劉潮 韓利紅 代小波 劉宸語

摘? 要：辣椒（ L.）屬于重要的蔬菜和香料作物，在世界范圍廣泛栽培。種質(zhì)資源是育種和生產(chǎn)的基礎(chǔ)，開展辣椒屬葉綠體基因組特征研究對闡明辣椒種質(zhì)資源遺傳多樣性、培育和改良栽培品種具有重要的理論和實踐價值。本研究從NCBI數(shù)據(jù)庫下載13個辣椒屬物種葉綠體基因組序列，利用REPuter、MISA和mVISTA等軟件，對辣椒屬葉綠體基因組特征、序列重復(fù)、結(jié)構(gòu)變異和系統(tǒng)發(fā)育進行分析。結(jié)果顯示：辣椒屬葉綠體基因組均具有保守的四分體結(jié)構(gòu)，一對反向重復(fù)區(qū)（IRs）將大單拷貝區(qū)（LSC）和小單拷貝區(qū)（SSC）分開，基因組全長介于156?583～158?077?bp之間，包含113個unique基因，其中蛋白編碼基因、tRNA基因和rRNA基因數(shù)分別為79、30和4;含有60～127對長重復(fù)序列，其中正向重復(fù)序列和回文重復(fù)序列比例較高，30～39 bp的重復(fù)序列含量較高;發(fā)現(xiàn)150～164個SSR位點，以單核苷酸和二核苷酸重復(fù)為主，多為A或T堿基重復(fù);基因組序列同源性較高，未發(fā)現(xiàn)基因重排現(xiàn)象，非編碼區(qū)序列變異高于基因編碼區(qū)，LSC和SSC的多樣性位點多于IR;發(fā)現(xiàn)-、、--和等4個核苷酸多態(tài)性熱點，LSC和SSC的序列多樣性高于IR;主要栽培種辣椒（）與多花辣椒（）親緣關(guān)系較近，中華辣椒（）與灌木狀辣椒（）和紫綠花辣椒（）親緣關(guān)系較近。研究中篩選的SSR和核苷酸多態(tài)性熱點可作為辣椒屬物種鑒定和遺傳多樣性分析的分子標(biāo)記，研究明確了辣椒屬物種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，為辣椒屬物種遺傳多樣性和生物育種奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：辣椒屬;葉綠體基因組;核苷酸多態(tài)性熱點;系統(tǒng)發(fā)育中圖分類號：S718.46 ?????文獻標(biāo)識碼：A

Characteristics and Phylogenetics of the Complete Chloroplast Genomes of Species

LIU Chao， HAN Lihong， DAI Xiaobo， LIU Chenyu

Yunnan Engineering Research Center of Fruit Wine， College of Biological Resource and Food Engineering， Qujing Normal University， Qujing， Yunnan 655011， China

Pepper （ spp.） is widely used as food， spice， decoration， and medicine. Multiple cultivated species belong to important vegetable and spice crops. The analysis of the chloroplast genome of has important theoretical and practical value for clarifying the genetic diversity of germplasm resources and cultivating and improving cultivated varieties. The availability of complete chloroplast genome sequences has offered enormous opportunity to researchers to study the details of gene number， characterization， phylogenetic relationships and diversification of species. The complete chloroplast genome sequences of 13 species were downloaded from the NCBI database， and analyzed by online softwares， such as REPuter， MISA， and mVISTA. The chloroplast genome of had a conserved quadripartite structure， a pair of inverted repeats （IRs） separated a large single copy （LSC） region and a small single copy （SSC） region. The size of chloroplast genome sequences ranged from 156?583?bp （）-158?077?bp （）. A total of 113 unique genes were predicted， including 79 protein-coding genes， 30 tRNA genes， and four rRNA genes. About 60-127 pairs of repeats were identified in chloroplast genomes， and the proportion of forward repeats and palindromic repeats and 30-39 bp repeats were all high in the chloroplast genomes. About 150-164 potential SSRs were reported in chloroplast genomes， and SSRs mainly consisted of mononucleotide and dinucleotide repeats， and most of the repeats were composed of A or T base. Comparative genomics of the 13 species revealed a high sequence similarity in genome-wide organization and a lower sequence divergence in the IRs than LSC and SSC. The fragments of r-，，-- and were identified as variable regions in species， and the nucleotide variability of LSC and SSC was higher than that of IR. The phylogenetic analysis showed that the main cultivated species was closely related to ， and was closely related to and . The SSR and variable hotspots identified could be used as molecular markers for species identification and genetic diversity analysis of species. Overall， our study would highlight the taxonomic utility of the chloroplast genomes in species， and lay a foundation for the evolution， genetic diversity， conservation and biological breeding of species.

; chloroplast genome; variable hotspots; phylogeny

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.03.002

辣椒屬（ L.）屬于茄科一年或有限多年生植物，由約30余個物種構(gòu)成。辣椒起源于中美洲和安第斯山脈區(qū)域，目前在熱帶和溫帶地區(qū)廣泛栽培。辣椒屬物種包含多個野生馴化種，其果實外形和風(fēng)味高度不同。辣椒屬的5個栽培種為重要的蔬菜和香料作物，包括辣椒（）、燈籠辣椒（）、中華辣椒（）、灌木狀辣椒（）和絨毛辣椒（），其果實富含多種生物活性物質(zhì)，其中類胡蘿卜素可作為天然色素和抗氧化劑，廣泛應(yīng)用于多種疾病的防控和治療。

葉綠體是綠色植物進行光合作用的場所，具有獨立的遺傳系統(tǒng)，其遺傳結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，較少發(fā)生基因重組，因此葉綠體基因組序列被廣泛用于植物系統(tǒng)發(fā)育和物種鑒定。被子植物的葉綠體基因組高度保守，由一個大單拷貝區(qū)（large single copy region，LSC）、一個小單拷貝區(qū)（small single copy region，SSC）和一對反向重復(fù)區(qū)（inverted repeat regions，IRs）構(gòu)成。細胞核核糖體DNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS）作為DNA條形碼，被廣泛用于物種鑒定和遺傳多樣性評估。研究發(fā)現(xiàn)辣椒的rDNA-ITS發(fā)生了不完全協(xié)同進化，辣椒的遺傳多樣性是所有辣椒屬物種中最低的，中華辣椒可能是灌木狀辣椒的栽培變種。CAROLINA等使用葉綠體基因、和核基因?qū)?4個辣椒屬物種的種間關(guān)系、地理起源和擴散進行系統(tǒng)研究。TANG等對辣椒的線粒體基因家族進行了鑒定和表征。ZHONG等利用SSR標(biāo)記對147份辣椒屬種質(zhì)資源的遺傳多樣性進行研究。MAGDY等通過

泛質(zhì)體基因組對辣椒屬分類和鑒定進行研究，發(fā)現(xiàn)、、位點多態(tài)性可用于辣椒屬物種系統(tǒng)進化分析。BARBOZA等在南美安第斯熱帶森林中發(fā)現(xiàn)了4個辣椒屬新種，并利用、rpl32-trnL、、和對該屬物種進行系統(tǒng)發(fā)育分析。D’AGOSTINO等測序了8個辣椒屬葉綠體基因組，發(fā)現(xiàn)、、、和位于高變區(qū)，可用于辣椒屬物種的鑒定。

種質(zhì)資源是辣椒育種和生產(chǎn)的基礎(chǔ)。對基因組數(shù)據(jù)庫1618份分子材料的分析表明，分類學(xué)上的模糊性和錯誤通常給辣椒屬物種的形態(tài)學(xué)分類帶來困難。辣椒由多個商業(yè)栽培品種組成，經(jīng)過長期的人工馴化和連續(xù)栽培，品種遺傳背景變窄，遺傳多樣性降低，人類對辛辣等性狀的偏好為馴化辣椒遺傳變異產(chǎn)生了重要影響。因此，了解辣椒屬種質(zhì)資源間的遺傳多樣性，對于物種資源的收集、保護和利用至關(guān)重要。目前，辣椒屬的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系已被廣泛研究，多個辣椒屬物種葉綠體基因組被公布，但由于分子數(shù)據(jù)的限制，辣椒屬的種間關(guān)系仍存在較大爭議。本研究基于葉綠體基因組序列，針對辣椒屬物種資源親緣關(guān)系和遺傳多樣性展開分析，將為我國現(xiàn)有辣椒栽培品種的改良選育提供理論依據(jù)。

? 材料與方法

? 序列獲取

從NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih. gov/）下載13個辣椒屬物種的葉綠體基因組信息，見表1。

? 方法

1.2.1? 重復(fù)序列分析? 使用REPuter軟件分析葉綠體基因組序列重復(fù)，包括互補（complementary，C）、正向（forward，F(xiàn)）、反向（reverse，R）和回文（palindromic，P）重復(fù)，最小重復(fù)長度30 bp，序列同源性90%，Hamming距離為3。使用MISA在線工具檢測SSR數(shù)量及位置分布，設(shè)置最小閾值為單核苷酸重復(fù)次數(shù)為8，二核苷酸和三核苷酸重復(fù)次數(shù)均為4，四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)次數(shù)均為3。

1.2.2? 序列多樣性分析? 使用mVISTA在線軟件，以辣椒葉綠體基因組（JX270811）序列為參照，對辣椒屬物種葉綠體基因組序列變異進行可視化比對。使用MAFFT v. 7.450軟件對辣椒屬物種葉綠體基因組序列進行多序列比對，使用DnaSP v. 6.10軟件分析葉綠體基因組序列核苷酸多樣性（），以確定辣椒屬的高度可變區(qū)，設(shè)置搜索窗口長度為600 bp，步長為200 bp，使用R程序繪圖。

1.2.3? 系統(tǒng)發(fā)育分析? 利用13個辣椒屬物種的葉綠體基因組序列，以番茄（，AM087200）和馬鈴薯（，DQ386163）為外類群，使用MAFFT v. 7.450軟件進行多序列比對，通過IQ-TREE v. 2.1.1軟件基于

最大似然法（maximum likelihood，ML）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，建樹模型為KPu+F+R，步長值為1000。

? 結(jié)果與分析

? 葉綠體基因組特征

所有辣椒屬葉綠體基因組均具有完整的LSC、SSC、IRa和IRb四部分（表1）。葉綠體基因組全長介于156?583（）～158?077 bp（），平均GC含量為37.70%。LSC長度介于86?813（）～87?688 bp（），SSC長度介于17?849（var. ）～19?040 bp（），IR長度介于25?624（）～25?910 bp（），各部分平均GC含量依次為35.75%、32.03%和43.01%。所有辣椒屬葉綠體基因組均包含113個unique基因，其中蛋白編碼基因79個、tRNA基因30個、rRNA基因4個（表1）。蛋白編碼基因、、、、、和均含有2個拷貝，、、、、、、、、和均含有1個內(nèi)含子，和含有2個內(nèi)含子。

?葉綠體基因組重復(fù)序列

由圖1可看出，辣椒屬物種含有60～127對長重復(fù)序列，明顯多于番茄和馬鈴薯的40對和33對。與茄科代表物種不同，辣椒屬物種正向重復(fù)序列普遍占比均超過50%（除萊森素德辣椒外）（圖1A）。與茄科代表物種相比，辣椒屬長重復(fù)序列長度分布更加多樣化，30～39 bp長度的序列最多，占42%～60%，其次為40～49 bp序列（圖1B）。

辣椒屬物種葉綠體基因組中含有150～164個SSR位點（圖2）。主要以單核苷酸和二核苷酸重復(fù)為主，其中單核苷酸均大于100個，二核苷酸平均43個，四核苷酸重復(fù)略多于三核苷酸，僅有辣椒、多花辣椒和萊森素德辣椒含有六核苷酸重復(fù)（圖2A）。辣椒屬二核苷酸SSR明顯多于番茄和馬鈴薯。單核苷酸主要為A/T重復(fù)，占單堿基重復(fù)的98%，C/G重復(fù)僅占2%;二核苷酸重復(fù)主要為AT/AT、AG/CT和AC/GT 3種類型，未檢測到CG/GC重復(fù)，其中AT/AT重復(fù)占60%，AG/CT占38%;三、四、五和六核苷酸重復(fù)序列相對較少，且均含有較高的A或T堿基（圖2B）。

2.3? 葉綠體基因組結(jié)構(gòu)變異

以辣椒葉綠體基因組JX270811為參考，利用mVISTA軟件比較辣椒屬葉綠體基因組序列的同源性（圖3）。結(jié)果顯示，辣椒屬葉綠體基因組未發(fā)生基因重排現(xiàn)象，非編碼區(qū)序列變異高于基因編碼區(qū)，LSC和SSC的多樣性位點多于IR。與其他物種相比，萊森素德辣椒具有較高的序列變異。

使用DnaSP軟件對辣椒屬13個物種葉綠體基因組核苷酸多態(tài)性（）進行分析（圖4）。共檢測到1514個多態(tài)性位點，LSC、SSC和IR區(qū)平均值分別為0.002?39、0.003?83和0.000?86，發(fā)現(xiàn)3個非編碼區(qū)核苷酸多態(tài)性熱點（hotspots）r-、、--和1個編碼區(qū)熱點，其中r-（=0.016?37）和（=0.010?30）位于LSC，-- （=0.014?57）和（=0.008?06）位于SSC?；蚪M中LSC和SSC區(qū)多態(tài)性位點數(shù)較多，IR區(qū)變異較少，表現(xiàn)為相對保守。

? 辣椒屬系統(tǒng)發(fā)育

基于葉綠素基因組數(shù)據(jù)，構(gòu)建了辣椒屬物種系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系（圖5）。萊森素德辣椒位于辣椒屬系統(tǒng)發(fā)育樹的基部，隨后是絨毛辣椒，節(jié)點支持率均為100%。辣椒和多花辣椒以100%的支持率聚成一支，中華辣椒以89%的支持率與灌木狀辣椒和紫綠花辣椒聚成一支，密毛辣椒以100%的支持率與燈籠辣椒和垂花燈籠辣椒聚成一支。

? 討論

隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，植物葉綠體基因組序列為分類學(xué)、物種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育提供了有價值的遺傳信息，并被廣泛用于評估物種遺傳多樣性和物種親緣關(guān)系。目前，多個辣椒屬葉綠體基因組已被公布，本研究對辣椒屬物種葉綠體基因組序列特征、結(jié)構(gòu)變異和系統(tǒng)發(fā)育進行分析，發(fā)現(xiàn)13個辣椒屬物種葉綠體基因組均具有典型的四分體結(jié)構(gòu)，2個IR將LSC和SSC分開，物種間葉綠體基因組大小差異1.5?kb以內(nèi)，編碼的基因種類和數(shù)目一致，顯示基因組結(jié)構(gòu)高度保守。

遺傳多樣性評價對于種質(zhì)資源的收集和高效利用具有重要意義。重復(fù)序列在葉綠體基因組重排和序列變異中發(fā)揮重要作用，基因組SSR標(biāo)記可用作物種群體遺傳多樣性、遺傳演化和基因組圖譜分析，在植物群體遺傳學(xué)和分子育種中具有重要的應(yīng)用價值。辣椒屬葉綠體基因組中正向重復(fù)比例最高，其次是回文重復(fù)，反向重復(fù)和互補重復(fù)比例較低，這與其他茄科物種一致，而與楊屬、蕓苔屬等結(jié)果不同，說明物種的親緣關(guān)系與重復(fù)序列的種類及數(shù)量存在一定的相關(guān)性。辣椒屬葉綠體基因組中以單核苷酸和二核苷酸SSR為主，且含有較高的AT含量，這支持了植物葉綠體基因組中的SSR通常由多聚A或多聚T重復(fù)組成，較少包含串聯(lián)G或C重復(fù)，這些結(jié)果與其他物種類似。不同科或?qū)俚闹参锶~綠體基因組核苷酸多態(tài)性位點有較大差異，但一般情況下，非編碼區(qū)的變異位點比例高于編碼區(qū)，2個IR區(qū)相對LSC或SSC含有較少的序列變異。辣椒屬葉綠體基因組LSC和SSC序列變異高于IR，識別的4個核苷酸多態(tài)性熱點位于LSC或SSC。熱點和與D’AGOSTINO等對11個辣椒物種葉綠體基因組變異的研究結(jié)果一致。蒿屬（）、茄科枸杞屬（）和木蘭科（Magnoliaceae）葉綠體基因組中也分別鑒定到了、和屬于核苷酸多態(tài)性熱點。本研究中鑒定的重復(fù)序列和核苷酸多態(tài)性位點可作為遺傳多樣性標(biāo)記，用于辣椒屬種間物種鑒定和譜系分析。

目前，基于DNA條形碼、質(zhì)體基因和SSR標(biāo)記等對辣椒屬物種多樣性和種間關(guān)系開展了多項研究，然而辣椒屬種間關(guān)系仍存在爭議，基于葉綠體基因組的遺傳多樣性和序列多態(tài)性分析對辣椒品種改良具有重要意義。本研究基于已公布的辣椒屬物種葉綠體基因組序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，中華辣椒與灌木狀辣椒聚成一個高支持率的系統(tǒng)發(fā)育支，二者葉綠體基因組SSC和IR區(qū)大小一致，僅在LSC區(qū)相差7 bp，結(jié)果支持了中華辣椒可能是灌木狀辣椒的栽培變種的結(jié)論。辣椒與多花辣椒親緣關(guān)系較近，二者葉綠體基因組僅相差35 bp。本研究結(jié)果可為辣椒屬植物系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和遺傳育種提供理論參考。

本研究結(jié)果表明，辣椒屬植物葉綠體基因組全長介于156?583?bp～158?077?bp之間，平均GC含量為37.70%，基因組結(jié)構(gòu)保守。長重復(fù)序列以正向重復(fù)和回文重復(fù)為主，30～39?bp長度的序列比較最高。SSR位點主要為單核苷酸和二核苷酸重復(fù)，通常由多聚A或多聚T組成?；蚪M非編碼區(qū)序列變異高于基因編碼區(qū)，4個核苷酸多態(tài)性熱點中，r-和位于LSC，--和位于SSC。辣椒與多花辣椒、中華辣椒與灌木狀辣椒和紫綠花辣椒、密毛辣椒與燈籠辣椒和垂花燈籠辣椒分別具有較近的親緣關(guān)系。

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