梅其杰，徐文飛，延偉偉，袁長深，郭錦榮，黃西龍，曾 超，彭俊青

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200；3.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院，湖北 武漢 430077）

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis,KOA）是一種常見的老年性關(guān)節(jié)疾病，以反復(fù)關(guān)節(jié)疼痛、活動受限、軟骨退變?yōu)橹饕卣鳎?］。據(jù)流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，65歲以上老年人KOA的發(fā)病率可達(dá)50%，隨著人口老齡化的加重，KOA的發(fā)病率越來越高［2，3］，從而導(dǎo)致致殘率及經(jīng)濟(jì)壓力更加沉重，然而目前其發(fā)病機(jī)制尚未明確。有研究發(fā)現(xiàn)，KOA可能與腸道菌群（gut microbiota,GMB）的變化有關(guān)，雖然沒有直接證據(jù)表明GMB是否通過免疫系統(tǒng)影響KOA的發(fā)生和發(fā)展，但兩者有共同的危險(xiǎn)因素，如飲食、年齡、肥胖、炎性疾病等［4-10］。作者的前期研究顯示，GMB可能參與了KOA發(fā)病機(jī)制［11］，然而目前卻尚無試驗(yàn)研究來進(jìn)一步證實(shí)此觀點(diǎn)，故本文擬通過對KOA兔進(jìn)行腸道菌群基因測序，觀察兔KOA模型與GMB變化的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組

成年健康CV級日本大耳白兔20只（產(chǎn)地：南寧），體重2～3 kg，雌雄各半，由廣西廣得生物科技有限公司提供（許可證號:SCXK桂2017-0001)。按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成2組，KOA組12例，對照組8例，分別編號。

1.2 膝骨關(guān)節(jié)炎模型建立

兔子先在SPF級實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)3 d。將兔仰臥固定于兔臺上，用剪刀剃掉右后腿膝關(guān)節(jié)周圍毛發(fā)，露出皮膚，碘伏棉簽消毒，輕輕彎曲右膝關(guān)節(jié)，自膝關(guān)節(jié)外側(cè)膝眼進(jìn)針，刺入關(guān)節(jié)腔內(nèi)，先回抽，確定針頭位于關(guān)節(jié)腔內(nèi)后，KOA組于1、4、7 d注入含2%木瓜蛋白酶溶液0.5 ml，注射完后屈伸膝關(guān)節(jié)20次左右，以使所注射溶液能均勻浸潤膝關(guān)節(jié)腔。對照組相同方法注射0.5 ml生理鹽水。注射后每天驅(qū)使兔活動20 min。首次關(guān)節(jié)腔注射木瓜蛋白酶2周后即可以獲得穩(wěn)定的KOA模型。

1.3 樣本采集與DNA提取

將兔KOA模型造模成功后，未做特殊藥物干預(yù)，于第15 d早上，統(tǒng)一收集兩組兔的糞便，將標(biāo)本置于-80°C的干冰包裝袋，按測序公司的要求，24 h轉(zhuǎn)送至其實(shí)驗(yàn)室。采用二代16S rRNA測序技術(shù)對糞便樣本進(jìn)行檢測。對所有采集的糞便樣本，進(jìn)行總DNA提取，并利用Nanodrop法進(jìn)行定量檢測，同時(shí)運(yùn)用1.2%瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)鑒定提取質(zhì)量。

1.4 DNA擴(kuò)增

采用全式金公司的Pfu高保真DNA聚合酶，以微生物核糖體RNA或特定基因片段為靶點(diǎn)，通過設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物并添加樣本特異性Barcode序列，進(jìn)而對rRNA基因可變區(qū)或特定基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。同時(shí)運(yùn)用磁珠的吸附作用對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，采用熒光試劑（Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit）對回收產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量，按照每個(gè)樣本的測序量需求，對各樣本進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。

1.5 文庫分析

采用美國Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測序文庫，首先對上述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列末端修復(fù)，通過試劑盒中的End Repair Mix 2切除DNA序列5’端的突出堿基，同時(shí)添加一個(gè)磷酸基團(tuán)、補(bǔ)齊3’端的缺失堿基；在DNA序列的3’端添加A堿基以防止DNA片段自連，同時(shí)保證目標(biāo)序列能與測序接頭相連（測序接頭3’端有一個(gè)突出的T堿基）；在序列5’端添加含有文庫特異性標(biāo)簽（即Index序列）的測序接頭，使DNA分子能被固定在Flow Cell上；采用BECKMAN AMPure XP Beads，通過磁珠篩選去除接頭自連片段，純化添加接頭后的文庫體系；對上述連上接頭的DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而富集測序文庫模板，并采用BECKMAN AMPure XP Beads再次純化文庫富集產(chǎn)物；通過2%瓊脂糖凝膠電泳，對文庫做最終的片段選擇與純化。

1.6 DNA測序

上機(jī)測序前，先對文庫在Agilent Bioanalyzer上進(jìn)行質(zhì)檢，后采用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit在Promega QuantiFluor熒光定量系統(tǒng)對文庫進(jìn)行定量分析，篩選合格的文庫；將合格的上機(jī)測序文庫梯度稀釋后，根據(jù)所需測序量按相應(yīng)比例混合，并經(jīng)NaOH變性為單鏈進(jìn)行上機(jī)測序。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料±s表示，組間均數(shù)對比采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法；計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 樣本的差異性分析

本項(xiàng)目納入的研究樣本共20例，其中KOA組12例，對照組8例，結(jié)果顯示，KOA組共含有20 188種物種（ASV/OTU），而對照組含有14 029種ASV/OTU，其中兩者共有的ASV/OTU有3 924個(gè)，詳見圖1a。使用GraPhlAn工具，展示各ASV/OTU（樣本總體中的）在進(jìn)化樹中的位置，并標(biāo)出各分類單元。畫出樣本中相對豐度在0.01%以上的ASV/OTU，詳見圖1b。將兩組菌群所含的物種進(jìn)行比較，結(jié)果見表1，兩組間在門、屬水平的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），KOA組在門、屬水平上菌群均較對照組更為豐富；而在綱、目、科、種水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明KOA組在綱、目、科、種水平上菌群與對照組相當(dāng)。

表1 KOA組與對照組物種分類（種，±s）與比較

表1 KOA組與對照組物種分類（種，±s）與比較

物種層級門綱目科屬種K O A組1 0.9 2±0.9 0 1 9.0 8±2.2 3 2 6.6 7±3.4 2 4 2.7 5±6.5 1 5 4.7 5±7.2 3 2 5.8 3±3.9 5對照組9.8 8±0.6 4 1 7.8 8±1.4 6 2 4.7 5±3.1 5 4 0.0 0±6.5 1 4 8.8 8±3.4 0 2 8.1 3±2.2 3 P值0.0 0 7 0.1 6 1 0.2 1 6 0.2 1 3 0.0 4 7 0.1 1 6

此外，為深入研究韋恩圖中的物種分類分布（各個(gè)區(qū)域）情況，ASV/OTU的數(shù)量使用柱狀圖表述，研究發(fā)現(xiàn)在門水平上：厚壁菌、擬桿菌的數(shù)量最多，在屬水平上：瘤胃球菌屬及顫螺菌屬數(shù)量最多，詳見圖1c；而在各個(gè)區(qū)域的物種豐度組成上發(fā)現(xiàn)：厚壁菌、擬桿菌的物種豐度較廣（門水平上）；同時(shí)發(fā)現(xiàn)瘤胃球菌屬及多形桿狀菌物種豐度廣（屬水平上），詳見圖1d。

圖1 兩組樣本差異性分析圖 1a:ASV/OTU的韋恩圖 1b:含顯著性分析的GraPhlAn進(jìn)化樹圖 1c:韋恩圖不同區(qū)域的ASV/OTU數(shù)目統(tǒng)計(jì)柱狀圖 1d:韋恩圖不同區(qū)域的ASV/OTU豐度柱狀圖

2.2 物種組成熱圖

采用熱圖進(jìn)行物種組成分析比較樣本間的物種組成差異：將樣本中平均豐度前50位的屬的豐度數(shù)據(jù)繪制熱圖，發(fā)現(xiàn)OA組的物種組成較對照組的更加豐富，尤其在普雷沃菌屬、不動桿菌屬、厭氧菌屬、綠膿桿菌屬、勞森氏菌屬等菌群。詳見圖2a。

2.3 LEfSe分析

LEfSe分析是一種常見的差異分析方法，不僅可以直接對所有分類水平同時(shí)進(jìn)行差異分析，而且更加強(qiáng)調(diào)尋找分組之間穩(wěn)健的差異物種，即標(biāo)志物種（biomarker）。本研究發(fā)現(xiàn)KOA組的變形桿菌、α-變形菌、弧菌科等差異顯著，其中變形桿菌為KOA組的GMB標(biāo)志物種，詳見圖2b。

2.4 關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析

基于微生物之間相互關(guān)系進(jìn)行樣本網(wǎng)絡(luò)推斷分析（network analysis）構(gòu)建樣本的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖，其中每個(gè)點(diǎn)代表群落中的一個(gè)ASV/OTU；兩個(gè)點(diǎn)之間的連接線代表所連接的兩個(gè)點(diǎn)之間的正相關(guān)或負(fù)相關(guān)的分布趨勢。研究發(fā)現(xiàn)KOA組與對照組均含有豐富的菌群，詳見圖2c。

2.5 代謝通路分析

利用KEGG數(shù)據(jù)庫對樣本從代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、細(xì)胞進(jìn)程、生物體系統(tǒng)和人類疾病6個(gè)方面進(jìn)行二級功能通路豐度分析，發(fā)現(xiàn)菌群樣本主要與代謝通路密切相關(guān)，其中在碳水化合物代謝、氨基酸代謝及輔助因子和維生素代謝上極為突出；詳見圖2d。

圖2 物種組成等分析 2a:物種聚類的屬水平物種組成熱圖 2b:標(biāo)志物種的LDA效應(yīng)值柱狀圖 2c:關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖 2d:預(yù)測的KEGG二級功能通路豐度圖

3 討論

眾所周知，在人類腸道中存在的大量微生物菌落對人類健康起到至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用。GMB不僅對消化系統(tǒng)產(chǎn)生影響，而且能調(diào)節(jié)機(jī)體的代謝、免疫、炎癥狀態(tài)［12，13］。有研究顯示，通過利于運(yùn)動對GMB的重塑作用及對脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）及Toll樣受體4（toll-like receptor4,TLR4）信號通路的調(diào)控，因LPS能激活TLR4受體蛋白及下游蛋白NF-κB這兩條途徑［14］。另外，研究表明GMB在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制扮演了重要角色，可能因其能夠抑制抑炎因子的釋放，以及促進(jìn)促炎因子的釋放［15］。同時(shí)，有研究通過探討GMB、腸道微環(huán)境、腦腸軸、代謝免疫與骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)GMB影響中藥的療效，中藥可影響GMB平衡，且證實(shí)GMB與骨關(guān)節(jié)炎密切相關(guān)［16］。

但是，GMB中哪些菌屬在KOA起作用呢？本研究門、屬水平發(fā)現(xiàn)：KOA組在門、屬水平上菌群均較對照組豐富；在綱、目、科、種水平發(fā)現(xiàn)：KOA組在綱、目、科、種水平上菌群與對照組相當(dāng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在門水平上：厚壁菌、擬桿菌的數(shù)量最多；在屬水平上：瘤胃球菌屬及顫螺菌屬數(shù)量最多；在ASV/OTU豐度圖上，結(jié)果亦是如此。同時(shí)，OA組的標(biāo)志物種為變形桿菌。這一結(jié)果與大多數(shù)的研究類似［17～21］。因此，作者認(rèn)為腸道菌群中的變形桿菌有可能成為研究KOA的標(biāo)志物。

另外，作者前期的研究發(fā)現(xiàn)miRNA在KOA發(fā)生發(fā)展中的作用明顯。而外泌體在OA的深入研究，亦為OA軟骨再生提供了新思路［22］。已有學(xué)者在miRNA-21-/-小鼠模型上，發(fā)現(xiàn)miRNA具有正向或負(fù)向調(diào)控腸道的免疫調(diào)節(jié)功能和屏障功能，從而起到重要調(diào)節(jié)作用［23，24］；另外，還發(fā)現(xiàn) GMB也可作為miRNA和宿主之間的橋梁。因其可通過改變miRNA的表達(dá)水平進(jìn)而與宿主相互作用。那么，解析miRNA與GMB相互作用的機(jī)制，將在KOA發(fā)病機(jī)制上提供新的思路和方法。

GMB和宿主關(guān)系為相互影響，可視為兩者之間的動態(tài)平衡。GMB對人體代謝與免疫系統(tǒng)影響，體現(xiàn)在健康狀態(tài)及疾病的發(fā)生發(fā)展中；而機(jī)體的行為（生活方式、飲食、運(yùn)動習(xí)慣等）又反作用影響GMB，導(dǎo)致GMB的多樣性。雖然，當(dāng)前已有許多研究發(fā)現(xiàn)了某些疾病伴隨著腸道菌群的改變而改變，且腸道菌群發(fā)生變化也會影響疾病的發(fā)展進(jìn)程及其轉(zhuǎn)歸；但是，研究均未能闡明其中的因果關(guān)系。Xu等［25］在對亞洲人群的腸道菌群研究后，發(fā)現(xiàn)微生物與疾病，并不能簡單定義誰是因誰是果。在不同的復(fù)雜疾病中，腸道菌群時(shí)而為因，時(shí)而為果，需要個(gè)案分析。

就目前而言，對腸道菌群的具體結(jié)構(gòu)和功能及其影響因素和作用機(jī)制的深入研究仍將是未來腸道菌群研究的重點(diǎn)方向。本研究為實(shí)驗(yàn)兔的研究，與大多數(shù)的研究（無菌小鼠為實(shí)驗(yàn)對象）一樣，僅僅是一種病態(tài)的動物模型，其結(jié)果能否適用于臨床還是未知的，為此，本研究團(tuán)隊(duì)將在下一階段對KOA人體的腸道菌群菌落分布、物種豐度以及腸道菌群代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，為腸道菌群相關(guān)疾病的發(fā)生機(jī)制及其原理提供新思路、新方法。