雷昌斌，唐新文，郭志文，李 健

（湘南學(xué)院附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，湖南 郴州 423000）

肌腱?。╰endinopathy）是臨床的常見病及多發(fā)病，全球每年約新增3 000萬肌腱病患者，嚴(yán)重影響人們?nèi)粘Ｉ罴盎顒?dòng)［1］。傳統(tǒng)治療方案包括局部制動(dòng)、非甾體類藥物消炎止痛、超聲波激光及局麻藥+激素（封閉治療），對一些慢性、頑固性的肌腱炎也可采取手術(shù)或關(guān)節(jié)鏡等微創(chuàng)治療，但治療效果均有限，修復(fù)后肌腱質(zhì)量變差，容易引起粘連和纖維化，甚至斷裂。近年發(fā)現(xiàn)分離肌腱干細(xì)胞（tendon stem cells）約占肌腱組織5%左右，肌腱干細(xì)胞具有成肌腱、成脂肪、成骨等多向分化潛能［2］。肌腱干細(xì)胞可以向損傷部位聚集并向肌腱細(xì)胞方向分化，對損傷的肌腱組織修復(fù)有非常重要的作用［3］。但移植肌腱干細(xì)胞通常需要對其培養(yǎng)增殖以獲得足夠數(shù)量，但目前尚無較好辦法能在體外長期培養(yǎng)中保持干細(xì)胞穩(wěn)定性并控制其分化方向。

多聚磷酸鹽（inorganic polyphosphate,Poly P）是由幾個(gè)至數(shù)百個(gè)無機(jī)磷酸鹽單體通過高能磷酸鍵聚合而成的線性多聚體，釋放出來的能量可參與氨基酸、核苷酸、糖和脂類等主要分子的構(gòu)建［4］。Poly P是細(xì)胞除DNA和RNA后的第三大主要多聚體陰離子（polyanion）［5］。研究認(rèn)為Poly P在原核和真核生物中具有促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)和分化成熟［6］、增殖［7］、促進(jìn)凝血酶活性［8］及清除氧自由基［9］等作用，但對高等哺乳動(dòng)物的影響尚不清楚。研究證實(shí)，Poly P可以通過上調(diào)椎間盤髓核細(xì)胞基質(zhì)的表達(dá)，從而提高髓核細(xì)胞的合成代謝［10］。本研究通過CKK-8細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)和ATP能量檢測試劑盒檢測不同濃度Poly P對肌腱干細(xì)胞增殖和能量代謝的影響，并通過Western blot和免疫熒光檢測I型膠原的表達(dá)差異。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

3個(gè)月齡SD（Sprague-Dawley）成年雌性大鼠，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過湘南學(xué)院附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員審查和審批，并嚴(yán)格遵守其相關(guān)指南。培養(yǎng)基：DMEM（Life Technologies，美國）；10%胎牛血清（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS）（ATLANTA，美國），1%青鏈霉素（Gibco，美國）。抗體：CD44、CD90.1、CD45和CD106（Proteintech，中國），Collagen type I（abcam，美國），β-actin（Affinity，中國）；消化酶：Collagenase type I(Gibco，美國)、Dispase II（Roche，美國）；試劑盒：CCK-8試劑盒（索萊寶公司，中國），ATP試劑盒（PerkinElmer，美國）。其他常規(guī)試劑和耗材購自長春寶泰克生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞分離與培養(yǎng)鑒定

用CO2安樂處死大鼠后，在無菌操作臺(tái)上分離大鼠髕腱組織，用無菌剪刀剪碎后，按照每100 mg組織加入1 ml PBS消化液，其中含3 mg Collagenase typeⅠ和4 mg Dispase II，37°C下消化2 h，懸液在2 500 r/min離心5 min，棄上清，再次加入PBS液10 ml，混勻后再次在2 500 r/min離心5 min，棄上清，然后加入培養(yǎng)基（DMEM,20%FBS,1%P/S）5 ml，將懸液轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶中，置于37°C CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。約兩周后，用結(jié)晶紫對細(xì)胞克隆進(jìn)行染色，待細(xì)胞長至整瓶70%～80%后，消化細(xì)胞，進(jìn)行CD44、CD90.1、CD45和CD106免疫染色，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.3 體外處理

將P2代肌腱干細(xì)胞按3 000 cells/well接種至96孔板，待細(xì)胞貼壁后，分別加入0、0.5、1.0 mmol/L Poly P培養(yǎng)。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 細(xì)胞增殖能力測定

細(xì)胞分別培養(yǎng)1、4、8、24 h后，每孔加入10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，使用酶標(biāo)儀檢測450 nm的吸光度（Optical density,OD）。

1.4.2 細(xì)胞周期測定

細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，消化細(xì)胞，進(jìn)行PI染色，并采用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞周期進(jìn)行分析。

1.4.3 ATP能量代謝檢測

細(xì)胞分別培養(yǎng)1、4、8、24 h后，用ATP試劑盒配置濃度梯度，每孔加入50 μl mammalian cell lysis solution避光并震動(dòng)5 min，再每孔加入50 μl substrate solution避光震動(dòng)5 min。使用酶標(biāo)儀測定450 nm吸光度（OD），檢測了ATP濃度（nM），后采用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit測定每孔樣品總DNA含量（ng），并將產(chǎn)生的APT（nM）量標(biāo)準(zhǔn)化每孔總DNA含量（nM/ng）。

1.4.4 免疫熒光和Western blot檢測I型膠原的表達(dá)

免疫熒光檢測I型膠原的表達(dá)，如上不同濃度Poly P處理細(xì)胞48 h后，將細(xì)胞用預(yù)冷的PBS浸洗3次，每次3 min，用4%的多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，PBS浸洗3次，每次3 min，然后加入一抗I型膠原（1∶200）并放入濕盒，4℃孵育過夜。第2 d用PBS清洗3遍，每次3 min，加入熒光二抗，室溫孵育1 h，PBS清洗3遍，每次3 min，然后加入DAPI避光孵育5 min，PBS清洗3遍，每次3 min，最后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取各組總蛋白后用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，然后進(jìn)行Western blot檢測I型膠原的表達(dá)，使用4%～20%梯度聚丙烯酰胺凝。進(jìn)修電泳、轉(zhuǎn)膜后，室溫下在5%的脫脂牛奶封閉1 h。分別加入一抗I型膠原（1∶1 000）在4°C搖擺平臺(tái)上過夜。第2 d用TBST緩沖液清洗3遍之后在室溫下加入二抗（1∶10 000）并避光搖晃1 h，再洗滌3次，使用奧德賽成像儀對蛋白條帶進(jìn)行化學(xué)顯色，并用Image J軟件進(jìn)行半定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad Prism7.03軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，重復(fù)3次的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肌腱干細(xì)胞的鑒定

從大鼠肌腱分離肌腱細(xì)胞約2周后，可見細(xì)胞克?。▓D1a），對其進(jìn)行結(jié)晶紫染色（圖1b），然后采用流式細(xì)胞術(shù)對其表面分子表達(dá)進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)＞95%的細(xì)胞均表達(dá)CD44和CD90.1，幾乎不表達(dá)CD45和CD106（圖1c～1f），提示作者成功分離得到大鼠肌腱干細(xì)胞。

圖1 大鼠肌腱干細(xì)胞的鑒定 1a:大鼠原代肌腱細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，培養(yǎng)約12 d后，可見大量圓形細(xì)胞克隆 1b:細(xì)胞克隆結(jié)晶紫染色結(jié)果 1c～1f:大鼠肌腱細(xì)胞表面分子鑒定，這些細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD44和CD90.1，但白細(xì)胞表面標(biāo)記物CD45和血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD106均為陰性

2.2 多聚磷酸鹽對肌腱干細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響

CCK-8細(xì)胞增殖檢測結(jié)果見表1。隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移，三個(gè)濃度Poly P組的OD值均顯著增加（P＜0.05）。Poly P可以促進(jìn)大鼠肌腱干細(xì)胞的增殖，且呈濃度依賴性，培養(yǎng)1 h時(shí)，三個(gè)濃度Poly P組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但是培養(yǎng)4～24 h，三組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 CCK-8檢測結(jié)果（OD值，n=3，±s）與比較

表1 CCK-8檢測結(jié)果（OD值，n=3，±s）與比較

時(shí)間點(diǎn)1 h 4 h 8 h 2 4 h P值0 m m o l/L 1.1 3±0.0 7 1.2 2±0.0 7 1.4 6±0.0 5 2.2 7±0.0 4＜0.0 0 1 0.5 m m o l/L 1.1 3±0.0 3 1.3 7±0.0 2 1.9 1±0.0 3 2.6 4±0.0 5＜0.0 0 1 1.0 m m o l/L 1.1 8±0.0 8 1.4 4±0.0 4 2.0 5±0.0 7 3.3 1±0.0 7＜0.0 0 1 P值0.3 1 7＜0.0 0 1＜0.0 0 1＜0.0 0 1

細(xì)胞周期檢測結(jié)果見圖2。結(jié)果表明：Poly P可以提高細(xì)胞G2+S期的百分比，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 細(xì)胞周期流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果 2a:對照組 2b:0.5 mmol/L Poly P處理48 h后 2c:1.0 mmol/L Poly P處理48 h后，可見隨Poly P濃度增加，G2+S的占比顯著增加

2.3 多聚磷酸鹽對肌腱干細(xì)胞能量代謝的影響

多聚磷酸鹽對肌腱干細(xì)胞能量代謝ATP檢測結(jié)果見表2。隨培養(yǎng)時(shí)間的推移，三個(gè)濃度Poly P組的ATP檢測的標(biāo)準(zhǔn)值均顯著增加（P＜0.05）。Poly P可以促進(jìn)大鼠肌腱干細(xì)胞的ATP的合成，且呈濃度依賴性；培養(yǎng)1 h，三個(gè)濃度Poly P組間ATP檢測的比值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但是培養(yǎng)4～24 h，三組間ATP檢測的比值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 能量代謝ATP定量檢測結(jié)果（nM/ng，n=3，±s）與比較

表2 能量代謝ATP定量檢測結(jié)果（nM/ng，n=3，±s）與比較

時(shí)間點(diǎn)1 h 4 h 8 h 2 4 h P值0 m m o l/L 4 8 4.7 8±5 3.6 9 4 2 6.5 3±8 7.4 9 5 2 2.0 3±2 7.2 5 6 2 2.6 8±8 5.4 6＜0.0 0 1 0.5 m m o l/L 5 1 9.4 5±8 3.1 6 4 8 9.1 8±3 7.0 9 6 0 2.9 4±7 6.5 3 8 0 4.9 6±9 0.0 6＜0.0 0 1 1.0 m m o l/L 5 0 7.2 7±5 3.0 9 5 4 5.8 3±8 5.0 7 6 4 2.0 6±9 1.3 1 7 5 2.0 6±8 7.4 2＜0.0 0 1 P值0.6 5 1 0.0 4 2 0.0 2 9 0.0 0 8

2.4 多聚磷酸鹽對肌腱干細(xì)胞基質(zhì)代謝的影響

免疫熒光染色所見Poly P促進(jìn)大鼠肌腱干細(xì)胞I型膠原的表達(dá)見圖3a～3c，可見隨Poly P的增加，熒光顯色強(qiáng)度顯著增加。

Western blot檢測結(jié)果見圖3d，此檢測進(jìn)一步印證了免疫熒光染色的檢測結(jié)果，Western blot檢測結(jié)果半定量的直方圖見圖3e，表明0.5 mmol/L、1.0 mmol/L的Poly P組較0 mmol/L Poly P組的I型膠原的表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 Poly P對大鼠肌腱干細(xì)胞I型膠原表達(dá)的影響 3a～3c:免疫熒光檢測I型膠原的表達(dá)，可見隨Poly P的濃度增加，熒光強(qiáng)度增加，說明I型膠原的表達(dá)升高 3d:Western blot檢測I型膠原的表達(dá) 3e:Western blot半定量分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，*表示實(shí)驗(yàn)組與對照組比較P＜0.05，#表示1.0 mmol/L組與0.5 mmol/L組比較P＜0.05

3 討論

肌腱病都是慢性損傷所引起的，屬于無菌性炎癥，導(dǎo)致肌腱附著點(diǎn)局部疼痛，尤其是在受力及負(fù)重時(shí)加重［11］。肌腱組織自身再生能力差，自我愈合后形成的纖維瘢痕組織生物化學(xué)和機(jī)械性能差，容易再損傷甚至斷裂。肌腱干細(xì)胞具有成肌腱、成骨、成脂肪等多向分化能力，最近研究發(fā)現(xiàn)肌腱干細(xì)胞可有效修復(fù)肌腱損傷［12］。文獻(xiàn)報(bào)道將間充質(zhì)干細(xì)胞注射到關(guān)節(jié)腔內(nèi)，在體內(nèi)微環(huán)境的作用下，可以遷移到受損部位分化出新的軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，對退變性關(guān)節(jié)炎半月板及軟骨進(jìn)行重建［13,14］。但移植肌腱干細(xì)胞通常需要對其培養(yǎng)增殖以獲得足夠數(shù)量，但目前尚無較好辦法在長期培養(yǎng)中保持干細(xì)胞穩(wěn)定性。本研究探討Poly P對哺乳動(dòng)物肌腱干細(xì)胞的影響，有助于肌腱干細(xì)胞的臨床應(yīng)用。

本研究證實(shí)，不同濃度的Poly P可以促進(jìn)體外肌腱干細(xì)胞的增殖，其中1.0 mmol/L Poly P較0.5 mmol/L Poly P促進(jìn)肌腱干細(xì)胞增殖更加明顯。Carney［15］報(bào)道在富含血小板血漿中（Platelet-Rich Plasma,PRP），Poly P可以促進(jìn)傷口上皮細(xì)胞化生，促進(jìn)傷口的愈合。同樣Gawri［10］通過對牛椎間盤髓核組織細(xì)胞體外培養(yǎng)證實(shí)，Poly P可以加速髓核細(xì)胞的增殖和組織分化。因此Poly P可以促進(jìn)體外肌腱干細(xì)胞的增殖，有利于肌腱干細(xì)胞的體外培養(yǎng)。

Poly P在其共價(jià)鍵中儲(chǔ)存能量，可釋放用于細(xì)胞生成氨基酸、核苷酸、糖和脂肪的基本分子結(jié)構(gòu)單元［5,16］。Poly P是體內(nèi)能量代謝儲(chǔ)存庫，當(dāng)細(xì)胞或微生物體內(nèi)有較高含量的ATP，可以促進(jìn)多聚磷酸激酶K生成Poly P。相反，當(dāng)細(xì)胞或微生物體內(nèi)ATP減少時(shí)，腺苷激酶被抑制，外切聚磷酸酶被激活，可以降解Poly P為ATP［17］。本研究證實(shí)，0.5 mmol/L、1.0 mmol/L Poly P可以增加肌腱干細(xì)胞的ATP生成，并且在4、8、24 h ATP生成與0 mmol/L Poly P相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

作者通過檢測肌腱干細(xì)胞基質(zhì)蛋白CollagenⅠ的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)不同濃度的Poly P可以促進(jìn)肌腱干細(xì)胞CollagenⅠ的表達(dá)，并且1.0 mmol/L Poly P相較于0.5 mmol/L濃度下能進(jìn)一步促進(jìn)其表達(dá)。這與本團(tuán)隊(duì)前期研究Poly P可以促進(jìn)人體椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞ATP能量代謝和調(diào)節(jié)細(xì)胞基質(zhì)代謝的結(jié)論一致［18］。因此Poly P可以促進(jìn)肌腱干細(xì)胞向成肌腱方向分化，有助于其在肌腱病臨床中的應(yīng)用。Poly P在不同物種、細(xì)胞結(jié)構(gòu)中還有一些其他的功能：包括線粒體絡(luò)合鈣離子、鎂離子等重離子，提供磷酸根儲(chǔ)備庫、緩沖堿性壓力，協(xié)助細(xì)菌轉(zhuǎn)化，調(diào)控細(xì)胞生長、發(fā)育及應(yīng)急等［19，20］。研究還發(fā)現(xiàn)Poly P可參與細(xì)胞的生理代謝調(diào)節(jié)，包括核仁DNA轉(zhuǎn)錄，線粒體通透性，同時(shí)在促炎癥、凝血、骨化過程中也有一定的作用［21，22］。

臨床分離和檢測Poly P仍是瓶頸，需要更簡便、準(zhǔn)確的方法。目前已知Poly P可以促進(jìn)體外肌腱干細(xì)胞的增殖和能力代謝，但其具體功能和機(jī)制尚不明確，仍有待于進(jìn)一步的深入研究。