張旨軒 王子言 王 澤 劉 巖 劉松怡 錢鵬宇 葉 歡 韓姣姣 周 君 蘇秀榕

基于全基因組重測序技術(shù)的浙江近岸海域耐鹽金黃色葡萄球菌()耐藥機制解析*

張旨軒1王子言1王 澤1劉 巖1劉松怡1錢鵬宇2葉 歡2韓姣姣1周 君1蘇秀榕1①

(1. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院 浙江寧波 315211; 2. 浙江正合谷生物科技有限公司 浙江寧波 315048)

金黃色葡萄球菌()是近岸海域海水中的主要病原菌, 嚴(yán)重威脅接觸者的安全?？股靥幚硎侵委熃瘘S色葡萄球菌感染的重要手段, 其耐藥性的發(fā)生受到了高度重視。采用全基因組重測序與KEGG富集分析結(jié)合的方法, 對紅霉素(erythromycin)、氯霉素(chloramphenicol)和萬古霉素(vancomycin)處理后的耐鹽金黃色葡萄球菌(ZS01)和不耐鹽金黃色葡萄球菌(502A)進(jìn)行耐藥機制研究。結(jié)果表明,502A經(jīng)抗生素處理后發(fā)生突變的程度大于ZS01, 二者在經(jīng)過氯霉素處理發(fā)生了更大程度的突變。紅霉素、氯霉素和萬古霉素處理主要影響了金黃色葡萄球菌的致病能力; 紅霉素和氯霉素可能通過影響金黃色葡萄球菌脂類的代謝引起其耐藥性的變化。除此之外, 三種抗生素處理均出現(xiàn)了較多TIGR01741家族蛋白和假設(shè)蛋白基因的突變, 推測與菌株的耐藥性和致病性相關(guān)。耐鹽金黃色葡萄球菌可通過外排系統(tǒng)作用產(chǎn)生紅霉素耐藥性, 不耐鹽菌株因細(xì)胞壁成分相關(guān)基因的突變提高了對萬古霉素的耐受性。研究結(jié)果可為耐鹽和不耐鹽金黃色葡萄球菌的耐藥機制及抗生素對金黃色葡萄球菌致病性影響的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

金黃色葡萄球菌(); 全基因組重測序; KEGG富集分析; 耐藥機制; 致病性

金黃色葡萄球菌()是葡萄球菌科(Staphylococcaceae)最具侵襲性的物種, 近年來成為近岸海域的主要病原菌之一。研究顯示近岸海域中的各項指標(biāo)受到人類活動的影響(王小靜等, 2015), 金黃色葡萄球菌可能經(jīng)由污水排放、地表徑流和糞便、表皮脫落等途徑進(jìn)入海域(何藝科, 2018)。海水中的金黃色葡萄球菌被認(rèn)為是皮膚、眼睛和耳朵疾病的風(fēng)險指標(biāo)(Cheung, 1990), 體表傷口接觸被金黃色葡萄球菌污染的海水可能引起皮膚感染、敗血癥等疾病的發(fā)生(Tong, 2015), 還可能通過吞咽等方式感染浴場游客, 因此一直被推薦作為一個新的參數(shù)添加到海水質(zhì)量評估體系中(Ramcharitar, 2006)。

金黃色葡萄球菌能夠在選擇壓力下快速適應(yīng)并傳播, 除鹽度適應(yīng)外, 包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant, MRSA)在內(nèi)的越來越多的耐藥型金黃色葡萄球菌被分離出來(Obaidat, 2015; Vaiyapuri, 2019)。MRSA是當(dāng)前最常見的耐藥病原體之一, 染色體上的基因可產(chǎn)生一種與β-內(nèi)酰胺類抗生素低結(jié)合力的青霉素結(jié)合蛋白PBP2α, 因此MRSA在β-內(nèi)酰胺類抗生素存在的情況下能夠繼續(xù)生長, 從而表現(xiàn)出耐藥性(Ibrahim, 2021); 有些則是質(zhì)粒介導(dǎo)獲得的耐藥性, 通過耐藥基因等產(chǎn)生大量β-內(nèi)酰胺酶, 使青霉素緩慢失活。耐藥性的出現(xiàn)給金黃色葡萄球菌的治療帶來了重大阻礙, 因此深入探究金黃色葡萄球菌的耐藥機制和致病機制并找到準(zhǔn)確的治療靶位, 尋找除抗生素之外的治療手段具有重要意義。

細(xì)菌耐藥性常采用紙片擴散法、稀釋法、E-test法、PCR技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)等手段進(jìn)行研究, 但以上方法均存在一定的局限性, 本研究采用全基因組重測序的方法, 對耐鹽和標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌耐藥性相關(guān)位點進(jìn)行檢測, 既可以掌握已知的耐藥基因還能夠預(yù)測到耐藥性相關(guān)的潛在基因, 從而解析耐鹽菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株耐藥機制的異同(Zankari, 2013)。

1 材料與方法

1.1 材料

耐鹽菌株ZS01和不耐鹽菌株502A為實驗室保存于–80 °C的菌種, 牛肉膏培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司, 細(xì)菌DNA提取試劑盒購于北京全氏金生物技術(shù)有限公司, 紅霉素、氯霉素和萬古霉素購買于上海源葉生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株復(fù)蘇及鑒定 冷凍保存的ZS01和502A菌株接種于海水牛肉膏液體培養(yǎng)基37 °C進(jìn)行復(fù)蘇, 10 000 r/min離心5 min收集對數(shù)生長前期的菌沉淀, 用等量生理鹽水稀釋后取200 μL菌懸液加入5 mL的海水牛肉膏培養(yǎng)基中。取沉淀用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取DNA, 16S rRNA通用引物(27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′; 1492R: 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)用于菌株鑒定, 測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi. nlm.nih.gov)進(jìn)行比對, 并采用基因芯片檢測試劑盒進(jìn)一步驗證。

1.2.2 抗生素處理 分別用400 μg/mL的紅霉素、氯霉素和萬古霉素對兩株菌的轉(zhuǎn)接菌液進(jìn)行脅迫處理, 于37 °C培養(yǎng)24 h。根據(jù)菌株生長狀況以10倍為梯度調(diào)整抗生素處理濃度, 最終找到菌株對各抗生素的最高耐受濃度。收集ZS01和502A最高耐受抗生素濃度脅迫下的菌沉淀作為重測序樣品。

1.2.3 重測序及生物信息學(xué)分析 將上述樣品進(jìn)行基因組DNA的提取, 利用超聲法打斷基因組DNA, 然后修復(fù)DNA片段末端, 將A堿基添加到DNA片段的3′末端, 完成測序接頭拼接, 選擇合適的片段進(jìn)行PCR擴增完成建庫, 對文庫進(jìn)行質(zhì)檢?；蚪M重測序采用HiSeq 4000平臺進(jìn)行, 測序模式為PE 150。對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理獲得有效數(shù)據(jù), 利用BWA軟件(Li, 2009)將讀長(reads)比對到參考基因組(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/000/016/805/GCF_000016805.1_ASM1680v1/GCF_000016805.1_ASM1680v1_genomic.fna.gz), 用SnpEff軟件(Cingolani, 2012)對檢測到的SNPs (單核苷酸多態(tài)性)、InDels (插入缺失)以及SVs (結(jié)構(gòu)變異)進(jìn)行功能注釋, 并進(jìn)行相關(guān)基因的KEGG富集分析(https: //www. kegg.jp/)。

2 結(jié)果

2.1 菌株鑒定及樣品制備

NCBI數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果顯示兩菌株均為金黃色葡萄球菌, 基因芯片檢測驗證了此結(jié)果。ZS01和502A在海水牛肉膏固體培養(yǎng)基上生長狀態(tài)良好, 表面光滑凸起, 顏色為金黃或者白色, 符合金黃色葡萄球菌的生長特征。最終選定320 μg/mL紅霉素、40 μg/mL氯霉素和3 μg/mL萬古霉素處理ZS01和502A, 所得樣本分別記為E1、C1、V1和E2、C2、V2。

2.2 重測序

2.2.1 重測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計 對ZS01及經(jīng)特定濃度抗生素處理后的ZS01 DNA基因組重測序并進(jìn)行質(zhì)量控制后, 獲得了總長度為7.59 G的數(shù)據(jù), 共50 320 502個reads。對502A及經(jīng)特定濃度抗生素處理后的502ADNA基因組重測序并進(jìn)行質(zhì)量控制后, 獲得了總長度為7.52 G的數(shù)據(jù), 共50 009 758個reads。預(yù)處理后, 各樣本獲得的有效數(shù)據(jù)占原始數(shù)據(jù)的比值均大于98.53%, 數(shù)據(jù)質(zhì)量≥Q30的部分均在96.65%以上, 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量良好。通過BWA (Burrows-Wheeler Aligner)軟件(v0.7.0)將有效數(shù)據(jù)與參考基因組進(jìn)行比對, 比對到參考基因組上的總reads平均比例為71.91%, 覆蓋深度不低于30×的堿基所占比例均高于89.22%, 樣品有效目標(biāo)區(qū)域的測序平均覆蓋度超過435倍。

2.2.2 SNPs的檢測及注釋ZS01和E1、C1、V1與參考基因組進(jìn)行比較, 分別得到19 203、19 235、19 198、19 233個SNPs位點,502A和E2, C2, V2與參考基因組進(jìn)行比較, 分別得到19 256、19 173、20 270、20 177個SNPs位點, 所有樣本約83%的SNPs突變分布于外顯子區(qū)域; 13%的SNPs位點位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游500 bp; 位于轉(zhuǎn)錄終止位點下游500 bp的SNPs位點約占3.4%～3.6%, 所有SNPs共導(dǎo)致2 403個基因的突變。每個樣品檢測到的SNPs位點約有55%是同義突變, 發(fā)生起始密碼子丟失的SNPs均為6個左右, 終止密碼子區(qū)域檢測到的SNPs數(shù)目為71～75。

基于各組的SNPs數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析評估抗生素處理前后菌株的突變程度(圖1)。從PCA圖中可以看出, 在經(jīng)三種抗生素處理后, 不耐鹽菌株502A和耐鹽菌株ZS01均發(fā)生了一定程度的突變, 其中502A發(fā)生的突變更加顯著。經(jīng)紅霉素和萬古霉素處理的ZS01接近于原始菌株, 經(jīng)氯霉素處理后則產(chǎn)生了較大程度的突變; 不耐鹽菌株502A同樣是經(jīng)氯霉素處理之后發(fā)生了較大程度的突變; 且經(jīng)萬古霉素處理后ZS01與502A發(fā)生的突變有較大差異。

圖1 基于SNPs的主成分分析圖

注: O表示耐鹽菌株ZS01; S表示不耐鹽菌株502A; E1, C1, V1, E2, C2, V2依次表示經(jīng)紅霉素、氯霉素、萬古霉素處理后的ZS01和502A

ZS01經(jīng)抗生素處理后, 檢測到E1發(fā)生了53個非同義SNPs, 涉及35個基因, 獨有的突變基因6個。C1檢測到非同義SNPs位點62個, 涉及43個突變基因, 獨有的突變基因有15個。V1處理組發(fā)生的非同義SNPs突變位點61個, 涉及36個突變基因, 其中獨有突變基因8個。三種抗生素處理后都發(fā)生了非同義SNPs突變的基因有19個(圖2), 其中有3個TIGR01741家族蛋白和2個假設(shè)蛋白的編碼基因, 另外包含了串聯(lián)型脂蛋白(7個)、聚集因子B、膜蛋白和凝固酶等與金黃色葡萄球侵染宿主相關(guān)蛋白的編碼基因以及編碼青霉素水解 A 類 β-內(nèi)酰胺酶的耐藥基因等。

502A經(jīng)抗生素處理后, 檢測到E2發(fā)生了50個非同義SNPs, 涉及33個基因, 獨有的突變基因18個。C2檢測到非同義SNPs位點43個, 涉及31個突變基因, 獨有的突變基因有13個。V2處理組發(fā)生的非同義SNPs突變位點92個, 涉及63個突變基因, 獨有的突變基因43個。三種抗生素處理后都發(fā)生了非同義SNPs突變的基因有11個(圖3), 其中有1個TIGR01741家族蛋白和3個假設(shè)蛋白的編碼基因, 另外包含了串聯(lián)型脂蛋白、聚集因子A、聚集因子B和β-溶血素等與金黃色葡萄球侵染宿主相關(guān)蛋白的編碼基因以及編碼葡萄球菌蛋白A、DNA指導(dǎo)的RNA聚合酶亞基β的耐藥基因。

2.2.3 InDels的檢測及注釋ZS01和E1、C1、V1分別檢測到622、627、621、625個InDels位點,502A和E2、C2、V2分別檢測到630、620、641、658個InDels位點, 主要分布于轉(zhuǎn)錄起始位點上游500 bp、轉(zhuǎn)錄終止位點下游500 bp, 所占比例約75%, 發(fā)生在外顯子區(qū)域的InDels位點占13%～15%。InDels突變類型中移碼突變占比較大, 破壞性編碼刪除和插入均各有14～18個, 所有InDels突變位點共導(dǎo)致455個基因的突變。

ZS01經(jīng)抗生素處理后, 檢測到E1發(fā)生了5個基因上的5個InDels突變, 沒有獨有的基因; C1檢測到8個基因的8個InDels突變, 獨有的InDels突變基因分別編碼莢膜多糖5型生物合成蛋白、N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、凝集因子B和假設(shè)蛋白; V1檢測到8個基因的8個InDels突變, 其中MBL折疊金屬水解酶、包含CHAP域的蛋白和2個假設(shè)蛋白基因上的InDels突變是萬古霉素處理組獨有的。三種處理均檢測到的InDels突變基因有3個, 分別編碼串聯(lián)型脂蛋白、膜蛋白和DNA結(jié)合反應(yīng)調(diào)控因子(圖4)。

502A經(jīng)抗生素處理后, 檢測到E2發(fā)生了5個基因上的6個InDels突變, 4個獨有突變基因分別編碼TIGR01741家族蛋白、假設(shè)蛋白、MSCRAMM家族黏附素 SdrE和凝集因子A; C2檢測到4個基因的4個InDels突變, 2個獨有的InDels突變基因分別編碼莢膜多糖5型生物合成蛋白cap5A和MBL折疊金屬水解酶; V2檢測到4個基因上的4個InDels突變, 其中N-乙?；D(zhuǎn)移酶和生物膜操縱子 icaADBC HTH 型負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子 IcaR蛋白基因上的InDels突變是萬古霉素處理組獨有的。三種處理均檢測到的1個InDels突變基因編碼TIGR01741家族蛋白(圖5)。

圖2 抗生素處理后S. aureus ZS01發(fā)生非同義SNPs突變的基因

圖3 抗生素處理后S. aureus 502A發(fā)生非同義SNPs突變的基因

圖4 抗生素處理后S. aureus ZS01發(fā)生InDels突變的基因

圖5 抗生素處理后S. aureus 502A發(fā)生InDels突變的基因

2.2.4 SVs的檢測及注釋ZS01和E1、C1、V1分別檢測到153、154、152、154個SVs位點,502A和E2、C2、V2分別檢測到157、152、150、158個SVs位點, 其中缺失類型的結(jié)構(gòu)變異占比范圍在53%～58%, 插入類型占21%～24%, 另外各樣品分別存在21%～24%的易位類型。所有SVs位點共導(dǎo)致了144個基因的突變。

ZS01經(jīng)抗生素處理后, E1檢測到的13個SVs突變涉及11個基因, 其中3個獨有突變基因分別編碼HPr激酶/磷酸化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶和假設(shè)蛋白; C1檢測到12個基因上發(fā)生了13個SVs突變, 其中獨有的5個突變基因編碼6-磷酸-β-葡糖苷酶、過氧化物酶抑制劑、糖結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、二酰甘油激酶和假設(shè)蛋白。V1檢測到10個基因上的11個SVs突變, 其中2個獨有SVs突變基因編碼ISL3家族轉(zhuǎn)座酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶。三種抗生素處理都發(fā)生SVs突變的基因有5個, 分別編碼黃酮素家族蛋白、?；d體蛋白、DNA結(jié)合反應(yīng)調(diào)控因子和2個假設(shè)蛋白(圖6)。

502A經(jīng)抗生素處理后, E2檢測到的8個SVs突變涉及8個基因, 其中3個獨有突變基因分別編碼糖結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子、MutS家族DNA錯配修復(fù)蛋白和聚集因子B; C2檢測到6個基因上的6個SVs突變, 沒有獨有的SVs突變基因。V2檢測到7個基因上的7個SVs突變, 2個獨有SVs突變基因編碼串聯(lián)型脂蛋白和假設(shè)蛋白。三種抗生素處理都發(fā)生SVs突變的基因有2個, 分別編碼二肽酶PepV和羧酸酯酶/脂肪酶家族蛋白(圖7)。

2.2.5 抗生素處理后兩菌株突變情況對比 對各處理組檢測到的SNPs、InDels和SVs突變涉及的所有基因進(jìn)行統(tǒng)計, 存在多種類型的突變發(fā)生在同一基因上的情況。E1共涉及45個基因的突變, E2涉及42個基因的突變, 其中17個基因是二者共有的。其中串聯(lián)型脂蛋白和TIGR01741 家族蛋白相關(guān)突變基因達(dá)41%, 另外包含了與致病性相關(guān)的莢膜多糖合成蛋白、聚集因子、凝固酶和β-通道形成溶細(xì)胞素基因的突變等。與E2相比, E1獨有的突變基因中有很多是編碼串聯(lián)型脂蛋白和MSCRAMM家族黏附素的, 且有ABC轉(zhuǎn)運蛋白相關(guān)的蛋白基因突變; 而E2獨有突變基因中沒有用于編碼串聯(lián)型脂蛋白的。C1發(fā)生的所有類型突變共涉及54個基因, C2涉及40個基因, 其中二者共有的基因20個, 包含了串聯(lián)型脂蛋白、膜蛋白、纖連蛋白結(jié)合蛋白、聚集因子和莢膜多糖等多個與金黃色葡萄球菌致病性相關(guān)的基因; 與C2相比, C1突變中包含了更多編碼膜蛋白、纖連蛋白結(jié)合蛋白、凝固酶以及MSCRAMM家族黏附素等與金黃色葡萄球菌侵染宿主有關(guān)的獨有基因。V1發(fā)生的突變涉及50個基因, V2涉及72個基因, 其中21個基因是二者共有的, 包含了細(xì)胞壁代謝傳感器組氨酸激酶WalK以及串聯(lián)型脂蛋白、纖連蛋白結(jié)合蛋白、凝集因子、β-通道形成溶細(xì)胞素等致病相關(guān)蛋白的編碼基因。相比于V1, V2獨有的突變基因更多, 且有谷氨酰胺合成酶、RNA聚合酶sigma因子SigA等與細(xì)胞壁成分相關(guān)的蛋白和多個核糖體結(jié)合蛋白編碼基因上的突變(圖8)。

圖6 抗生素處理后S. aureus ZS01發(fā)生SVs突變的基因

2.2.6 KEGG富集分析 對E1、C1、V1和E2、C2、V2的SNPs、InDels、SVs突變基因進(jìn)行KEGG富集分析, 分別注釋了11、18、11、12、14、37個突變基因, 存在多種突變發(fā)生在同一基因上的情況, V2統(tǒng)計到最多的KEGG注釋突變基因。分析結(jié)果顯示突變基因富集于人類疾病, 代謝, 細(xì)胞過程, 環(huán)境信息處理和基因信息處理5個一級分類, 其中人類疾病和代謝相關(guān)通路占有較大比例; 在二級分類中, 6個處理組都有很多突變基因富集在疾病感染通路上, 紅霉素和氯霉素處理組有較多突變基因與脂代謝相關(guān)(圖9)。

紅霉素處理組中的β-通道形成溶細(xì)胞素、MSCRAMM家族黏附素突變使金黃色葡萄球菌更具有感染性; 氯霉素處理組的纖連蛋白結(jié)合蛋白、等富集在細(xì)菌入侵上皮細(xì)胞的通路上, 葡萄球菌蛋白A、凝集因子、等也與金黃色葡萄球菌感染相關(guān)。萬古霉素處理后MBL折疊金屬水解酶、、凝集因子等基因富集在金黃色葡萄球菌感染通路上。

圖8 編碼不同蛋白的突變基因發(fā)生突變頻次的統(tǒng)計

3 討論

本研究對耐鹽菌株ZS01和不耐鹽菌株502A分別進(jìn)行紅霉素、氯霉素和萬古霉素的脅迫處理, 獲得最高耐受濃度下的菌沉淀進(jìn)行重測序, 從而得到耐鹽菌株與不耐鹽菌株在抗生素耐藥機制方面的相似和差異之處。結(jié)果表明,502A經(jīng)抗生素處理后發(fā)生突變的程度大于ZS01, 說明耐鹽菌株本身耐受抗生素的能力可能強于不耐鹽菌株; 且相較于紅霉素和萬古霉素, 在經(jīng)過氯霉素處理后兩株菌發(fā)生了較大程度的突變, 出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是氯霉素的使用多于其余兩種抗生素, 在氯霉素長期使用過程中, 金黃色葡萄球菌容易發(fā)生適應(yīng)性變化; 萬古霉素處理后的兩株菌發(fā)生突變差異較大。6個處理組都出現(xiàn)了較多串聯(lián)型脂蛋白基因相關(guān)的突變, 引起菌株致病性的變化, 與尚偉龍的研究中闡述的抗生素誘導(dǎo)串聯(lián)型脂蛋白表達(dá)從而增強MRSA的致病性(尚偉龍, 2019)類似。已有研究表明MRSA的耐藥性與生物膜的形成能力可能存在相關(guān)性(張偉松, 2014), 本研究6個處理組的突變基因中均有部分與脂代謝通路相關(guān), 尤其在紅霉素和氯霉素處理組中占比更大, 表明紅霉素和氯霉素可能通過影響金黃色葡萄球菌脂類的代謝引起其耐藥性的變化, 且處理組都出現(xiàn)了TIGR01741家族蛋白和假設(shè)蛋白基因的突變, 因此推測二者與金黃色葡萄球菌的致病性和耐藥性相關(guān), 其準(zhǔn)確功能有待進(jìn)一步研究。除此之外, 凝集因子B、纖連結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白、凝固酶、膜蛋白等與金黃色葡萄球菌侵染細(xì)胞相關(guān)蛋白的基因突變在ZS01抗生素處理后均有檢出(Liu, 2017; Lacey, 2019; Li, 2019), 這些突變導(dǎo)致了金黃色葡萄球菌毒力狀態(tài)的改變(圖10),502A經(jīng)過幾種抗生素處理后均檢測到DNA依賴性RNA聚合酶基因上的突變, 這種突變可以抑制一系列抗生素的活性。

圖9 E1、E2、C1、C2、V1、V2突變基因的KEGG富集分析

圖10 金黃色葡萄球菌侵染細(xì)胞重要途徑

注: 聚集因子A、B可與宿主細(xì)胞表面的纖維蛋白原特異性結(jié)合; 凝固酶等分泌蛋白與細(xì)胞表面的纖維蛋白原有較弱的結(jié)合能力; 膜蛋白則可與宿主細(xì)胞表面的彈性蛋白特異性結(jié)合

紅霉素處理后, 耐鹽菌株檢測到編碼ABC轉(zhuǎn)運蛋白的突變基因, ABC轉(zhuǎn)運蛋白是一種外排系統(tǒng), 可將抗生素排出體外, 從而產(chǎn)生耐藥性(丁兆鳳, 2010), 不耐鹽菌株則沒有檢測到相關(guān)突變。氯霉素處理后, 耐鹽菌株檢測到更多編碼膜蛋白、纖連蛋白結(jié)合蛋白、凝固酶以及MSCRAMM家族黏附素等與金黃色葡萄球菌侵染宿主有關(guān)的獨有基因, 可能說明氯霉素脅迫后, 耐鹽菌株的致病性受到了更大程度的影響。萬古霉素處理后, 除毒力因子編碼基因的突變外, 還出現(xiàn)了細(xì)胞壁代謝傳感器組氨酸激酶WalK的突變, 該突變可能導(dǎo)致金黃色葡萄球菌對萬古霉素敏感性的降低, 從而增強菌株對萬古霉素的耐受能力(Zhu, 2021)。V2還檢測到谷氨酰胺合成酶、RNA聚合酶sigma因子SigA等與細(xì)胞壁成分相關(guān)的編碼基因突變, 已有研究表明二者在萬古霉素耐藥性中起著重要作用(代洪等, 2003), V1未檢測到相關(guān)突變, 所以推測萬古霉素處理影響了耐鹽菌株和不耐鹽菌株侵染宿主的能力, 不耐鹽菌株還因細(xì)胞壁成分的相關(guān)突變提高了萬古霉素耐受能力。

4 結(jié)論

耐鹽菌株502A經(jīng)抗生素處理后發(fā)生突變的程度大于標(biāo)準(zhǔn)菌株ZS01; 相較于紅霉素和萬古霉素, 在經(jīng)過氯霉素處理后兩株菌發(fā)生了更大程度的突變。紅霉素、氯霉素和萬古霉素主要影響了金黃色葡萄球菌侵染細(xì)胞的能力, 紅霉素和氯霉素可能通過影響金黃色葡萄球菌脂類的代謝引起其耐藥性的變化。另外, 三種抗生素處理均出現(xiàn)了較多TIGR01741家族蛋白和假設(shè)蛋白基因的突變, 推測與菌株的耐藥性和致病性相關(guān)。耐鹽金黃色葡萄球菌可通過外排系統(tǒng)產(chǎn)生紅霉素耐藥性; 不耐鹽菌株還會因為細(xì)胞壁成分相關(guān)基因的突變提高萬古霉素耐受性。

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Analysis of the drug resistance mechanism ofbased on whole-genome resequencing technology

ZHANG Zhi-Xuan1, WANG Zi-Yan1, WANG Ze1, LIU Yan1, LIU Song-Yi1, QIAN Peng-Yu2, YE Huan2, HAN Jiao-Jiao1, ZHOU Jun1, SU Xiu-Rong1

(1. School of Marine Science, Ningbo University, Ningbo 315211, China; Zhejiang Zhenghegu Biotechnology Co., Ltd, Ningbo 315048, China)

is the main common pathogen in coastal waters, and could seriously threatens the safety of the contactees. Antibiotic treatment is an important method for the treatment ofinfection; and however, the occurrence of its drug resistance has been highly concerned. In this paper, a combination of whole-genome resequencing and KEGG enrichment analysis was combined used to analyze the resistance mechanism of salt-tolerantZS01 and salt-intolerant502A treated with erythromycin, chloramphenicol, and vancomycin. Results showed that compared withZS01,502A had showed more mutations after antibiotic treatment, and both of them had more variation after treated with chloramphenicol. Erythromycin, chloramphenicol and vancomycin treatments affected mainly the pathogenicity of. Erythromycin and chloramphenicol may affect the lipid metabolism ofand make caused changes in drug resistance. In addition, there were many mutations of TIGR01741 family proteins and hypothetical protein genes in the three antibiotic treatments, which are speculated to be related to the drug resistance and pathogenicity of the strains. Salt-tolerantcould develop erythromycin resistance through efflux system, and salt-intolerant strain also could increase their tolerance to vancomycin due to mutations in genes related to cell wall components. The results of this study can provide basic data for understanding the study of the resistance mechanism of salt-tolerant and salt-intolerantand the effect of antibiotics on the pathogenicity of

; whole-genome resequencing; KEGG enrichment analysis; drug resistance mechanism; pathogenicity

*國家重點研發(fā)計劃資助項目, 2017YFC1404505號; 海洋經(jīng)濟創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范專項, 甬海辦[2016]71號。張旨軒, 碩士研究生, E-mail: 363141184@qq.com; 同等貢獻(xiàn)第一作者: 王子言, 博士研究生, E-mail: ziyan_wang2021@163.com

蘇秀榕, 博士生導(dǎo)師, 教授, E-mail: suxiurong@nbu.edu.cn

2021-09-24,

2021-10-25

Q933; Q938.8; X55

10.11693/hyhz20210900218