬(wàn)Ci。在全自動(dòng)化玻璃溫室內(nèi)育苗，溫室內(nèi)的晝夜溫度28 ℃/23 ℃，實(shí)際溫度為設(shè)定溫度的 ± 5 ℃，空氣濕度保持在25%～42%。幼苗移栽定植到南京農(nóng)業(yè)大學(xué)白馬教學(xué)科研基地的試驗(yàn)田 (119°18′71.96″ E，31°62′0.06″ N)。試驗(yàn)田土壤質(zhì)地為黏壤土，容重為1.27 g·cm-3，比重為2.52 g·cm-3，土壤總孔隙度為49.53%，pH 7.45，EC 值為53.21 μS·cm-1，有機(jī)質(zhì)含量為0.82%。

1.2 試驗(yàn)材料

母本種子材料采自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院篩選的希臘牛至株系，母本植株的葉片精油含量4.2%，花的精油含量5.3%，全株(包括莖、葉和花)精油含量3.2%。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 輻照處理

共設(shè)置6 個(gè)60Co-γ 射線輻照劑量梯度，分別為0、100、200、400、800 和1 600 Gy，劑量率為1.61 Gy·min-1，每個(gè)劑量處理置于塑料自封袋中的2 g 種子(約2 萬(wàn)粒)，以未經(jīng)輻照的種子作為對(duì)照(CK)。

1.3.2 發(fā)芽試驗(yàn)

將輻照后的種子與未處理對(duì)照種子均勻擺放在鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿100 粒種子，每個(gè)劑量4 個(gè)重復(fù)，每天定時(shí)定量灑水以保持發(fā)芽所需濕度，每天記錄發(fā)芽數(shù)，并根據(jù)發(fā)芽數(shù)計(jì)算發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)。

發(fā)芽率 = 發(fā)芽數(shù)/每皿粒數(shù)×100%；

發(fā)芽勢(shì) = 5 d 內(nèi)發(fā)芽種子粒數(shù)/供試種子數(shù)×100%；

式中：Gt為發(fā)芽試驗(yàn)終期內(nèi)每日發(fā)芽數(shù)，Dt為發(fā)芽日數(shù)。

1.3.3 育苗移栽

種子用10 mg·L-1赤霉素溶液處理后[18]，在溫室育苗，育苗基質(zhì)采用丹麥品式托普泥炭土(pH 5.5～6.0，粒徑 ＜ 6 mm)，將泥炭土打濕后分裝于72 孔穴盤(pán)中；依據(jù)發(fā)芽率計(jì)算所用穴盤(pán)數(shù)與用種量，將種子與細(xì)蛭石混合，均勻播于穴盤(pán)內(nèi)，每天噴水保持基質(zhì)濕潤(rùn)。種子發(fā)芽10 d 后間苗，保持每穴1 株小苗。于2021 年3 月中旬，待幼苗生長(zhǎng)至8 cm 高時(shí)移栽大田，移栽前試驗(yàn)田提前挖好排水溝確保排水通暢并噴灑封閉型除草劑隔絕雜草，株行距均設(shè)置為30 cm。

1.3.4 突變體表型性狀測(cè)定

2021 年7 月 - 8 月，通過(guò)對(duì)田間突變表型的觀察，篩選出變異明顯的株系，測(cè)定對(duì)照株系和突變體的表觀性狀，包括株高、葉長(zhǎng)、葉寬、莖節(jié)長(zhǎng)度和分枝數(shù)。使用電子游標(biāo)卡尺測(cè)量植株頂端向下第3 節(jié)間已舒展葉片最寬和最長(zhǎng)處即葉長(zhǎng)、葉寬實(shí)際值。莖節(jié)長(zhǎng)度的測(cè)定使用電子游標(biāo)卡尺測(cè)量植株頂端向下第3 節(jié)節(jié)間長(zhǎng)度。除株高與分枝數(shù)測(cè)量外，其余各指標(biāo)均測(cè)量4 個(gè)分枝并取其均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與制圖，SPSS 13.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析比較數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 輻射對(duì)牛至種子發(fā)芽和成苗的影響

100 Gy 輻照劑量的60Co-γ 射線對(duì)牛至種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)均沒(méi)有顯著抑制作用(P＞0.05) (表1)，但更高的輻射劑量顯著抑制了牛至種子萌發(fā)(P＜ 0.05)，且隨輻射劑量的增大，抑制作用顯著增加，牛至種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)呈顯著降低的趨勢(shì)(P＜ 0.05)。輻照處理還推遲了牛至種子的發(fā)芽時(shí)間(圖1)，對(duì)照和100～200 Gy 輻射劑量處理的種子在第4～5 天時(shí)發(fā)芽最多，400～800 Gy 劑量處理的種子在第5～6 天時(shí)發(fā)芽最多，而1 600 Gy 劑量處理導(dǎo)致第7 天時(shí)才達(dá)到發(fā)芽高峰期。根據(jù)種子發(fā)芽情況，以發(fā)芽率為因變量(y)，輻射劑量為自變量(x)，得到發(fā)芽率與輻射劑量的線性回歸方程y= -0.000 6x+ 0.649 9，并將對(duì)照發(fā)芽率的一半(即37.6%)帶入方程，得到半致死輻射劑量LD50為539 Gy。

表1 輻照劑量對(duì)牛至種子發(fā)芽指標(biāo)的影響Table 1 Effects of irradiation dose on germination index of oregano seeds

圖1 60Co-γ 射線對(duì)牛至每天發(fā)芽數(shù)的影響和發(fā)芽率-輻射劑量回歸方程Figure 1 Effect of 60Co-γ rays on number of germinating oregano seeds and regression equation between germination rate and radiation dose

此外，輻照處理后牛至種子在萌發(fā)后胚根生長(zhǎng)受抑制，根系發(fā)育緩慢，導(dǎo)致萌發(fā)后幼苗在育苗基質(zhì)內(nèi)成活率低，幼苗早期生長(zhǎng)緩慢。與對(duì)照的田間成苗率(58.20%)相比，100 Gy 輻照劑量導(dǎo)致田間成苗率下降(39.00%)，200 Gy 劑量導(dǎo)致田間成苗率降至1.85%，更高劑量輻照處理的種子萌發(fā)后無(wú)法在育苗基質(zhì)中成活。

2.2 牛至突變體篩選

將輻射誘變后的牛至種子苗移栽至大田，共獲得8 170 株M1群體。將同一時(shí)期萌發(fā)、未經(jīng)輻射處理的1 000 株牛至作為對(duì)照，觀察、記錄對(duì)照群體和M1單株的表型特征，并扦插擴(kuò)繁M1群體內(nèi)具有明顯表型變異特征的單株。

對(duì)照株系的株高32～46 cm，分枝數(shù)18～34，葉片翠綠至深綠色，第3 節(jié)間長(zhǎng)8.9～10.4 mm，葉面積152～165 mm2(圖2)，傘房狀圓錐花序，多花密集，花白色。參考對(duì)照植株的表型特征，將具有明顯色澤變化或超過(guò)可量化指標(biāo)極值10%的株系作為M1代突變體，包括高桿和矮桿突變體型、多分枝和少分枝突變體、葉型(葉片大小和形狀)、葉色及花色突變體等(表2)。這些突變體在扦插擴(kuò)繁后仍能保持相應(yīng)變異特性，說(shuō)明變異特征與立地土壤或水肥條件無(wú)關(guān)，均為遺傳變異導(dǎo)致的突變性狀。

表2 輻射突變?nèi)后w的突變類(lèi)型及評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Mutant types and trait evaluation standard in the radiation mutagenized population

圖2 部分希臘牛至突變體的株高、分枝、葉面積和節(jié)間長(zhǎng)度Figure 2 Greek oregano mutants with typical variations of plant height, branching, leaf area, and internode length

株高變異體：根據(jù)1 000 株對(duì)照牛至的株高生長(zhǎng)范圍(32～46 cm)，將株高 ＞ 51 cm 或 ＜ 29 cm 的株系定為高桿或矮桿突變體。例如， F-19 株高達(dá)到59 cm，而F-11 株高僅17 cm，與對(duì)照株系株高均值(39 cm)差異明顯(圖2)。

莖節(jié)長(zhǎng)度突變體：短莖節(jié)突變體F-31 的平均莖節(jié)長(zhǎng)較對(duì)照縮短了40.3%，而長(zhǎng)莖節(jié)突變體F-34 較對(duì)照增長(zhǎng)了166.0% (圖2)。

分枝突變體：根據(jù)對(duì)照牛至的分枝數(shù)范圍(18～34 個(gè))，將分枝數(shù) ＞ 37 或 ＜ 16 的株系定為多分枝或少分枝突變體。例如，多分枝突變體F-57 的分枝數(shù)達(dá)到39 個(gè)，而少分枝突變體F-34 僅有9 個(gè)分枝，與對(duì)照株系分枝(21 個(gè))差異明顯(圖2)。

葉色變異體：在M1突變?nèi)后w中，還發(fā)現(xiàn)具有葉色黃化變異株系3 株，紅色變異株系1 株(圖3)。

圖3 典型葉色變異突變體Figure 3 Typical leaf color mutants

大葉及小葉突變體：在突變體群體中，還篩選到具有明顯葉片大小變化的突變體(圖4)。以自上而下第3 節(jié)間基部舒展葉為例，對(duì)照株系的葉面積為124.66 mm2，葉長(zhǎng)在10～23 mm，平均值為14.34 mm，葉寬在9～19 mm，平均值為11.07 mm；而大葉突變體F-19 的葉面積達(dá)到287.02 mm2，葉長(zhǎng)達(dá)到22.63 mm，葉寬達(dá)到16.13 mm；小葉突變體F-33 的葉面積僅77.24 mm2，葉長(zhǎng)僅10.10 mm，葉寬僅9.10 mm，與對(duì)照株系差異顯著(P＜ 0.05) (表3)。

表3 輻照處理導(dǎo)致牛至葉長(zhǎng)、葉寬、葉面積發(fā)生變化Table 3 Irradiation treatment causes changes in oregano leaf length, leaf width, and leaf surface area

圖4 典型葉片大小突變體Figure 4 Typical leaf size of the mutants

3 討論

60Co-γ 射線誘變是最安全高效的誘變技術(shù)之一，被廣泛應(yīng)用于植物的誘變育種中。例如，對(duì)水稻(Oryza sativa)品種‘圣稻15’進(jìn)行誘變并通過(guò)篩選和鑒定獲得93 份表型突變較為明顯的突變體[19]；利用60Co-γ 射線輻照花生(Arachis hypogaea)的干種子，獲得高油突變體和高蛋白突變體[20]；利用60Co-γ射線對(duì)扁穗牛鞭草(Hemarthria compressa)處理發(fā)現(xiàn)，輻照后的大部分牛鞭草葉片趨于變小、株高趨于變矮、莖趨于變細(xì)[21]。另外，輻射誘變營(yíng)養(yǎng)體或種子的再生植株易出現(xiàn)突變嵌合體[22-24]。本研究在牛至M1代突變體中的觀察發(fā)現(xiàn)，各突變體的變異表型在同一株的不同分枝較為一致，說(shuō)明存在嵌合體的可能性小，這可能與牛至種子(胚)極小且選用較高的輻射劑量(100～200 Gy)有關(guān)，另外，本研究通過(guò)枝條扦插的方式擴(kuò)繁變異株，進(jìn)一步避免了輻射誘變可能導(dǎo)致的嵌合體問(wèn)題。

高劑量輻射會(huì)抑制種子發(fā)芽率、生長(zhǎng)勢(shì)和根系生長(zhǎng)[25-28]。本研究結(jié)果表明，當(dāng)輻射劑量超過(guò)200 Gy時(shí)，希臘牛至種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)隨輻射劑量的增大而顯著降低。雖然超過(guò)400 Gy 輻射劑量的種子仍能夠發(fā)芽，但萌發(fā)后的種子胚根尖部壞死，無(wú)法生成主根或產(chǎn)生側(cè)根，播種至育苗基質(zhì)后，苗期即全部死亡。適宜的輻射劑量選擇與植物種類(lèi)、種子大小、輻射部位及輻射材料的含水量關(guān)系密切。徐冠仁[29]認(rèn)為致死劑量的60%～70%才是最佳輻射劑量；對(duì)桂花(Osmanthusfragrans)的研究認(rèn)為，適宜的輻照劑量與品種有很大關(guān)系[30]；史燕山等[31]則以半致死和半致矮劑量為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)晚香玉(Polianthes tuberosa)的種球進(jìn)行輻照處理，確定了晚香玉大小種球的適宜輻照劑量。本研究通過(guò)發(fā)芽率-輻射劑量回歸方程計(jì)算得出牛至輻照的半致死劑量為539 Gy，與研究結(jié)果有較大的差異，半致死劑量不能作為牛至的適宜輻照劑量。結(jié)合本研究結(jié)果得出結(jié)論，希臘牛至輻照處理的適宜劑量應(yīng)控制在致死劑量的18.6%～37.1%為宜，這與其他植物輻射誘變研究的結(jié)論有較大差異，可能是由于希臘牛至種子極小，對(duì)60Co-γ 射線更加敏感。因此，適宜輻射劑量的選擇不能僅參照發(fā)芽率或發(fā)芽勢(shì)，還應(yīng)綜合考慮輻射對(duì)幼苗生長(zhǎng)發(fā)育的影響。

利用60Co-γ 射線輻射牛至種子的近期研究發(fā)現(xiàn)，在不同輻射劑量下處理40 粒種子，牛至的半致死劑量?jī)H為16.39 Gy[32]。本研究的母本材料是自主篩選得到的希臘牛至優(yōu)株，每個(gè)輻射劑量處理了約10 000 粒種子，在100～200 Gy 的輻照強(qiáng)度下獲得大量突變體材料，并在田間條件下篩選有顯著表型變異的突變體。本研究結(jié)果與閆一皓等[32]報(bào)道差異較大，可能與不同種子的基因型差異有關(guān)，也有可能與輻射處理種子數(shù)有關(guān)。

牛至生物產(chǎn)量的主要相關(guān)性狀包括株高、分枝數(shù)、莖節(jié)間長(zhǎng)度和葉片大小等。由于牛至莖稈的精油含量低，葉片和花中的精油含量高，因此篩選大葉、莖節(jié)短(葉片量相對(duì)更大)、植株高大、分枝多以及開(kāi)花量大的突變株系是的牛至主要育種目標(biāo)。通過(guò)輻射誘變獲得具有上述表型的牛至突變株，為培育高生物產(chǎn)量和高精油含量的牛至品種奠定基礎(chǔ)。但該研究結(jié)果僅為當(dāng)年數(shù)據(jù)，雖然該數(shù)據(jù)能較準(zhǔn)確地反映變異株的典型特征，但還需多點(diǎn)、多年研究進(jìn)一步明確變異特征。具有優(yōu)異特征的牛至突變株(如大葉突變株)可以通過(guò)營(yíng)養(yǎng)體扦插擴(kuò)繁，現(xiàn)有結(jié)果表明上述突變性狀均能在扦插后代中穩(wěn)定保持。因此，上述部分突變體不僅能夠?yàn)榕Ｖ岭s交選育提供母本材料，而且具有作為新品種推廣應(yīng)用的潛力。

4 結(jié)論

60Co-γ 射線輻照希臘牛至種子可以有效獲得突變?nèi)后w。牛至種子小，在較低輻射劑量下(100～200 Gy)能夠產(chǎn)生具有優(yōu)異特征的突變體。通過(guò)扦插繁殖突變體單株或單個(gè)分枝，能夠快速穩(wěn)定突變株的優(yōu)異性狀。此方法簡(jiǎn)單易行，創(chuàng)建的突變體庫(kù)為牛至新品種培育奠定了基礎(chǔ)。