栗洋洋 賈夢(mèng)雪 王錦乙 吳紫琪 羊妍珂 嚴(yán)小軍 廖 智 何建瑜

厚殼貽貝()中抗生素耐受細(xì)菌多樣性研究*

栗洋洋 賈夢(mèng)雪 王錦乙 吳紫琪 羊妍珂 嚴(yán)小軍 廖 智 何建瑜①

(浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 海洋生物蛋白質(zhì)工程研究室 浙江舟山 316022)

抗生素的濫用是當(dāng)前水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展及食品安全面臨的重大威脅。貽貝體內(nèi)含有豐富的附生菌群, 但目前尚不清楚貽貝附生菌群在抗生素殘留背景下的動(dòng)態(tài)變化和耐受性特征。為此進(jìn)行了厚殼貽貝中抗生素耐受細(xì)菌多樣性研究。將厚殼貽貝暴露于含有青霉素、鏈霉素和卡那霉素的養(yǎng)殖水體中, 之后采用超聲法獲取含貽貝軟體部組織表面附著菌群的超聲液, 經(jīng)Zobell 2216E液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后, 將組織超聲液和培養(yǎng)液一并經(jīng)16S rDNA高通量測(cè)序來(lái)分析厚殼貽貝微生物的群落組成。結(jié)果表明, 超聲處理后獲得的微生物主要為擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)和疣微菌門(Verrucomicrobia)。多重抗生素的處理可以顯著下降貽貝體內(nèi)微生物的OTU數(shù), 對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)有明顯影響。經(jīng)264 h恢復(fù)養(yǎng)殖后, 在門水平上觀察到貽貝體內(nèi)微生物群落可以恢復(fù)重建, 表明其具有一定的韌性。研究結(jié)果將為今后進(jìn)一步探索宿主相關(guān)微生物群落構(gòu)建機(jī)制及特殊抗性微生物奠定基礎(chǔ)。

厚殼貽貝; 抗生素耐受性; 細(xì)菌; 16S rDNA

我國(guó)是世界上主要的海水養(yǎng)殖大國(guó), 但由于近年來(lái)近海環(huán)境污染、高密度養(yǎng)殖等因素, 海水養(yǎng)殖生物中細(xì)菌性疾病頻繁暴發(fā), 造成了重大經(jīng)濟(jì)損失(張騫月等, 2015)。由于抗生素被廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中(陳昌福, 2013), 水生動(dòng)物的細(xì)菌性疾病得到抑制, 極大提高了養(yǎng)殖生物在細(xì)菌性疾病中的生存率。然而, 抗生素的大量使用以及養(yǎng)殖廢水的無(wú)序排放致使殘余的抗生素在土壤、河口、海洋中不斷遷移富集, 導(dǎo)致環(huán)境介質(zhì)中的耐藥性細(xì)菌出現(xiàn)或者豐度增高(Depaola, 1995), 例如嗜水氣單胞菌(朱芝秀等, 2012)、鰻弧菌(趙魯寧等, 2015)、哈維氏弧菌(曾德乾等, 2015)等。河口中的抗生素通常來(lái)源于水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水和未經(jīng)處理過(guò)的生活污水(Han, 2020)。其中, 由于長(zhǎng)江口特殊的地緣環(huán)境, 該海域受人為以及自然因素影響極大, 很容易造成抗生素的累積。同時(shí)該區(qū)域內(nèi)存在多個(gè)漁業(yè)養(yǎng)殖區(qū), 水體或沉積物中抗生素可能對(duì)養(yǎng)殖生態(tài)造成一定影響(Huang, 2021)。既往的研究多集中在環(huán)境樣本的抗生素抗性基因的調(diào)查(郭行磐, 2019), 包括磺胺類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類等在內(nèi)的20種抗生素及其抗性基因普遍存在長(zhǎng)江口及其鄰近水域環(huán)境的微生物被膜、沉積物和表層水中。然進(jìn)一步對(duì)抗生素如何影響宿主微生物群落結(jié)構(gòu)的研究仍然比較匱乏。

具有開(kāi)放式循環(huán)系統(tǒng)以及強(qiáng)大濾食性特征的雙殼貝類的組織表面常附著大量微生物, 它們不僅參與宿主的生理代謝活動(dòng)(黃道芬等, 2017; 楊娜, 2018), 還會(huì)影響區(qū)域內(nèi)的關(guān)鍵元素循環(huán)(Pfister, 2010)。因此, 雙殼貝類是研究宿主微生物群落結(jié)構(gòu)的一個(gè)良好的模型系統(tǒng)。目前已有研究關(guān)注貝類體內(nèi)的耐藥性微生物, 例如, 江艷華等(2015)從山東和遼寧沿海地區(qū)的養(yǎng)殖海水貝類中分離得到少量致病且具耐藥性的副溶血性弧菌。暴露于磺胺甲惡唑(sulfamethoxazole, SMX)的紫貽貝()體內(nèi)微生物會(huì)出現(xiàn)特異的抗生素抗性基因(Serra-Compte, 2019)。另一方面, 多重抗生素的聯(lián)合可能會(huì)加速細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生(Liu, 2020)。然耐藥性微生物的出現(xiàn)如何影響宿主微生態(tài)尤未可知。在此情況下, 利用聯(lián)合抗生素研究貝類體內(nèi)的微生物群落結(jié)構(gòu)儼然成為了研究耐藥性微生物的一部分。

厚殼貽貝()隸屬于雙殼綱(Bivalvia)、貽貝目(Mytiloida)、殼菜蛤科(Mytilidae)、貽貝屬(), 是中國(guó)沿海主要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖貝類。浙江沿岸的貽貝養(yǎng)殖區(qū)主要集中在長(zhǎng)江口及其毗鄰海域(長(zhǎng)江口向東至125°E, 27°30′～33°30′N之間)。由于具有較強(qiáng)的免疫耐受性和環(huán)境適應(yīng)性, 厚殼貽貝不僅成為重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖貝類, 更成為一種環(huán)境指示生物(閻鐵等, 1993; 劉碩博, 2019)。目前對(duì)于貽貝微生物的研究多集中在養(yǎng)殖海區(qū)的微生物群落分析(李斯遠(yuǎn)等, 2021), 以及不同組織的微生物種群結(jié)構(gòu)解析(Musella, 2020), 對(duì)于貽貝體內(nèi)抗生素耐受微生物類群尚缺乏足夠的認(rèn)識(shí)。根據(jù)前期研究發(fā)現(xiàn), 貽貝組織微生物以變形菌門為主(Musella, 2020; 李斯遠(yuǎn)等, 2021), 且氨基糖苷類抗生素對(duì)變形菌有較強(qiáng)的作用(謝惠民, 1986)。因此為更好地了解多重抗生素影響下厚殼貽貝體內(nèi)抗性微生物的群落結(jié)構(gòu)變化, 本研究擬采用兩種針對(duì)革蘭氏陰性菌的氨基糖苷類抗生素(鏈霉素和卡那霉素)和一種針對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的青霉素G類抗生素(青霉素)對(duì)厚殼貽貝進(jìn)行聯(lián)合刺激。將厚殼貽貝充分暴露于含有多重抗生素的水體中, 以獲取其體內(nèi)微生物的群落結(jié)構(gòu)。為系統(tǒng)了解整體組織微生物的分布情況, 本研究采用超聲方式獲得貽貝組織超聲液, 再利用Zobell 2216E培養(yǎng)基對(duì)超聲液進(jìn)行液體培養(yǎng), 通過(guò)16S rDNA高通量測(cè)序獲得可培養(yǎng)與未培養(yǎng)細(xì)菌多樣性。最終研究結(jié)果將有助于了解厚殼貽貝組織中抗生素耐受細(xì)菌群落結(jié)構(gòu), 服務(wù)于我國(guó)貽貝養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2020年12月從浙江省舟山市嵊泗海域采集厚殼貽貝60只[約2年齡, 體長(zhǎng): (98.74±5.86) mm; 體重: (73.6±9.1) g], 立即返回實(shí)驗(yàn)室后進(jìn)行個(gè)體分離, 清理貽貝表面附著物后置于潔凈的海水中(鹽度為25, 溫度為18 °C)進(jìn)行暫養(yǎng)48 h后, 開(kāi)展如下實(shí)驗(yàn)。

1.2 厚殼貽貝組織超聲液的獲取與微生物培養(yǎng)

為系統(tǒng)了解厚殼貽貝體內(nèi)組織微生物的多樣性, 本研究采用超聲法獲取厚殼貽貝體內(nèi)組織表面附著的微生物。在超凈工作臺(tái)上, 用無(wú)菌水刷洗貽貝殼表面并去除附著的雜質(zhì)。用解剖剪將貽貝(=3)開(kāi)殼去除體內(nèi)多余海水, 經(jīng)無(wú)菌水沖洗后分別置于三個(gè)無(wú)菌燒杯中, 加入無(wú)菌海水浸沒(méi)貽貝, 利用超聲波清洗儀(SB-5200DT)進(jìn)行梯度超聲處理(20 °C, 40 kHz)。梯度超聲累計(jì)時(shí)間分別為1、2、5、10、20、30 min, 每種超聲強(qiáng)度下3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。為了防止超聲引起水體發(fā)熱, 每超聲1 min后暫停1 min。設(shè)定超聲時(shí)間結(jié)束后, 將三個(gè)燒杯中的超聲液混合, 置于離心管中進(jìn)行多次離心(4 °C, 10 000 r/min, 5 min), 最終收集約10 mL厚殼貽貝組織超聲液, 分別標(biāo)記后開(kāi)展液體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和DNA提取。為進(jìn)一步探究厚殼貽貝組織中可培養(yǎng)微生物的物種分布, 將1 mL上述獲取的厚殼貽貝組織超聲液加入至5 mL含有Zobell 2216E培養(yǎng)基(ZoBell, 1941)的EP管中, 在恒溫培養(yǎng)搖床(QYC-200)中進(jìn)行恒溫震蕩培養(yǎng)(160 r/min, 28 °C), 培養(yǎng)16 h后獲得組織微生物培養(yǎng)液, 并在600 nm下測(cè)量其吸光度值(OD600)。

1.3 多重抗生素共培養(yǎng)

為闡明厚殼貽貝歷經(jīng)抗生素刺激后組織微生物的群落結(jié)構(gòu)變化, 本研究將厚殼貽貝充分暴露于鏈霉素、卡那霉素和青霉素聯(lián)合培養(yǎng)的養(yǎng)殖水體中。由于前期文獻(xiàn)已知厚殼貽貝體內(nèi)主要為變形菌門(李斯遠(yuǎn)等, 2021), 而變形菌門對(duì)鏈霉素更為敏感(謝惠民, 1986)。因此, 多重抗生素組合以鏈霉素濃度梯度進(jìn)行, 分別為20 μg/mL (L組)、40 μg/mL (M組)、80 μg/mL (H組), 而青霉素與卡那霉素濃度固定為20 μg/mL。經(jīng)共培養(yǎng)48 h后, 獲取貽貝組織超聲液并轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng), 根據(jù)最低OD值確定最適抗生素濃度(王敏等, 2020)。隨后, 采用確定的抗生素濃度進(jìn)行刺激, 期間每天換一次含有相同抗生素濃度的海水。刺激6 d后, 換成不添加任何抗生素的無(wú)菌海水進(jìn)行微生物的恢復(fù), 每48 h換一次無(wú)菌海水。參考相關(guān)文獻(xiàn)(孔輝, 2020; Xu, 2021)以及前期預(yù)實(shí)驗(yàn), 為避免長(zhǎng)時(shí)間饑餓效應(yīng)影響宿主微生物群落結(jié)構(gòu), 本實(shí)驗(yàn)中厚殼貽貝組織微生物的恢復(fù)時(shí)間設(shè)置為10 d。以潔凈海水養(yǎng)殖的厚殼貽貝作為對(duì)照組。每個(gè)測(cè)量時(shí)間點(diǎn)分別取3只貽貝進(jìn)行解剖獲取組織超聲液和微生物培養(yǎng)液, 方法同上。

1.4 微生物總DNA提取、文庫(kù)構(gòu)建和16S rDNA高通量測(cè)序

為了解厚殼貽貝組織中抗生素耐受細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征, 采用16S rDNA高通量測(cè)序方法研究可培養(yǎng)與未培養(yǎng)細(xì)菌多樣性。樣品總DNA提取參照TIANamp Genomic DNA Kit (DP304, TIANGEN, 中國(guó))試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行, 并經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000 (THERMO, 美國(guó))檢驗(yàn)合格后, 進(jìn)行16S rDNA V3～V4區(qū)測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建。文庫(kù)構(gòu)建采用細(xì)菌通用引物B341F (5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和B785R (5′-ACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)進(jìn)行, 擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件參照KAPA HiFi HotStart PCR Kit (KAPA Biosystems, Roche, 美國(guó))試劑盒說(shuō)明書。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠回收純化后進(jìn)行文庫(kù)DNA質(zhì)量濃度檢測(cè), 膠回收方法參照QIAquick Gel Extraction Kit試劑盒(QIAGEN, 德國(guó))說(shuō)明書進(jìn)行。DNA濃度采用Qubit Fluorometer (美國(guó))進(jìn)行, 測(cè)序文庫(kù)的摩爾濃度以KAPA Library Quantification Kit試劑盒(KAPA Biosystems, Roche, 美國(guó))進(jìn)行定量。測(cè)序文庫(kù)經(jīng)檢驗(yàn)合格后, 采用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)(美國(guó))進(jìn)行兩端并行測(cè)序(PE250)。微生物16S rDNA高通量測(cè)序在浙江杭州開(kāi)泰生物技術(shù)有限公司進(jìn)行。

1.5 生物信息學(xué)分析

將獲得的原始序列使用軟件Vsearch v2.13.6 (Rognes, 2016)的fastq_mergepairs模塊進(jìn)行拼接, 利用Cutadapt v2.4去除序列中的標(biāo)簽Barcode, 同時(shí)利用Vsearch的fastq_filter模塊去除低質(zhì)量序列、嵌合體序列以及長(zhǎng)度小于100 bp的序列, 對(duì)得到的高質(zhì)量序列進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。利用MOTHUR (Schloss, 2009)對(duì)獲得的高質(zhì)量序列按照97%相似度進(jìn)行OTU (operational taxonomic unite)聚類。OTU的物種注釋采用SILVA_132數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行。去除低豐度OTU (Reads<2)后進(jìn)行抽平, 獲得最終OTU_TAX表后分析細(xì)菌Alpha多樣性, 包括Observed OTU和Shannon指數(shù)。菌屬重要性利用隨機(jī)森林(Random forest)回歸分析。所有分析均在R v4.0.3環(huán)境下調(diào)用ggplot2、phyloseq(McMurdie, 2013)、microeco (Liu, 2021)和vegan(Dixon, 2003)軟件包進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

培養(yǎng)液OD值的顯著性差異和Alpha多樣性指數(shù)的顯著性差異主要采用單因素方差分析(One-way ANOVA), 組間多重比較采用Student-Newman-Keuls (SNK)檢驗(yàn)進(jìn)行。<0.05表示具有顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 超聲處理后厚殼貽貝組織微生物分布情況

通過(guò)對(duì)厚殼貽貝全組織進(jìn)行時(shí)間梯度超聲, 所獲得的超聲液利用Zobell 2216E培養(yǎng)基進(jìn)行液體培養(yǎng), 結(jié)果顯示OD600值隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯增加, 最高峰值(0.26)出現(xiàn)在累計(jì)超聲10 min組, 隨后在30 min后下降至0.2 (圖1a, ANOVA: d=5,-value=36.85,<0.001)。進(jìn)一步對(duì)10 min和30 min的超聲液和微生物培養(yǎng)液進(jìn)行16S rDNA高通量測(cè)序, 結(jié)果顯示可培養(yǎng)獲得的OTU數(shù)顯著低于未培養(yǎng)獲得OTU數(shù)(<0.01), 僅約20% (圖1b)。在未培養(yǎng)模式下, 超聲10 min獲得的OTU數(shù)和香農(nóng)指數(shù)顯著高于超聲30 min (<0.05); 在可培養(yǎng)模式下, 兩種超聲時(shí)間強(qiáng)度獲得的細(xì)菌群落的OTU數(shù)和香農(nóng)指數(shù)并無(wú)明顯差別(圖1b)。通過(guò)超聲方式獲得的微生物類群主要為擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)和疣微菌門(Verrucomicrobia)。利用Zobell 2216E培養(yǎng)后獲得的主要微生物群落為變形菌門(圖1c)。

2.2 厚殼貽貝組織中抗生素耐受微生物的群落結(jié)構(gòu)分析

利用青霉素、鏈霉素和卡那霉素組成的多重抗生素刺激厚殼貽貝。結(jié)果顯示(圖2), 相比于對(duì)照組, L組(鏈霉素20 μg/mL)和M組(鏈霉素40 μg/mL)獲得的可培養(yǎng)菌液的OD值顯著降低, 而H組(鏈霉素80 μg/mL)與對(duì)照組無(wú)顯著差異?？紤]到鏈霉素對(duì)變形菌門的影響較大, 因此將青霉素20 μg/mL、鏈霉素40 μg/mL和卡那霉素20 μg/mL作為聯(lián)抗實(shí)驗(yàn)的刺激濃度, 將超聲10 min作為獲取厚殼貽貝組織微生物超聲液的時(shí)間強(qiáng)度。

在實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖過(guò)程中, 對(duì)照組和聯(lián)抗組的可培養(yǎng)的微生物菌液OD值都呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(圖3a, 對(duì)照組ANOVA: d=3,-value=106.1,<0.001; 聯(lián)抗組ANOVA: d=4,-value =38.91,<0.001)。在刺激階段(0～144 h), 對(duì)照組和聯(lián)抗組48 h前的可培養(yǎng)的微生物菌液OD值都呈現(xiàn)下降趨勢(shì), 隨后, 聯(lián)抗組的可培養(yǎng)微生物菌液OD值繼續(xù)下降, 在144 h時(shí)OD值達(dá)到最低, 但對(duì)照組未呈現(xiàn)明顯差異。在恢復(fù)階段(144～408 h), 聯(lián)抗組的可培養(yǎng)微生物菌液OD值呈上升趨勢(shì)。通過(guò)對(duì)聯(lián)抗組細(xì)菌16S rDNA高通量測(cè)序, 無(wú)論是可培養(yǎng)還是未培養(yǎng)模式, 聯(lián)抗處理(0～144 h) 都顯著下調(diào)厚殼貽貝組織微生物多樣性, 經(jīng)過(guò)264 h恢復(fù)后, 細(xì)菌多樣性有所升高(圖3b)。通過(guò)對(duì)組織超聲液的菌落結(jié)構(gòu)分析可知, 開(kāi)始時(shí)厚殼貽貝組織微生物主要為變形菌門(約75%), 多重抗生素清除了大量的變形菌類群, 致使變形菌門豐度下降至約25% (144 h時(shí)), 而擬桿菌門類群的豐度由15%上升至75%。停止抗生素使用后(408 h), 變形菌門的豐度又上升至70%?？膳囵B(yǎng)的微生物基本都為變形桿菌類群(圖3c)。由此可見(jiàn), 多重抗生素可以改變厚殼貽貝組織微生物的群落結(jié)構(gòu), 并在受到刺激后自行恢復(fù)。

圖1 超聲處理后組織微生物變化情況

注: a. 超聲時(shí)間梯度下, 超聲液在Zobell 2216E培養(yǎng)后的OD值; b. 兩種模式下, 可觀察到的OTU數(shù)和香農(nóng)多樣性指數(shù); c. 微生物門水平下的群落結(jié)構(gòu)組成

圖2 多重抗生素處理后可培養(yǎng)菌液的OD值變化情況

注: L組: 青霉素20 μg/mL, 鏈霉素20 μg/mL, 卡那霉素20 μg/mL; M組: 青霉素20 μg/mL, 鏈霉素40 μg/mL, 卡那霉素20 μg/mL; H組: 青霉素20 μg/mL, 鏈霉素80 μg/mL, 卡那霉素20 μg/mL

通過(guò)隨機(jī)森林回歸模型分析發(fā)現(xiàn)在樣本中存在顯著差異且相對(duì)豐度前20的細(xì)菌物種(圖4)。在未經(jīng)培養(yǎng)的超聲液中, 假交替單胞菌屬()在聯(lián)抗處理144 h后豐度顯著上調(diào), 約占全部菌屬的0.5%, 當(dāng)移除抗生素的影響后, 該屬的相對(duì)豐度下降至0.15%左右。相反, 弧菌屬()在未用抗生素處理前相對(duì)豐度約為0.18%, 聯(lián)抗處理后其相對(duì)豐度下降(<0.1%)。當(dāng)移除抗生素的影響后, 弧菌屬的相對(duì)豐度顯著增高, 超過(guò)0.3%。聯(lián)抗處理144 h后的貽貝超聲液經(jīng)過(guò)Zobell 2216E培養(yǎng), 主要為黃桿菌屬(, ～0.35%)和屬(～0.15%)。在潔凈海水中恢復(fù)264 h后, 可培養(yǎng)的菌屬主要為鹽單胞菌屬()、假單胞菌屬()和屬, 豐度均大于0.1%。

圖3 多重抗生素處理后組織微生物變化情況

注: a. 多重抗生素處理時(shí)間梯度下, 超聲液在Zobell 2216E培養(yǎng)后的OD值?；疑硎緦?duì)照組, 黑色表示聯(lián)抗組。b. 兩種模式下, 可觀察到的OTU數(shù)和香農(nóng)多樣性指數(shù)。c. 微生物在門水平下的群落結(jié)構(gòu)組成

通過(guò)對(duì)可培養(yǎng)微生物菌液OD值和其多樣性進(jìn)行相關(guān)分析, 結(jié)果顯示菌液OD值和OTU數(shù)呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)(=0.61,<0.01, 圖5), 但與香農(nóng)多樣性指數(shù)無(wú)明顯相關(guān)關(guān)系(>0.05, 圖5)。

3 討論

本文主要探討了多重抗生素刺激下厚殼貽貝體內(nèi)微生物的群落結(jié)構(gòu)變化。對(duì)于動(dòng)物組織微生物的群落結(jié)構(gòu)研究, 一般采用直接提取組織DNA后, 進(jìn)行標(biāo)記基因的高通量測(cè)序(韓毛振, 2019)。16S rDNA基因仍然是目前微生物多樣性研究中最為廣泛使用的標(biāo)記基因(Yarza, 2014)。盡管該方法簡(jiǎn)單高效, 但存在一定局限性, 主要是受到取樣的限制, 通常只能反映出取樣位點(diǎn)的微生物結(jié)構(gòu)組成等, 而無(wú)法反映整體的組織微生物群落結(jié)構(gòu)。本文基于16S rDNA基因高通量測(cè)序方法, 對(duì)貽貝超聲液和液體培養(yǎng)液進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)分析, 結(jié)果顯示經(jīng)Zobell 2216E液體培養(yǎng), 獲得的微生物類群主要是變形菌門?？膳囵B(yǎng)模式下的細(xì)菌OTU數(shù)約為未培養(yǎng)模式的25%, 且多樣性水平也顯著低于培養(yǎng)模式。通常可培養(yǎng)模式獲得的微生物多樣性低于未培養(yǎng)模式, 對(duì)液體培養(yǎng)后直接進(jìn)行高通量測(cè)序, 盡管可以獲得更多群落信息, 但仍受制于培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基(邢磊等, 2017)。

圖4 基于隨機(jī)森林分析厚殼貽貝體內(nèi)對(duì)抗生素敏感的重要細(xì)菌標(biāo)志菌屬

圖5 可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性指數(shù)與培養(yǎng)液OD值的相關(guān)性分析

為簡(jiǎn)單有效地獲取厚殼貽貝體內(nèi)較為全面的微生物群落信息, 本文利用超聲波對(duì)厚殼貽貝進(jìn)行原位超聲處理, 將獲取的超聲液進(jìn)行液體培養(yǎng), 通過(guò)16S rDNA高通量測(cè)序揭示厚殼貽貝體內(nèi)可培養(yǎng)與未培養(yǎng)細(xì)菌群落多樣性。培養(yǎng)液的OD值隨著超聲時(shí)間強(qiáng)度的增大呈先上升后下降趨勢(shì), 并于10 min時(shí)達(dá)到峰值。16S rDNA高通量測(cè)序結(jié)果, 相比于超聲10 min, 在超聲30 min之后細(xì)菌多樣性顯著下降。這可能是因?yàn)槌暡ㄋ袀鞑?huì)產(chǎn)生空化共振效應(yīng), 處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)對(duì)厚殼貽貝表面附著微生物具有破壞作用, 可能破壞微生物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和功能(張婧男等, 2021), 也可能造成微生物菌體被膜脂質(zhì)結(jié)構(gòu)過(guò)氧化和物理斷裂(趙偉睿等, 2014), 最終致使微生物死亡。結(jié)合OD值與OTU數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系, 因此本文選取10 min作為最佳超聲時(shí)間。由此說(shuō)明, 通過(guò)對(duì)超聲方式獲得貽貝超聲液進(jìn)行測(cè)序分析, 可以對(duì)厚殼貽貝體內(nèi)整體群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行簡(jiǎn)單有效的分析, 但超聲時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。擬桿菌門、變形菌門和疣微菌門是貽貝超聲液中的主要微生物類群, 這與李斯遠(yuǎn)等(2021)的研究結(jié)果基本一致。

為分析厚殼貽貝組織體內(nèi)抗生素耐受細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu), 通過(guò)將厚殼貽貝暴露于含有3種抗生素的養(yǎng)殖水體中, 進(jìn)而研究貽貝體內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)變化。在實(shí)驗(yàn)初始階段(0～48 h), 對(duì)照組和聯(lián)抗組的可培養(yǎng)液OD值都存在下降趨勢(shì), 這可能與貽貝生存環(huán)境改變有關(guān)。在潔凈海水養(yǎng)殖后, 體內(nèi)微生物豐度被稀釋, 導(dǎo)致部分機(jī)會(huì)菌群?jiǎn)适?。?jīng)過(guò)144 h 的連續(xù)抗生素刺激, 組織超聲液的可培養(yǎng)OD值達(dá)到最低。利用16S rDNA高通量測(cè)序, 結(jié)果顯示超聲液中的細(xì)菌OTU數(shù)和多樣性水平顯著下降, 且細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化, 優(yōu)勢(shì)菌群由變形菌門(Proteobacteria)轉(zhuǎn)變?yōu)閿M桿菌門(Bacteroidetes)。這說(shuō)明了多種抗生素的聯(lián)合使用改變了厚殼貽貝體內(nèi)微生物的群落結(jié)構(gòu)。根據(jù)文獻(xiàn)資料已知, 青霉素類抗生素主要抑制革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁的合成; 鏈霉素和卡那霉素作為氨基糖苷類抗生素, 主要抑制革蘭氏陰性菌的蛋白質(zhì)合成(徐進(jìn)等, 2005)。由于變形菌門主要為革蘭氏陰性菌, 在多重抗生素的作用下, 菌群的相對(duì)豐度發(fā)生明顯的變化。Pindling等(2018)將斑馬魚幼體暴露于含鏈霉素的水體中, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)會(huì)鏈霉素會(huì)增加斑馬魚幼體的死亡率, 改變體內(nèi)微生物的群落結(jié)構(gòu), 減弱多樣性水平, 而且會(huì)促使微生物在個(gè)體中的差異減小。環(huán)境中抗生素或可作為微生物群落之間的信號(hào), 致使微生物種群發(fā)生趨同進(jìn)化(Aminov, 2009), 或?qū)⒖股乜剐曰蛩睫D(zhuǎn)移至其他菌株(Mishra, 2021), 最終致使單一類群(擬桿菌門)豐度顯著上升。

進(jìn)一步通過(guò)隨機(jī)森林回歸分析, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)假交替單胞菌屬在抗生素刺激后豐度顯著上升, 而弧菌屬出現(xiàn)相反的趨勢(shì)。假交替單胞菌屬是水產(chǎn)養(yǎng)殖生物和環(huán)境中常見(jiàn)的一類菌群, 且比較容易發(fā)生抗生素耐受。例如黃志堅(jiān)等(2012)從湛江、珠海、湖南、海南等地的水產(chǎn)養(yǎng)殖生物和環(huán)境中分離得到的139株細(xì)菌進(jìn)行抗生素抗性基因鑒定, 發(fā)現(xiàn)鏈霉素抗性基因()陽(yáng)性占比率為10.07%。因此, 盡管受三種抗生素持續(xù)脅迫約一周, 貽貝體內(nèi)依然存在一定數(shù)量的微生物。Kerry等(1996)比較了水產(chǎn)養(yǎng)殖池和未使用抗生素的河流, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖池中抗四環(huán)素和氯霉素的抗性細(xì)菌數(shù)量顯著增加。這從側(cè)面反映了環(huán)境或貽貝組織中存在抗生素耐受細(xì)菌, 可能是由于微生物存在內(nèi)在抗性基因, 或隨機(jī)突變表達(dá)潛在抗性基因而導(dǎo)致耐受現(xiàn)象的出現(xiàn)(Davies, 2010; 蘇建強(qiáng)等, 2013)。當(dāng)環(huán)境中沒(méi)有抗生素脅迫壓力后, 厚殼貽貝體內(nèi)微生物豐度重新上升, 多樣性水平增加, 在門水平的群落結(jié)構(gòu)趨向于初始狀態(tài), 這可能暗示貽貝體內(nèi)微生物具有一定韌性, 可以自發(fā)恢復(fù)到初始群落狀態(tài)。雖然本文并未對(duì)微生物的抗性基因進(jìn)行解析, 因而無(wú)法判斷相關(guān)抗生素抗性基因的種類和豐度, 但貽貝組織微生物群落重建的內(nèi)在機(jī)制是一個(gè)值得研究的方向。這將有助于理解貝類微生物定植以及群落發(fā)生的機(jī)理, 同時(shí)有助于理解水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌耐藥性的起源和擴(kuò)散機(jī)制。

4 結(jié)論與展望

本文采用抗生素脅迫策略, 結(jié)合超聲方式獲取貽貝組織附生微生物菌群, 通過(guò)16S rDNA測(cè)序和生物信息學(xué)手段, 對(duì)厚殼貽貝組織微生物對(duì)抗生素的耐受性及其群落結(jié)構(gòu)在抗生素處理?xiàng)l件下的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了研究。研究結(jié)果證實(shí)了貽貝組織中存在抗生素耐受菌群; 表明了貽貝組織微生物菌落具有較強(qiáng)的自我重構(gòu)和自我恢復(fù)能力。上述研究結(jié)果一方面為了解貽貝在當(dāng)前環(huán)境水體抗生素殘留背景下, 其體內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)的變化以及由此帶來(lái)對(duì)貽貝養(yǎng)殖業(yè)和食品安全的可能影響奠定了基礎(chǔ); 另一方面, 也為深入了解貽貝-微生物之間的生態(tài)關(guān)聯(lián)以及這種關(guān)聯(lián)對(duì)貽貝生存的重要作用提供了新的研究思路。

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DIVERSITY OF ANTIBIOTIC RESISTANT BACTERIA IN

LI Yang-Yang, JIA Meng-Xue, WANG Jin-Yi, WU Zi-Qi, YANG Yan-Ke, YAN Xiao-Jun, LIAO Zhi, HE Jian-Yu

(Laboratory of Marine Biology Protein Engineering, College of Marine Science and Technology, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China)

The abuse of antibiotics is a major threat to the aquaculture industry and food safety. Mussels are rich in symbiotic bacteria. However, the dynamic variation and tolerance characteristics of the microbiota exposed to residual antibiotics remain poorly understood. To fill the knowledge gap, the diversity of antibiotic resistant bacteria inwas carried out..were exposed to seawater containing penicillin, streptomycin, and kanamycin. The ultrasonic solution containing symbiotic bacteria colonized on the surface of.soft part was obtained ultrasonically. The ultrasonic solution was then cultured in Zobell 2216E liquid medium and the culture solution was subjected to 16S rDNA high-throughput sequencing. Results show that the microorganisms were mainly Bacteroidetes, Proteobacteria, and Verrucomicrobia. The joint effect of multiple antibiotics could significantly reduce the OTUs of microbiome in.with an obvious impact on the microbial community structure. After recovering for 264 h, the microbial community in.was restored and reconstructed at phylum level, reflecting its resilience to a certain extent. This study lays foundation for further exploration of the assembly principles of host-associated microbiota and special resistant microbes in the future.

; antibiotic resistance; bacteria; 16S rDNA

*國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目, 42020104009號(hào); 浙江省“省屬高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)”項(xiàng)目, 2021J001號(hào); 國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃, 202110340029號(hào); 浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)計(jì)劃暨新苗人才計(jì)劃, 2021R411005號(hào)。栗洋洋, E-mail: lyy2836@qq.com

何建瑜, 博士, 講師, E-mail: hejianyu@zjou.edu.cn

2021-09-04,

2021-11-15

S917.1

10.11693/hyhz20210900199