林世鋒，王仁剛*，潘 飛，王自力，任學(xué)良，龍明錦，史躍偉

1. 貴州省煙草科學(xué)研究院 煙草行業(yè)煙草分子遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng)市觀山湖區(qū)龍灘壩路29 號(hào) 550081

2. 上海農(nóng)科種子種苗有限公司，上海市閔行區(qū)北翟路2901 號(hào) 201106

煙草白粉病是煙草生產(chǎn)中的主要病害之一，該病害發(fā)生普遍，給烤煙生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［1］。目前，生產(chǎn)上對(duì)煙草白粉病的防治以化學(xué)防治為主，不僅需要相應(yīng)的人力、物力投入，還會(huì)帶來(lái)煙葉農(nóng)殘超標(biāo)、環(huán)境污染等問(wèn)題［2］。闡明煙草白粉病抗性機(jī)制，開(kāi)展抗病育種，從遺傳本質(zhì)上提高煙草對(duì)白粉病的抗性是防治煙草白粉病最經(jīng)濟(jì)、最有效且對(duì)人畜安全的方法。

Mildew resistance locus O（MLO）蛋白是植物特有的一類(lèi)蛋白家族，其中的部分成員是白粉病菌成功侵染寄主植物的必要因子［3］。一個(gè)或多個(gè)MLO基因功能的缺失突變可導(dǎo)致植物對(duì)白粉病菌廣譜且持久的抗性［4-7］。已知抗白粉病煙草品種Kutsaga E1和Tsukuba 1 的白粉病抗性來(lái)源于煙草品種Kokubu、Fujimura 等［8］，通過(guò)對(duì)煙草品種 Kokubu 的白粉病抗性分子機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，NtMLO1 和NtMLO2 基因均為煙草白粉病隱性抗病基因（感白粉病基因），來(lái)源于Kokubu 的白粉病抗性是由NtMLO1 和NtMLO2 基因的隱性突變所致。

為開(kāi)發(fā)相應(yīng)的分子標(biāo)記以輔助煙草白粉病抗病育種，張孝廉等［9-10］根據(jù)煙草白粉病抗感品種間NtMLO1 和NtMLO2 基因序列差異設(shè)計(jì)引物，構(gòu)建了4 個(gè)單基因PCR 體系分別用于擴(kuò)增野生型和突變型NtMLO1 和NtMLO2 基因。基于該研究，設(shè)計(jì)和組合引物并優(yōu)化PCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，旨在建立一種用于檢測(cè)NtMLO1 和NtMLO2 基因型的多重PCR方法，為煙草白粉病抗病育種回交后代基因型篩選提供可靠的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

抗白粉病烤煙品種Kutsaga E1和感白粉病烤煙品種K326、紅花大金元和云煙87均由貴州省煙草科學(xué)研究院新品種選育三組鑒定和提供。分別以K326、紅花大金元和云煙87 為母本，以Kutsaga E1作為父本進(jìn)行雜交獲得各自的F1代，其中K326 和Kutsaga E1 的F1代再通過(guò)自交或回交（以K326 為父本）產(chǎn)生F2代及回交世代，用于抗譜鑒定和標(biāo)記分析。

1.2 方法

1.2.1 白粉病菌人工接種

接種鑒定病原菌為煙草白粉病致病菌二孢白粉菌（Erysiphe cichoracearum DC），由貴州省煙草科學(xué)研究院新品種選育三組分離和保存。苗期采用抖落法［11-12］接種白粉病菌。

1.2.2 煙草基因組DNA的提取

剪取約100 mg 煙葉置于2 mL 離心管中，于55 ℃干燥箱中干燥24 h。使用SPEX Geno/Grinder 2010 高通量動(dòng)植物組織研磨機(jī)（美國(guó)SPEX SamplePrep 公司）將干燥后煙葉振蕩研磨成細(xì)粉狀后，一次性加入520.9 μL 新鮮配制的裂解緩沖液（350 μL PBS、0.9 μL RNase A、150 μL Buffer C-L、20 μL Proteinase K）裂解細(xì)胞。使用AxyPrep 基因組DNA小量制備試劑盒（美國(guó)Axygen公司）提取煙草品種基因組DNA。使用NanoDrop 1000超微量分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo 公司）測(cè)定樣品DNA 濃度，將樣品DNA的濃度稀釋至80 ng/μL備用。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)

分析煙草白粉病隱性抗病基因NtMLO1（M1）和NtMLO2（M2）的野生型和突變型基因序列（圖1）［8］，相比感病品種，抗病品種NtMLO1 基因內(nèi)含子7 的3′端2個(gè)堿基AG突變?yōu)門(mén)A，且抗病品種NtMLO2基因內(nèi)含子6 的5′端2 個(gè)堿基AG 發(fā)生缺失。通過(guò)中國(guó)煙草基因組數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST 工具進(jìn)行相似性搜索與序列比對(duì)（Blastn），綜合考慮M1和M2基因突變位點(diǎn)及其上下游序列特征，設(shè)計(jì)多對(duì)備選引物。經(jīng)實(shí)驗(yàn)比對(duì)，篩選4 對(duì)特異性引物，組成2 個(gè)多重PCR 反應(yīng)體系，分別用于擴(kuò)增M1 和M2 野生型和突變型等位基因（表1）。

表1 多重PCR引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度Tab.1 Primer sequences and lengths of amplified fragments for multiplex PCR

圖1 煙草白粉病隱性抗病基因NtMLO1和NtMLO2的野生型和突變型基因序列比對(duì)Fig.1 Alignment of wild-type and mutant sequences of recessive resistance genes NtMLO1 and NtMLO2

1.2.4 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè)

單組引物 PCR 反應(yīng)體系 20.0 μL：Premix TaqTM10.0 μL，正反向引物（10 μmol·L-1）各0.4 μL，gDNA模板（80 ng·μL-1）1.0 μL，ddH2O補(bǔ)足至20.0 μL。

雙重引物 PCR 反應(yīng)體系 20.0 μL：Premix TaqTM10.0 μL；M1正反向引物（10 μmol·L-1）各0.4 μL，M2正反向引物（10 μmol·L-1）各0.4 μL；gDNA 模板（80 ng·μL-1）1.0 μL；ddH2O補(bǔ)足至20.0 μL。

Premix TaqTM（TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye）購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s（M1野生型擴(kuò)增引物對(duì)1-M1-F/1-M1-R的延伸時(shí)間除外，為40 s），30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。

凝膠電泳檢測(cè)：PCR 產(chǎn)物用加有GelRed 核酸染料的2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）瓊脂糖在100 V電壓條件下電泳50 min，檢測(cè)結(jié)果在凝膠成像系統(tǒng)上顯示。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR分子標(biāo)記體系特異性和穩(wěn)定性檢驗(yàn)

如圖2所示，使用S1或S2引物對(duì)進(jìn)行單重PCR擴(kuò)增時(shí)，在含有M1 和M2 野生型等位基因的感病材料和抗感雜交組合（F1）材料中分別擴(kuò)增出652 或437 bp的單一特異性條帶；進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增時(shí)，可以在上述材料中同時(shí)擴(kuò)增出652 和437 bp的特異性條帶。使用R1 或R2 引物對(duì)進(jìn)行單重PCR 擴(kuò)增時(shí)，在含有M1和M2突變型等位基因的抗病材料和抗感雜交組合（F1）材料中分別擴(kuò)增出191 或306 bp的單一特異性條帶；進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增時(shí)，可以在上述材料中同時(shí)擴(kuò)增出191和306 bp的特異性條帶。結(jié)果表明，特異引物對(duì)S1、S2、R1 和R2 具有很好的特異性和穩(wěn)定性，S1和S2的雙重PCR擴(kuò)增結(jié)果是各自單重 PCR 擴(kuò)增結(jié)果的疊加，R1 和 R2 的雙重 PCR 擴(kuò)增結(jié)果是各自單重PCR 擴(kuò)增結(jié)果的疊加，且能根據(jù)2個(gè)雙重PCR 擴(kuò)增結(jié)果區(qū)分供試材料的3 種基因型，達(dá)到預(yù)期的基因分型效果。

圖2 單重PCR體系和雙重PCR體系的擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification results of monoplex or duplex PCR system

2.2 F2代群體白粉病抗性鑒定

接種10 d 后調(diào)查Kutsaga E1 和K326 構(gòu)建的F2群體（共500株）白粉病抗性，抗病單株為28株，感病單株為 472 株，符合 1 ∶15 的分離比率，證明 Kutsaga E1 的白粉病抗性受2 對(duì)獨(dú)立遺傳的等位基因（A、a和B、b）控制，抗病基因?yàn)殡[性抗病基因。

2.3 利用分子標(biāo)記鑒定F2代群體單株基因型

使用2個(gè)雙重PCR擴(kuò)增體系對(duì)F2代群體內(nèi)不同單株的DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖3。F2群體中共有9 種基因型，分別為AABB、AABb、AAbb、AaBB、AaBb、Aabb、aaBB、aaBb、aabb，其中僅 aabb基因型（與親本1 一致）抗病，在突變基因雙重PCR體系中擴(kuò)增出2條特異性條帶，在野生基因雙重PCR體系中無(wú)條帶，2個(gè)白粉病隱性抗病基因同時(shí)發(fā)生純合突變，該后代植株具有白粉病抗性。其他基因型均感病，在野生基因多重PCR 體系中可擴(kuò)增出1 條或2條特異性條帶。

圖3 基于野生基因雙重PCR體系和突變基因雙重PCR體系的F2群體及其親本的檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Detection results of parents and their F2 population via wild-type and mutant allele-specific multiplex PCR systems

2.4 分子標(biāo)記在煙草白粉病抗性回交改良中的應(yīng)用

使用野生基因雙重PCR 體系和突變基因雙重PCR 體系對(duì)K326 和Kutsaga E1 的回交后代分離群體進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖4。不同于F2代分離群體，該群體有4 種基因型：AABB 基因型在突變基因多重PCR體系中擴(kuò)增時(shí)無(wú)條帶；AaBB基因型在突變基因多重PCR體系中只擴(kuò)增出一條191 bp的特異性條帶；AABb 基因型在突變基因多重PCR 體系中擴(kuò)增出一條306 bp的特異性條帶；AaBb基因型可在突變基因多重PCR體系中同時(shí)擴(kuò)增出191 bp和306 bp的 2 條特異性條帶，分別見(jiàn)圖 4 中單株 4、6、9、17 和21。篩選出攜帶2個(gè)隱性抗白粉病基因（AaBb）的單株，選擇其中表型盡可能接近輪回親本的單株繼續(xù)與輪回親本雜交或進(jìn)行自交獲得隱性純合子（aabb）。自交子代純合子篩選的方法同2.3節(jié)，使用2 個(gè)多重PCR 體系對(duì)BCnF2代群體內(nèi)不同單株的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選擇基因型為aabb的子代單株。

圖4 2個(gè)多重PCR體系在親本及回交后代部分單株中的檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Detection results of parents and some of their backcross progenies via two duplex PCR systems

在常規(guī)回交育種過(guò)程中（圖5a，以Kutsaga E1和K326為例），當(dāng)目標(biāo)性狀受隱性基因控制時(shí)，不能依據(jù)表型在回交后代（BCnF1）中選擇出具有目標(biāo)性狀的植株，每次回交之前均需自交一次，然后從分離群體（BCnF2）中選擇具有隱性目標(biāo)性狀的植株進(jìn)行下一輪的回交。這樣一代回交，一代自交，交替進(jìn)行，防止目標(biāo)性狀丟失。不同于常規(guī)回交育種，分子標(biāo)記輔助選擇育種（圖5b，以Kutsaga E1和K326為例）可利用分子標(biāo)記直接對(duì)BCnF1單株進(jìn)行基因型鑒定，選擇攜帶2個(gè)隱性抗白粉病基因的單株，不需自交一代，且無(wú)需進(jìn)行自交后代單株白粉病菌的接種鑒定工作。除可顯著縮短育種時(shí)間外，利用分子標(biāo)記鑒定抗性還具有以下優(yōu)點(diǎn)：①無(wú)需根據(jù)表型進(jìn)行人工判斷，檢測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)100%；②減少人為接種病害對(duì)其他實(shí)驗(yàn)材料的污染；③不需考慮人工接種病害時(shí)對(duì)溫度條件的需求；④提取的后代單株的DNA還可用于其他性狀的分子標(biāo)記輔助選擇。

圖5 常規(guī)回交育種（a）與分子標(biāo)記輔助選擇育種（b）定向改良煙草白粉病抗性過(guò)程比較（以Kutsaga E1和K326為例）Fig.5 Processes of conventional backcross breeding (a) and molecular marker-assisted selection breeding (b) for resistance to powdery mildew in tobacco ( an example with Kutsaga E1 as the donor and K326 as the acceptor)

3 討論

通過(guò)比較M1和M2的基因組序列，發(fā)現(xiàn)M1基因在突變位點(diǎn)處的堿基序列與M2 基因相應(yīng)位置的堿基序列一致性較高。其中，M1 野生型基因與M2 野生型或突變型基因的一致性更高（圖6a）。因此，在M1 基因突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)的野生型基因特異性引物可能與M2 相應(yīng)位置的堿基序列發(fā)生結(jié)合，反之亦然。如不充分考慮該情況，設(shè)計(jì)的引物可能會(huì)在同時(shí)擴(kuò)增M1和M2野生型等位基因的多重PCR體系中發(fā)生交錯(cuò)組合（圖6b、圖6c、圖6d），從而影響擴(kuò)增效果，這一推論也在之前的預(yù)實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。根據(jù)上述序列比較結(jié)果，在M1突變位點(diǎn)處設(shè)計(jì)野生型基因的正向特異引物（圖6e），在M2突變位點(diǎn)處設(shè)計(jì)野生型基因的反向特異引物（圖6e），并在上述引物3′端倒數(shù)第3位引入1個(gè)錯(cuò)配堿基，以提高PCR延伸反應(yīng)的特異性。

圖6 NtMLO1和NtMLO2基因突變位點(diǎn)區(qū)域的DNA序列比較及引物設(shè)計(jì)策略分析Fig.6 Multiple alignments and primer design strategies of DNA sequences of mutation site regions in NtMLO1 and NtMLO2 genes

本研究中最初試圖通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件，獲得一個(gè)同時(shí)檢測(cè)M1和M2野生型和突變型的四重PCR體系，擴(kuò)增結(jié)果如圖7所示。由于引物間的干擾，造成四重PCR 體系擴(kuò)增效率較低，需使用價(jià)格較高的熱啟動(dòng)Taq 酶（Premix TaqTMHot Start Version）進(jìn)行40個(gè)PCR循環(huán)，且該體系重復(fù)性較差，故無(wú)法應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助育種。因此，分開(kāi)構(gòu)建2 個(gè)雙重PCR 體系，包括擴(kuò)增M1 和M2 野生型等位基因的雙重PCR體系和擴(kuò)增M1和M2突變型等位基因的雙重PCR體系，同時(shí)通過(guò)對(duì)PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化，確保了擴(kuò)增結(jié)果的重復(fù)性和可靠性（圖2、圖3、圖4）。

圖7 同時(shí)檢測(cè)NtMLO1和NtMLO2野生型和突變型等位基因的四重PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.7 Amplification results of wild-type and mutant alleles of NtMLO1 and NtMLO2 genes via four pairs of primers in one PCR system

4 結(jié)論

根據(jù)煙草白粉病感病基因M1和M2野生型和突變型等位基因序列差異設(shè)計(jì)引物，建立了2 個(gè)雙重PCR 體系，包括擴(kuò)增M1 和M2 野生型等位基因的雙重PCR體系和擴(kuò)增M1和M2突變型等位基因的雙重PCR 體系，與單重PCR 體系相比，縮短了鑒定時(shí)間、提高了檢出效率，為煙草白粉病抗病育種回交后代基因型篩選提供了一種客觀且可靠的技術(shù)手段。