謝林青 曹 為 蔣鳳華 李景喜 孫承君, 2

印度洋深海熱液區(qū)貽貝足絲結(jié)構(gòu)和性能特征研究*

謝林青1曹 為1蔣鳳華1李景喜1孫承君1, 2①

(1. 自然資源部第一海洋研究所 海洋生物資源與環(huán)境研究中心 自然資源部海洋生態(tài)環(huán)境科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東青島 266100; 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室 海洋藥物與生物制品功能實(shí)驗(yàn)室 山東青島 266200)

貽貝營(yíng)半固著生活, 依靠足絲將自己牢固地黏附在底物上。足絲的結(jié)構(gòu)和性能對(duì)貽貝的正常生命活動(dòng)至關(guān)重要。為研究熱液區(qū)極端環(huán)境下深海貽貝足絲的結(jié)構(gòu)和性能, 采集了印度洋龍旂深海熱液區(qū)的貽貝()足絲, 對(duì)其力學(xué)特性、結(jié)構(gòu)特征和組分進(jìn)行了分析。力學(xué)性能測(cè)試發(fā)現(xiàn)與近海貽貝()相比,足絲的力學(xué)性能表現(xiàn)為模量小、彈性小、彈性緩沖較差。傅里葉變換紅外光譜(Fourier Transform infrared spectrometer, FT-IR)分析顯示深海熱液區(qū)貽貝足絲的主要成分是膠原蛋白, 官能團(tuán)特征顯示足絲蛋白含大量的β折疊結(jié)構(gòu), 足絲近端和遠(yuǎn)端的二級(jí)結(jié)構(gòu)梯度較小。掃描電鏡(scanning electron microscope, SEM)結(jié)果顯示熱液區(qū)貽貝足絲表面光滑, 內(nèi)部結(jié)構(gòu)呈纖維狀整齊排列。氨基酸分析結(jié)果顯示深海熱液區(qū)貽貝足絲中甘氨酸、脯氨酸含量高于近海貽貝足絲, 這可能會(huì)增加足絲蛋白中三螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性, 使足絲在熱液環(huán)境中保持性能穩(wěn)定。熱液區(qū)深海貽貝足絲獨(dú)特的力學(xué)性能、結(jié)構(gòu)特征和組分特征為研究熱液區(qū)貽貝的環(huán)境適應(yīng)性提供了一定的基礎(chǔ)。

熱液區(qū)貽貝; 足絲; 力學(xué)性能; 傅里葉變換紅外光譜(Fourier Transform infrared spectrometer, FT-IR); 掃描電鏡; 氨基酸分析

貽貝是一種營(yíng)半固著生活的軟體動(dòng)物, 主要生活在近海的潮間帶和潮下帶等地。近些年來(lái)研究發(fā)現(xiàn), 在深海冷泉(Cosel, 1998)、大洋熱液區(qū)(Duperron, 2019)也有貽貝生活的痕跡。為了對(duì)抗海洋惡劣的生存環(huán)境, 貽貝在漫長(zhǎng)的進(jìn)化歷程中形成了一種特殊的固定器——足絲, 成為研究海洋環(huán)境中生物黏附和梯度功能材料的模式生物(Waite, 2005)。目前對(duì)于足絲的研究主要集中在足絲的生物黏附機(jī)制和仿生材料(剛性與韌性兼顧的梯度材料)的開(kāi)發(fā)方面。近海貽貝的足絲主要分為兩部分: 絲和黏附盤(pán), 而絲又可分為遠(yuǎn)端剛性區(qū)和近端彈性區(qū), 貽貝通過(guò)足絲在潮濕或水下環(huán)境中能夠牢固地黏附在多種底物上(圖1a)(Aldred, 2006; Harrington, 2018)。足絲主要由蛋白質(zhì)組成(大約97%), 目前從貽貝足絲中已經(jīng)鑒定出至少十一種主要的黏附蛋白: 膠原蛋白(precollagen, preCOL)、足絲基質(zhì)蛋白和貽貝足蛋白(Mussel foot protein, Mfp)等(Ravindranath, 1972; Sun, 2002)。三種膠原蛋白(preCOL-D, -P和-NG)構(gòu)成了足絲內(nèi)部的主體, 其中preCOL-D和-P膠原蛋白呈梯度分布, 兩者具有不同的力學(xué)特征。這種不同的力學(xué)特征主要來(lái)自于preCOL-D和-P的側(cè)翼結(jié)構(gòu)域, 它們分別類(lèi)似于剛性蜘蛛絲和彈性蠶絲蛋白(Waite, 2002; Hassenkam, 2004)。這種具有不同力學(xué)特征蛋白的梯度分布使得足絲具有極好的韌性, 在遭遇外力作用時(shí)足絲能夠在短時(shí)間內(nèi)吸收大量能量來(lái)實(shí)現(xiàn)力量緩沖(Waite, 2002)。貽貝足蛋白主要分布在足絲的表層和黏附盤(pán)中, 對(duì)貽貝足蛋白(Mfp)的表征分析發(fā)現(xiàn)Mfp-1、-3和-5中含有大量的3,4-二羥基-L-苯丙氨酸(dihydroxyphenylalani, DOPA)(Hassenkam, 2004)。研究發(fā)現(xiàn)貽貝足絲的強(qiáng)黏附能力與DOPA有關(guān), 足蛋白中的DOPA通過(guò)參與金屬螯合(Zeng, 2010)、共價(jià)結(jié)合(Yu, 2013)以及氫鍵結(jié)合(Kim, 2017)等方式來(lái)增強(qiáng)足絲的黏附能力。但是由于我們對(duì)分子層面和多維結(jié)構(gòu)材料了解不夠深入, 且貽貝足蛋白DOPA中鄰苯二酚本身不穩(wěn)定, 容易氧化, 因此仿足絲蛋白黏附材料的應(yīng)用受到很大限制。近海貽貝足絲表層覆蓋著4～5 μm厚的保護(hù)性角質(zhì)層, 其中Mfp-1是主要成分, 由Mfp-1組成的角質(zhì)層既能保護(hù)足絲內(nèi)部又能承受內(nèi)部所表現(xiàn)的近70%的應(yīng)變(Harrington, 2018)。這種角質(zhì)層結(jié)構(gòu)使得具梯度力學(xué)性能的足絲有優(yōu)異的抗接觸形變和損壞的能力, 同時(shí)在海洋環(huán)境中也能夠幫助足絲抵抗海水侵蝕和細(xì)菌感染(Kim, 2016)。因此近海貽貝足絲的結(jié)構(gòu)和功能對(duì)其適應(yīng)環(huán)境具有重要作用。

圖1 貽貝和足絲圖

注: a. 貽貝足絲結(jié)構(gòu)示意圖; b. 近海貽貝(); c. 深海貽貝()

隨著對(duì)海洋特殊生境研究的深入, 研究發(fā)現(xiàn)深海貽貝通常在大洋深海熱液區(qū)生物中占主體地位。Distel等(2000)提出近海貽貝可能通過(guò)木頭、鯨落等途徑轉(zhuǎn)移到深海定居, 成為深海貽貝的祖先。Sun等(2017)通過(guò)基因系統(tǒng)發(fā)育研究發(fā)現(xiàn)近海菲律賓偏頂蛤()是深海偏頂蛤()的祖先, 深海貽貝()是近海貽貝()在一億多年前移居到深海進(jìn)化而來(lái)的。到目前為止, 科學(xué)家已經(jīng)在印度洋、大西洋以及太平洋多個(gè)深海熱液區(qū)都發(fā)現(xiàn)了深海貽貝, 對(duì)這些深海貽貝的研究主要集中在深海貽貝共生菌(Duperron, 2016)、基因組和系統(tǒng)發(fā)育(Sun, 2017)等方面。最近Zhou等(2020)、李景喜等(2017)和Bebianno等(2018)分別對(duì)西太平洋、西南印度洋和大西洋中脊等地的熱液區(qū)貽貝體內(nèi)的重金屬及指示物進(jìn)行分析, 研究熱液區(qū)貽貝在深海熱液環(huán)境下的重金屬適應(yīng), 還有一些學(xué)者從生物節(jié)律(Mat, 2020)、種群調(diào)節(jié)因素(Metaxas, 2015)等方向?qū)ι詈嵋簠^(qū)貽貝展開(kāi)研究分析, 從進(jìn)化、種群等方面探索熱液區(qū)貽貝對(duì)深海熱液環(huán)境的適應(yīng)性。由于熱液區(qū)熔巖噴口中心溫度極高, 能達(dá)到350～400 °C, 以噴口為中心向外圍溫度逐漸降低, 生物也隨著噴口溫度向四周輻射分布(魏曼曼等, 2012)。這種奇特的極端生存環(huán)境(高溫、高壓、低營(yíng)養(yǎng)、高鹽等)也造就了熱液區(qū)獨(dú)特的貝類(lèi)群落和生態(tài)習(xí)性等。但是目前對(duì)于熱液區(qū)深海貽貝足絲的結(jié)構(gòu)和功能研究非常少。

貽貝足絲結(jié)構(gòu)和功能是探索深海貽貝適應(yīng)熱液區(qū)極端環(huán)境的重要方面, 因此為探索熱液區(qū)深海貽貝足絲的結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn), 本文采集了西南印度洋熱液區(qū)深海貽貝足絲, 利用光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡對(duì)印度洋熱液區(qū)深海貽貝足絲進(jìn)行形貌表征, 通過(guò)力學(xué)性能測(cè)試發(fā)現(xiàn)深海熱液區(qū)貽貝足絲不同于近海貽貝足絲的力學(xué)性能表現(xiàn)。然后采用氨基酸分析和傅里葉變換紅外光譜(Fourier Transform infrared spectrometer, FT-IR)對(duì)足絲組分進(jìn)行分析。結(jié)果顯示印度洋熱液區(qū)深海貽貝足絲在結(jié)構(gòu)、組成和力學(xué)性能方面與近海貽貝足絲存在明顯差異。這為深海貽貝足絲結(jié)構(gòu)和功能的探索以及研究印度洋熱液區(qū)深海貽貝的生物適應(yīng)性提供了一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料準(zhǔn)備

熱液區(qū)深海貽貝, 深海偏頂蛤?qū)? 于2019年4月利用無(wú)人潛器海龍II ROV采集于西南印度洋中脊龍旂熱液區(qū)(37°82′S, 49°58′E), 采集水深2 700 m。將ROV采集的熱液區(qū)深海貽貝放到解剖盤(pán)內(nèi), 將貽貝剖開(kāi), 將足絲從根部取出后馬上置于50 mL一次性離心管中, 密封保存在4 °C冰箱內(nèi)。去除所有足絲的深海貽貝則馬上轉(zhuǎn)移至-80 °C超低溫冰箱中冷凍保存。近海貽貝, 又稱(chēng)紫貽貝, 采集自青島近海(36°10′N(xiāo), 120°54′E), 采集后馬上將轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室天然海水槽中, 利用橡皮筋將貽貝松弛地簡(jiǎn)單固定到纏有魚(yú)線的塑料底板上, 通氣培養(yǎng), 采集足絲, 通常一星期內(nèi)可反復(fù)多次采集其足絲, 采集后的足絲用過(guò)濾海水沖洗去除表面雜質(zhì)后密封, 置于4 °C冰箱保存。本研究所采用的深、近海貽貝足絲分別取自至少10只熱液區(qū)深海貽貝和近海貽貝, 每只貽貝取用3～5條足絲。貽貝圖片如圖1b和圖1c所示。

1.2 力學(xué)檢測(cè)

利用配備測(cè)量功能的體式顯微鏡(SMZ1270, Nikon)觀察熱液區(qū)貽貝和近海貽貝的足絲外觀形貌, 并測(cè)量其直徑以及長(zhǎng)度, 然后再對(duì)足絲的力學(xué)性能進(jìn)行測(cè)量表征。本研究采用電子拉力試驗(yàn)機(jī)(Criterion C42, MTS)對(duì)足絲力學(xué)性能進(jìn)行測(cè)試, 采用微量拉伸夾具和模板。在測(cè)試前先將足絲的兩端通過(guò)雙面膠和小塊A4紙配合固定在氣壓式夾具上, 夾具的運(yùn)行氣壓保證在0.4 MPa左右, 防止測(cè)試過(guò)程中足絲打滑和夾具夾壞足絲。拉伸試驗(yàn)過(guò)程中通過(guò)微淋霧方式對(duì)足絲進(jìn)行保濕, 足絲測(cè)試長(zhǎng)度保持在5～10 mm之間, 以便使夾具兩端保留足夠長(zhǎng)的固定長(zhǎng)度, 減少實(shí)驗(yàn)誤差, 所有測(cè)試速度均設(shè)為5 mm/min。斷裂拉伸測(cè)試進(jìn)行至足絲斷裂(Vaccaro, 2001)。進(jìn)行應(yīng)力-應(yīng)變循環(huán)測(cè)試足絲緩沖能力時(shí), 先將足絲拉伸至20%伸長(zhǎng)后再按實(shí)驗(yàn)速度返回初始狀態(tài), 即0～20%～0為一次拉伸循環(huán), 反復(fù)循環(huán)3次。為保證足絲的恢復(fù)時(shí)間, 每?jī)蓚€(gè)循環(huán)間隔30 min以上。通過(guò)彈性模量對(duì)足絲力學(xué)性能進(jìn)行分析, 彈性模量是足絲拉伸過(guò)程中彈性變形階段應(yīng)力-應(yīng)變曲線的直線段的斜率, 用應(yīng)力差值/應(yīng)變差值的形式進(jìn)行計(jì)算。應(yīng)力為單位面積上的所受的力, 應(yīng)變?yōu)樾巫兞颗c原來(lái)的長(zhǎng)度的比值。對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(= 0.05), 以評(píng)估統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 FT-IR分析

紅外光譜是蛋白結(jié)構(gòu)分析的重要的方法之一(丁靜等, 2020), 它能夠提供許多關(guān)于官能團(tuán)的信息, 可以幫助確定部分乃至全部分子類(lèi)型及結(jié)構(gòu)。為了檢測(cè).和.足絲的基本組成, 本研究采用FT-IR (Spotlight 400, PerkinElmer)進(jìn)行結(jié)構(gòu)檢測(cè)分析(Hagenau, 2009)。為檢測(cè)足絲內(nèi)部成分, 在實(shí)驗(yàn)前先對(duì)保存的貽貝足絲近端和遠(yuǎn)端進(jìn)行縱切面處理, 暴露出足絲內(nèi)部后, 冷凍干燥12 h保持其原狀備用。在足絲紅外檢測(cè)前, 先進(jìn)行4 000～1 000 cm–1波數(shù)紅外光譜掃描扣除環(huán)境水氣背景, 校準(zhǔn)儀器背景值。然后將干燥后的足絲放置在FT-IR載物臺(tái)上, 設(shè)置好儀器參數(shù), 分辨率: 8 cm–1; 每像素掃描: 16; 像素尺寸: 6.25 μm; 干涉儀速度: 1.0 cm/s; 樣品尺寸: 300×300 μm, 進(jìn)行4 000～2 500 cm–1和1 800～1 000 cm–1波數(shù)紅外光譜掃描。

1.4 掃描電鏡(scanning electron microscope, SEM)和元素分布

利用 SEM (Regulus 8100, Hitachi)對(duì)和足絲的內(nèi)外微觀形貌進(jìn)行分析表征。首先將之前冷凍干燥后的樣品放入噴金裝置(ION SPUTTER MC 1000, Hitachi)中, 10 mA下噴金30 s, 通過(guò)噴金增加足絲的導(dǎo)電性從而增強(qiáng)電鏡觀察效果。然后將噴金樣品用雙面碳導(dǎo)電膠帶固定于掃描電鏡的樣品臺(tái)上, 進(jìn)行電鏡觀察, 同時(shí)對(duì)足絲成像區(qū)表面和內(nèi)部進(jìn)行能譜(Energy Dispersive Spectrometer, EDS)分析, 分析選擇區(qū)域的元素組成。

1.5 氨基酸組成

通過(guò)傳統(tǒng)的酸水解后用色譜法分析.足絲氨基酸含量組成(吳怡等, 2021)。本研究采用異硫氰酸苯酯柱前衍生法進(jìn)行分析。首先準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥后.足絲20 mg放于安培瓶中, 加入10 mL 6 mol/L的鹽酸, 充入氮?dú)夂竺芊狻Ｔ?10 °C烘箱水解24 h后減壓蒸干, 再用0.02 mol/L鹽酸定容至10 mL。量取制備好的足絲水解樣品200 μL, 置于1 mL離心管中, 加入100 μL三乙胺溶液, 100 μL異硫氰酸苯酯, 混勻后室溫放置1 h。然后加入400 mL正己烷振搖后放置10 min, 取下層溶液, 用0.45 μm濾膜過(guò)濾后利用HPLC進(jìn)行分離分析。儀器采用Agilent1100液相色譜儀, 色譜柱: 4.6×250 mm, 5μ Venusil-AA氨基酸分析柱; 柱溫: 40 °C, 檢測(cè)波長(zhǎng): 254 nm, 流動(dòng)相A: 0.1 mol/L醋酸鈉(含7%乙腈), 流動(dòng)相B: 80%乙腈, 流速1 mL/min梯度洗脫。通過(guò)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)獲取洗脫數(shù)據(jù)后分析處理得到足絲中氨基酸含量組成。

2 結(jié)果與討論

2.1 基礎(chǔ)參數(shù)測(cè)量

外表呈鈍紡錘狀, 殼色多呈紅棕色、深黃色, 選用的成體殼長(zhǎng)約7～8 cm、殼高約4 cm (圖1c); 近海.多呈黑褐色、半葉狀, 成體殼長(zhǎng)約長(zhǎng)5～6 cm、殼高約3 cm (圖1b), 比熱液區(qū)貽貝體型略小。.足絲長(zhǎng)度平均為14～24 mm, 直徑為200～450 μm;.足絲長(zhǎng)度一般在40～50 mm, 直徑在50～100 μm之間(李希涓等, 2014), 其他近海貽貝足絲均表現(xiàn)為細(xì)長(zhǎng)狀(Bouhlel, 2017)。通過(guò)圖2在體式顯微鏡下觀測(cè)的貽貝足絲形貌, 可以發(fā)現(xiàn).足絲相較于近海.足絲明顯較為粗短, 黏附盤(pán)也相對(duì)較厚。

圖2 貽貝足絲光學(xué)顯微圖片

注: a.足絲; b.足絲; 比例尺: 1 000 μm

2.2 力學(xué)性質(zhì)測(cè)量

力學(xué)測(cè)試結(jié)果顯示.足絲的彈性模量平均為5～50 MPa, 伸長(zhǎng)率平均約70% (圖3a)。作為對(duì)比的.足絲彈性模量大約10～200 Mpa, 伸長(zhǎng)率約150%。有文獻(xiàn)研究表明.足絲彈性模量大約200 Mpa左右, 伸長(zhǎng)率高達(dá)200% (Waite, 2002), 其他幾種近海貽貝如、足絲彈性模量分別大約為400、300 Mpa (Lucas, 2002; Pearce, 2009)。通過(guò)對(duì)比, 可以發(fā)現(xiàn).足絲彈性模量明顯小于近海., 伸長(zhǎng)率不足.足絲的一半, 并且沒(méi)有明顯的屈服點(diǎn)。貽貝足絲屬于一類(lèi)軟而韌的生物有機(jī)材料, 這類(lèi)材料的力學(xué)性能特點(diǎn)是模量小、伸長(zhǎng)大。彈性模量越小, 說(shuō)明材料剛度越小, 柔性越好, 越容易發(fā)生變形。由于彈性模量主要受材料的組成鍵合方式、晶體結(jié)構(gòu)、化學(xué)成分、微觀組織、溫度等影響, 因此深海貽貝足絲模量和伸長(zhǎng)率明顯小于近海貽貝足絲的現(xiàn)象說(shuō)明熱液區(qū)特殊的環(huán)境可能對(duì)熱液區(qū)貽貝足絲的組成結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響, 從而造成熱液區(qū)貽貝足絲性能與近海貽貝足絲性質(zhì)的不同。

圖3 深海貽貝足絲拉伸和循環(huán)曲線

注: a.足絲拉伸曲線; b. 應(yīng)力-應(yīng)變循環(huán)曲線

通過(guò)應(yīng)力-應(yīng)變循環(huán)測(cè)量結(jié)果(表1), 我們發(fā)現(xiàn).足絲在3次應(yīng)力-應(yīng)變循環(huán)過(guò)程中, 足絲彈性模量逐漸變大。而.足絲在第二次循環(huán)時(shí)彈性模量從600 Mpa急劇下降到100 Mpa并表現(xiàn)出屈服點(diǎn)消失, 當(dāng)應(yīng)變超過(guò)其屈服點(diǎn)時(shí)表現(xiàn)出顯著的應(yīng)力軟化, 即第二次循環(huán)的初始模量明顯降低。足絲遲滯緩沖也隨之變小(Waite, 2002), 保留了17%的初始剛度, 第三次循環(huán)僅恢復(fù)到原來(lái)剛度的30%, 說(shuō)明近海貽貝足絲經(jīng)過(guò)一定的時(shí)間可以恢復(fù)和保持彈性, Vaccaro等(2001)發(fā)現(xiàn)近海貽貝足絲的屈服點(diǎn)在24 h后可以恢復(fù)。.足絲第一次循環(huán)的彈性模量約40 Mpa, 模量在接下來(lái)的循環(huán)2和循環(huán)3呈現(xiàn)增大趨勢(shì), 沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的彈性恢復(fù)。考慮到.足絲伸長(zhǎng)率較低, 所以將足絲應(yīng)變循環(huán)設(shè)置為0～20%～0的應(yīng)變, 由于.足絲并沒(méi)有明顯的屈服點(diǎn), 也沒(méi)有出現(xiàn).足絲循環(huán)過(guò)程中的應(yīng)力軟化以及剛度恢復(fù), 因此.足絲在拉伸過(guò)程中產(chǎn)生了一定的塑性變形, 這部分變形是不可恢復(fù)的。.足絲在第二、三次循環(huán)過(guò)程中前期并不需要明顯的外力即可拉伸, 這與形變有關(guān), 中后段其拉伸應(yīng)力變大, 彈性模量也隨之變大, 足絲的剛度則越來(lái)越強(qiáng)(圖3b), 這與其斷裂前只有少量宏觀變形發(fā)生形成斷裂相對(duì)應(yīng)(圖3a陰影區(qū)), 這也能說(shuō)明熱液區(qū)貽貝足絲組成結(jié)構(gòu)與近海貽貝足絲存在差異。貽貝足絲的結(jié)構(gòu)組分是和它的力學(xué)性能、生活環(huán)境相適應(yīng)的。深海貽貝足絲這種獨(dú)特力學(xué)性能是熱液區(qū)貽貝長(zhǎng)期適應(yīng)深海環(huán)境的結(jié)果。深海熱液環(huán)境具有高壓、高溫、高鹽、以及受重金屬影響較大等特點(diǎn), 貽貝所處區(qū)域深海環(huán)境流場(chǎng)又相對(duì)穩(wěn)定, 海流較弱, 也不受風(fēng)浪影響, 這與近海貽貝需要適應(yīng)頻繁的近海潮汐外力作用和泥沙摩擦作用非常不同, 因此深海貽貝足絲對(duì)抗頻繁的周期性外力作用的壓力可能會(huì)相對(duì)減小。所以適應(yīng)條件相對(duì)溫和的深海環(huán)境, 深海貽貝的足絲變得比較粗短且變形能力弱, 在力學(xué)性能方面則表現(xiàn)為模量小, 伸長(zhǎng)率小。

表1 貽貝足絲應(yīng)力-應(yīng)變循環(huán)彈性模量(MPa)

Tab.1 Stress-strain cyclic modulus of mussel byssus

2.3 SEM和EDS元素分布

貽貝足絲SEM結(jié)果顯示(圖4a, 4b),.足絲表面相對(duì)光滑整潔, 而.足絲表面呈現(xiàn)出崎嶇不平的凹凸?fàn)顗艤闲蚊? 存在大大小小的顆粒狀結(jié)構(gòu), 這些顆粒狀結(jié)構(gòu)既可以保護(hù)足絲免受海水中細(xì)菌侵蝕以及外力磨損也可以承受足絲內(nèi)部大部分應(yīng)變(Harrington, 2018)。而從圖4e和4f足絲遠(yuǎn)、近端內(nèi)部SEM圖像來(lái)看,足絲內(nèi)部為整齊排列的纖維狀結(jié)構(gòu),足絲遠(yuǎn)端也呈現(xiàn)出緊密的纖維狀結(jié)構(gòu), 近端則呈現(xiàn)出一些交錯(cuò)相連的結(jié)構(gòu)。足絲表面顆粒狀使得其足絲表層的硬度和剛度比內(nèi)部高, 但是二者的彈性模量相差無(wú)幾, 這種獨(dú)特的顆粒狀結(jié)構(gòu)可以作為微球增強(qiáng)復(fù)合材料來(lái)平衡足絲受力(Harrington, 2018)。而.足絲表面光滑, 并沒(méi)有高剛度、硬度的顆粒狀結(jié)構(gòu), 足絲近端和遠(yuǎn)端內(nèi)部無(wú)明顯梯度結(jié)構(gòu), 內(nèi)部結(jié)構(gòu)排列較為穩(wěn)定。深海貽貝足絲光滑的表面以及內(nèi)部不明顯的梯度結(jié)構(gòu)與力學(xué)特點(diǎn)一樣, 也是其適應(yīng)深海環(huán)境的表現(xiàn)。由于深海貽貝無(wú)需像近海貽貝一樣對(duì)抗頻繁的潮汐作用, 深海環(huán)境又相對(duì)溫和, 因此深海貽貝受到外力和磨損(如泥沙沖刷、潮汐拖曳)明顯減小, 不需要足絲表面的顆粒狀增強(qiáng)復(fù)合結(jié)構(gòu)來(lái)幫助其抵抗摩擦。EDS對(duì)足絲內(nèi)部元素的分析結(jié)果(圖5)顯示, 除了溴沒(méi)有在近海貽貝足絲的近端檢測(cè)出外, 其他幾種元素在兩種貽貝的足絲近端里組成相近。而在足絲遠(yuǎn)端, 兩種貽貝足絲內(nèi)部除了硫, 其他元素相差較少, 但總體來(lái)看兩種貽貝足絲內(nèi)部的主要元素含量接近。

圖4 貽貝足絲SEM圖像

注: a.s足絲表面; b.足絲表面; c.足絲遠(yuǎn)端內(nèi)部; d.足絲遠(yuǎn)端內(nèi)部; e.足絲近端內(nèi)部; f.足絲近端內(nèi)部

圖5 貽貝足絲內(nèi)部EDS元素分析

注: A.足絲遠(yuǎn)端; B.足絲遠(yuǎn)端; C.足絲近端; D.足絲近端

2.4 FT-IR分析

為進(jìn)一步研究?jī)煞N貽貝足絲內(nèi)部的結(jié)構(gòu)組成差異, 本文進(jìn)行了FI-IR檢測(cè)分析。根據(jù)FT-IR譜圖(圖6),.足絲兩端內(nèi)部在酰胺A帶(3 250～3 300 cm–1)、酰胺I帶(1 700～1 600 cm–1)以及酰胺III帶(1 220～1 330 cm–1)都有較為明顯的吸收峰, 而酰胺A、酰胺I和酰胺III是天然膠原蛋白所具有的特征吸收峰(陳靜濤等, 2008), 除了膠原蛋白中明顯的3種酰胺吸收峰外, 在足絲內(nèi)部還發(fā)現(xiàn)有酰胺B帶(3 000～3 100 cm–1)以及酰胺II帶(1 600～1 500 cm–1),所以深海貽貝足絲內(nèi)部和近海貽貝足絲一樣含有膠原蛋白結(jié)構(gòu)。但是在氫鍵區(qū)(4 000～2 500 cm–1),兩端在2 975～2 845 cm–1波數(shù)(圖6長(zhǎng)方形陰影區(qū))存在兩個(gè)明顯的亞甲基(—CH2—)基團(tuán), 即2 916 cm–1峰位的(—CH2—)對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)和2 848 cm–1峰位的(—CH2—)反對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)。這兩種亞甲基信號(hào)在近海足絲兩端紅外光譜中并沒(méi)有明顯發(fā)現(xiàn)。除此之外, 在單鍵區(qū)(1 500～1 000 cm–1),足絲還有1 120 cm–1左右峰位的C-O吸收(圖6b橢圓陰影區(qū)域), 在近海.足絲兩端紅外光譜中也缺少此吸收的信號(hào), 因此深海熱液區(qū)貽貝足絲與近海貽貝足絲在組成成分上有明顯差異。由于醇、酸、酯、內(nèi)酯的C-O吸收在此吸收峰區(qū)域, 因此熱液區(qū)貽貝足絲可能含有更多此類(lèi)物質(zhì), 但C-O吸收信號(hào)具體歸屬于何種物質(zhì)還有待進(jìn)一步研究。

本文通過(guò)分析酰胺I和II帶的最大值, 對(duì)足絲內(nèi)部的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。酰胺I峰位的波數(shù)表示三螺旋結(jié)構(gòu)和β-結(jié)構(gòu), 對(duì)于足絲遠(yuǎn)端, 酰胺 II信號(hào)在1 528 cm–1處的最大值表明存在β折疊結(jié)構(gòu)。對(duì)于近端部分, 近海貽貝足絲在酰胺II信號(hào)最大值為1 543 cm–1, 表明α螺旋結(jié)構(gòu)明顯(Hagenau, 2009)。貽貝足絲在酰胺II信號(hào)最大值為1 532 cm–1則表明β折疊結(jié)構(gòu)明顯。Hagenau等(2009)通過(guò)對(duì)酰胺I帶反卷積后洛倫茲擬合, 發(fā)現(xiàn)近海貽貝足絲遠(yuǎn)端主要是β-折疊結(jié)構(gòu), 近端則由α-螺旋、超螺旋、β結(jié)構(gòu)組成。對(duì)足絲二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析預(yù)測(cè), 發(fā)現(xiàn)其足絲遠(yuǎn)端和近海貽貝足絲相近, 可能有大量的β-折疊結(jié)構(gòu), 而足絲近端則主要是由超螺旋和α-螺旋結(jié)構(gòu)組成。足絲近端的超螺旋和α-螺旋可以使足絲變得更佳穩(wěn)定、不易破壞, 從而能夠更有效地適應(yīng)熱液環(huán)境可能帶來(lái)的接觸形變和破壞。

2.5 氨基酸組成分析結(jié)果

貽貝足絲氨基酸檢測(cè)過(guò)程中由于檢測(cè)前先對(duì)樣品進(jìn)行酸水解, 導(dǎo)致色氨酸被鹽酸水解破壞無(wú)法檢測(cè)出, 天冬酰胺和谷氨酰胺側(cè)鏈的酰胺基被水解成了羧基, 因此氨基酸分析結(jié)果中并沒(méi)有列出色氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺的含量。根據(jù)足絲氨基酸分析結(jié)果(圖7), 可以發(fā)現(xiàn)足絲中脯氨酸和甘氨酸含量高于近海貽貝足絲, 其中甘氨酸含量大約29%, 脯氨酸大約9%。貽貝足絲主體結(jié)構(gòu)是由類(lèi)似于膠原蛋白的preCOL組成的, 而膠原蛋白是由3條左螺旋結(jié)構(gòu)多肽鏈通過(guò)鏈間氫鍵相互咬合形成牢固的右手超螺旋結(jié)構(gòu)。膠原蛋白復(fù)合螺旋區(qū)中其氨基酸通常呈現(xiàn)(甘氨酸-X-羥脯氨酸)n周期性排列(Engel, 2005), 甘氨酸側(cè)鏈的單個(gè)氫原子大空間使得膠原蛋白纖維非常緊密地締合, 從而促進(jìn)氫鍵和分子間交聯(lián)的形成, 所以膠原蛋白的高甘氨酸含量對(duì)于膠原蛋白螺旋的穩(wěn)定性是非常重要的(Reiser, 2012)。而脯氨酸由于其亞氨基酸結(jié)構(gòu)往往使得肽鏈中形成“結(jié)節(jié)”, 在膠原蛋白結(jié)構(gòu)中能夠促進(jìn)鏈內(nèi)螺旋(Shoulders, 2009)。同樣脯氨酸在X-a-a位置的環(huán)折疊對(duì)三螺旋穩(wěn)定性也很重要(Bella, 2016), 同時(shí)Pro的吡咯環(huán)所施加的構(gòu)象限制對(duì)于膠原三螺旋結(jié)構(gòu)的完整性是至關(guān)重要的(Kersteen, 2001; Egli, 2020)。足絲中的高甘氨酸和脯氨酸可以使三螺旋結(jié)構(gòu)之間匹配的氫鍵更多, 從而有利于穩(wěn)定類(lèi)膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)。通過(guò)這種更穩(wěn)定的膠原三螺旋結(jié)構(gòu),足絲可以更有效地在深海熱液特殊環(huán)境中發(fā)揮其功能。

圖6 貽貝足絲遠(yuǎn)端和近端內(nèi)部FI-IR圖譜

脯氨酸能夠促進(jìn)膠原蛋白中肽鏈螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定, 同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致肽鏈中β折疊、轉(zhuǎn)角二級(jí)結(jié)構(gòu)的出現(xiàn),.足絲中脯氨酸量比近海貽貝足絲中高, 這也與我們對(duì)熱液區(qū)貽貝足絲FT-IR譜圖酰胺位擬合后的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析相符合, 熱液區(qū)貽貝足絲近端主要是超螺旋和α-螺旋, 遠(yuǎn)端則存在有大量β折疊、β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。另外足絲中谷氨酸、賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸含量也比近海足絲略高一點(diǎn), 這幾個(gè)氨基酸側(cè)鏈都有雙亞甲基的存在, 這也與紅外圖譜中熱液區(qū)貽貝足絲遠(yuǎn)端特有的亞甲基峰相對(duì)應(yīng)。熱液區(qū)貽貝足絲中高脯氨酸通過(guò)與高甘氨酸鏈間氫鍵結(jié)合可增強(qiáng)螺旋穩(wěn)定性, 促進(jìn)三螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定, 從而使得熱液區(qū)貽貝足絲結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。氨基酸以及紅外光譜分析表明足絲內(nèi)部化學(xué)結(jié)構(gòu)和組分可能比近海貽貝足絲更為穩(wěn)定。這種穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)會(huì)讓深海貽貝足絲的化學(xué)性能更為穩(wěn)定, 從而使得深海貽貝能夠更好地適應(yīng)深海極端環(huán)境。

3 結(jié)論

通過(guò)分析發(fā)現(xiàn), 熱液區(qū)貽貝足絲表面光滑無(wú)高剛度、硬度耐磨的顆粒狀結(jié)構(gòu), 而內(nèi)部蛋白結(jié)構(gòu)和組分更偏于穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。深海熱液區(qū)貽貝足絲的彈性模量較小, 伸長(zhǎng)率也比較小, 彈性模量、伸長(zhǎng)率小說(shuō)明深海貽貝足絲剛度小、柔性好、變形能力較差, 相反地是其彈性緩沖較差。熱液區(qū)貽貝足絲這種獨(dú)特的低彈性模量、低伸長(zhǎng)、高穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)可能更有利于其適應(yīng)外力相對(duì)較弱的深海熱液區(qū)環(huán)境。近海貽貝由于身處近岸潮間帶, 受到潮汐和海沙等外力作用, 為了對(duì)抗這種反復(fù)性外界作用力, 其足絲具有良好的力學(xué)性能, 即高延伸、低模量、彈性恢復(fù)、耐磨損。移居到深海熱液區(qū)后, 熱液區(qū)貽貝受周期性外力影響相對(duì)較小, 也無(wú)需頻繁對(duì)抗外界磨損破壞, 表層耐磨顆粒在長(zhǎng)期適應(yīng)深海熱液區(qū)環(huán)境過(guò)程中消失。而為了應(yīng)對(duì)深海熱液區(qū)的極端條件的影響, 貽貝進(jìn)化出高穩(wěn)定性的足絲蛋白結(jié)構(gòu), 同時(shí)熱液區(qū)貽貝足絲也變得粗短、柔軟。對(duì)深海貽貝足絲這種獨(dú)特的力學(xué)性能和內(nèi)部穩(wěn)定、高強(qiáng)度結(jié)構(gòu)的研究有助于我們研究熱液區(qū)貽貝對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性, 對(duì)開(kāi)發(fā)和利用深海生物材料也提供了基礎(chǔ)。

圖7 M. galloprovincialis和B. marisindicus的足絲氨基酸組成分析

注:足絲貽氨基酸組成貝源自Benedict等(1986)

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THE STRUCTURE AND PERFORMANCE OF MUSSEL BYSSUS IN THE DEEP-SEA HYDROTHERMAL AREA OF THE INDIAN OCEAN

XIE Lin-Qing1, CAO Wei1, JIANG Feng-Hua1, LI Jing-Xi1, SUN Cheng-Jun1, 2

(1. Key Laboratory of Marine Eco-Environmental Science and Technology, Marine Bio-resource and Environment Research Center, First Institute of Oceanography,?Ministry of Natural Resources, Qingdao 266100, China; 2. Laboratory of Marine Drugs and Biological Products, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266200, China)

The structure and performance of the byssus of mussels are essential to the normal life of mussels. To study the structure and performance of deep-sea mussel byssus in the extreme environment of the hydrothermal area,byssus were collected from the deep-sea hydrothermal area of Longqi, Southwest Indian Ocean, and their mechanical properties, structural characteristics, and components were analyzed. Compared with offshore mussels (), the mechanical properties ofbyssus are characterized by small modulus, low elasticity, and poor elastic cushioning. Analysis with Fourier Transform infrared spectrometer showed that the main component of mussel byssus in the deep-sea hydrothermal area was collagen. The functional group characteristics showed that the byssus protein contains a large number of β-sheet structures, and the secondary structure gradient at the proximal and distal ends of the byssus is small. Scanning electron microscopy results show that the surface of the mussel byssus in the hydrothermal area is smooth, and the internal structure is fibrous and orderly arranged. The results of amino acid analysis show relative high glycine and proline in the mussel byssus from the deep-sea hydrothermal area. The high glycine and proline may increase the stability of the triple helix structure of byssus protein and enable the byssus maintain stable performance in the hydrothermal environment. This study revealed the unique mechanical properties, structural characteristics, and composition characteristics of deep-sea mussel byssus in the hydrothermal area, and provided a basis for understanding the environmental adaptability of the mussels in hydrothermal area.

hydrothermal area mussel; byssus; mechanical property; Fourier Transform infrared spectrometer; scanning electron microscope; amino acid analysis

*自然科學(xué)基金, 41776177號(hào); 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室基金, 2016ASKJ14號(hào), QNLM2016ORP0403號(hào); 中國(guó)大洋礦產(chǎn)資源研究項(xiàng)目, DY135-E2-1-07。謝林青, 碩士研究生, E-mail: 18563151224@163.com

孫承君, 博士生導(dǎo)師, 研究員, E-mail: csun@fio.org.cn

2021-09-16,

2021-10-25

Q586

10.11693/hyhz20210900213