(1.桂林醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 541199；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007)

銅綠假單胞菌(P.aeruginosa，PA)是一種常見(jiàn)的機(jī)會(huì)致病菌，是引起免疫力低下患者細(xì)菌感染的常見(jiàn)病原體，由于抗菌藥物的臨床廣泛使用，耐藥株不斷增加，導(dǎo)致PA感染易反復(fù)發(fā)作，且難以控制。PA具有較強(qiáng)的生物膜形成能力，可引起急慢性感染。有研究表明，至少65%的慢性PA感染與生物膜形成有關(guān)，而生物膜的形成受群體感應(yīng)(quorum sensing，QS)系統(tǒng)的調(diào)控。QS 系統(tǒng)是一種密度依賴性的基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)，當(dāng)其感知到病原菌生長(zhǎng)密度達(dá)到閾值水平，通過(guò)信號(hào)分子與靶受體的結(jié)合而啟動(dòng)QS系統(tǒng)。PA感染是一個(gè)慢性、復(fù)雜化的過(guò)程，與其慢性感染密切相關(guān)的是PA可以分泌綠膿素、彈性蛋白酶、鼠李糖脂等多種毒力因子。這些毒力因子的分泌是由群體感應(yīng)系統(tǒng)參與調(diào)控的[1-2]。

近年來(lái)，細(xì)菌耐藥成為臨床棘手的難題，而中藥作為細(xì)菌耐藥的新型抑制劑受到廣泛關(guān)注。中藥安全性高，又具有與抗生素不同的抗菌機(jī)制，有不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)。金銀花，為忍冬屬植物，其干燥花蕾或帶初開(kāi)的花，具有清熱解毒、抑菌消炎等功效，廣泛用于醫(yī)藥及日用品中。目前，已有多種金銀花和(或)山銀花制劑用于治療PA感染所致的呼吸系統(tǒng)疾病。而“中藥抗生素”分子水平的基礎(chǔ)研究很少，作用的靶點(diǎn)模糊，對(duì)抗細(xì)菌耐藥性的機(jī)制闡述仍不清晰，不能深入揭示中藥抗細(xì)菌耐藥性的機(jī)理和作用，嚴(yán)重制約了“中藥抗生素”的突破和發(fā)展。本文從金銀花對(duì)PA的群體感應(yīng)系統(tǒng)作用機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 PA生物膜與耐藥

“生物膜(biofilm，BF)”也稱為微生物群落，是指細(xì)菌附著于黏膜或生物醫(yī)學(xué)材料表面，通過(guò)分泌ECMs(細(xì)胞外基質(zhì))如：胞外多糖(EPS)、胞外DNA(eDNA)、RNA、蛋白質(zhì)和脂類等將其自身包繞其中而形成高度致密的膜樣聚合物[3]。生物膜相當(dāng)于細(xì)菌的“保護(hù)膜”，所以生物膜菌對(duì)各種消毒劑和抗生素的抵抗力通常比浮游菌更強(qiáng)[4]。生物膜的形成，提高了細(xì)菌對(duì)抗生素和宿主免疫反應(yīng)的抗性，故生物膜已成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。

PA的耐藥機(jī)制十分復(fù)雜，幾乎具有細(xì)菌所有的耐藥機(jī)制，形成生物膜是PA耐藥的重要原因之一[5]。PA生物膜的形成主要包括以下幾個(gè)階段。①附著：PA的初始附著由黏附素、IV型菌毛和脂多糖介導(dǎo)，并受c-di-GMP(環(huán)二鳥苷酸)和sRNA(小分子核糖核酸)調(diào)控。②成熟：生物膜的成熟主要表現(xiàn)為生物膜結(jié)構(gòu)的形成和ECM的產(chǎn)生。③剝離：包括剝落、侵蝕和播撒3個(gè)階段，剝落和侵蝕為被動(dòng)剝離，播撒擴(kuò)散為主動(dòng)剝離[6]。

2 PA 的群體感應(yīng)系統(tǒng)

PA生物膜的發(fā)育受多種因素的影響，QS系統(tǒng)是調(diào)控PA生物膜形成的主要機(jī)制之一。1998年戴維斯和他的同事首次報(bào)告了QS系統(tǒng)在生物膜形成中的作用[7]。在PA中至少存在4種QS系統(tǒng)，即las系統(tǒng)、rhl系統(tǒng)、喹諾酮信號(hào)系統(tǒng)以及近期發(fā)現(xiàn)的IQS系統(tǒng)[8]。其中前兩種是由?；呓z氨酸內(nèi)酯(acyl-homoserine lactones，AHLs)信號(hào)分子介導(dǎo)，占主導(dǎo)地位，控制毒力因子的產(chǎn)生和生物膜的成熟。喹諾酮系統(tǒng)是由喹諾酮類信號(hào)分子介導(dǎo)的，受las系統(tǒng)調(diào)控卻又能調(diào)控rhl系統(tǒng)，是前兩個(gè)系統(tǒng)之間的橋梁。IQS系統(tǒng)是近年新發(fā)現(xiàn)的QS系統(tǒng)子系統(tǒng)，可以參與rhl系統(tǒng)及喹諾酮系統(tǒng)信號(hào)分子的合成[1]。

las系統(tǒng)主要由lasI和lasR兩個(gè)編碼基因介導(dǎo)，其中l(wèi)asI合成酶合成AHLs的同系物3-氧十二烷酰高絲氨酸內(nèi)酯(3-oxo-C12-homoserine lactone，3-oxo-C12-HSL)；lasR編碼生成轉(zhuǎn)錄因子LasR。當(dāng)3-oxo-C12-HSL分子在細(xì)胞環(huán)境中達(dá)到假定的閾值時(shí)，其作為誘導(dǎo)PA群體感應(yīng)的重要分子，通過(guò)與LasR的相互作用產(chǎn)生多聚體，從而啟動(dòng)las系統(tǒng)。該系統(tǒng)參與調(diào)節(jié)急性感染的多種毒力因子的表達(dá)，包括外毒素A、LasA、LasB彈性蛋白酶和蛋白水解酶等。rhl是PA的第2個(gè)系統(tǒng)。與las系統(tǒng)一樣，rhl系統(tǒng)同樣是由rhlR和rhlI兩個(gè)基因調(diào)節(jié)，其中rhlR編碼生成RhlR；rhlI編碼生成丁基高絲氨酸內(nèi)酯(N-butyryl-homoserine lactone，C4-HSL)，RhlR和C4-HSL結(jié)合后主要負(fù)責(zé)調(diào)控鼠李糖脂的表達(dá)，以及參與PA毒力因子釋放到宿主細(xì)胞胞質(zhì)中的調(diào)控；并且rhl系統(tǒng)在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后的水平上也受到las系統(tǒng)的分級(jí)調(diào)節(jié)。喹諾酮系統(tǒng)是PA的另一個(gè)QS系統(tǒng)[9]，其中pqsABCDE編碼生成PqsE和 2-庚基-4-喹諾酮(2-heptyl-4-quinoline，HHQ)。PqsH是一種由las系統(tǒng)調(diào)控的基因，在轉(zhuǎn)換HHQ到喹諾酮系統(tǒng)信號(hào)分子2-庚基-3-羥基-4-喹諾酮(2-heptyl-3-hydroxy-4-quinoline，PQS)的過(guò)程中承擔(dān)重要角色。喹諾酮系統(tǒng)主要負(fù)責(zé)誘導(dǎo)鼠李糖脂和其他參與PA生物膜形成的分子產(chǎn)生。后來(lái)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)QS系統(tǒng)是IQS，IQS系統(tǒng)的信號(hào)分子為2-(2-羥基苯基)-噻唑-4-碳醛(IQS)，IQS由非核糖體肽合成酶基因簇ambBCDE編碼產(chǎn)生[1]；它可以將環(huán)境壓力因素整合到QS中。IQS系統(tǒng)既參與調(diào)控PQS，又可以調(diào)節(jié)C4-HSL以及相關(guān)毒力因子的產(chǎn)生，如彈性蛋白酶、鼠李糖脂等。

實(shí)踐證明，這4套QS系統(tǒng)是分層次調(diào)節(jié)的，如圖1。研究證實(shí)[10]， las系統(tǒng)在QS系統(tǒng)中具有最高的地位，可以對(duì)rhl、PQS和IQS系統(tǒng)進(jìn)行分級(jí)調(diào)控。另外，las 系統(tǒng)信號(hào)分子3-oxo-C12-HSL 可功能性地結(jié)合于RhlR蛋白調(diào)節(jié)器，促進(jìn)其裂解及失活；rhl系統(tǒng)還可以調(diào)控綠膿菌素的產(chǎn)生，導(dǎo)致真核宿主細(xì)胞發(fā)生氧化性損傷，破壞宿主抗氧化防御系統(tǒng)；rhl系統(tǒng)處于最低水平，受其他所有QS系統(tǒng)的調(diào)控，并能激活許多與QS相關(guān)的毒力因子；且RhlR對(duì)PQS有負(fù)調(diào)節(jié)作用。相關(guān)研究表明在細(xì)菌生長(zhǎng)穩(wěn)定期，RhlR 可替代缺失的 LasR，促進(jìn)蛋白酶、綠膿菌素、PQS及3-oxo-C12-HSL的產(chǎn)生。PQS由las和IQS激活，并激活rhl系統(tǒng)。IQS由las激活，并參與調(diào)控PQS和rhl系統(tǒng)，可正調(diào)控PQS和C4-HSL產(chǎn)生[11]；當(dāng)然，每個(gè)QS系統(tǒng)也可以被環(huán)境因素以及一些宿主源性因素激活。

圖1 銅綠假單胞菌的QS系統(tǒng)

3 金銀花與PA的生物膜和QS系統(tǒng)

3.1 金銀花的抑菌作用

臨床上抗菌藥物廣泛應(yīng)用及不合理使用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性逐漸增加，中草藥抗菌作用的研究成為熱點(diǎn)。金銀花是常用的中藥品種，《藥典》分列收載金銀花與山銀花，山銀花和金銀花藥性相同，組分相似，主要為綠原酸及黃酮類等。金銀花具有廣譜抑菌作用，且耐藥性發(fā)生率低等特點(diǎn)，系列研究證明金銀花及組份對(duì)PA及其耐藥菌均有抑制作用[12-14]。

3.2 金銀花與PA的生物膜

細(xì)菌生物膜是指細(xì)菌黏附于接觸表面，被自身分泌的胞外聚合物包裹形成的細(xì)菌聚集的膜狀結(jié)構(gòu)。生物膜多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的形成是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程， 包括細(xì)菌起始附、生物膜發(fā)展和成熟等階段。金銀花可通過(guò)抑制細(xì)胞生物膜形成過(guò)程中發(fā)揮其抑菌作用，形成生物膜是PA耐藥的重要原因之一。

陳一強(qiáng)等[15]通過(guò)體外復(fù)制PA的生物膜模型發(fā)現(xiàn)金銀花組PA在固體表面的黏附數(shù)明顯少于空白對(duì)照組，62.5 mg/ml的金銀花可以抑制和破壞早期及成熟生物膜，證實(shí)金銀花水煎液在體外能抑制PA對(duì)固體表面的粘附能力及生物膜形成能力，并能破壞PA已形成的生物膜，增強(qiáng)CAZ(頭孢他啶)對(duì)生物膜內(nèi)PA的清除作用。溫紅俠等[16]研究金銀花主要成分綠原酸的抑菌作用機(jī)制，通過(guò)構(gòu)建體外PAO1生物模型，并測(cè)定MIC值，電鏡觀察載體表面生物膜形態(tài)，空白對(duì)照組見(jiàn)大量分布均勻的微菌落和游離細(xì)菌，而建模3 d、7 d綠原酸組分別偶見(jiàn)聚集菌落、僅見(jiàn)稀少的薄層生物膜，表明綠原酸可以抑制PA的生物膜形成， 并對(duì)早期和成熟生物膜具有破壞作用， 對(duì)于生物膜內(nèi)PA與CAZ有協(xié)同殺菌作用， 并且強(qiáng)于紅霉素組。袁秀麗等[17]通過(guò)試管稀釋法測(cè)定金銀花水煎液和慶大霉素對(duì)PA的MIC(最小抑菌濃度)，用MTT法建立體外PA生物膜并檢定金銀花水煎液和慶大霉素不同MIC濃度的抗PA生物膜作用，得出金銀花水煎液在體外能抑制PA對(duì)固體表面的黏附能力及生物膜形成能力，并能破壞PA已形成的生物膜，增強(qiáng)慶大霉素對(duì)生物膜內(nèi)PA的清除作用。王琳等[18]證明金銀花提取物對(duì)PA生物膜有清除作用，而且對(duì)于生物膜的初始黏附作用效果更強(qiáng)。該研究采用激光共聚焦顯微鏡觀察在金銀花提取物作用下的PA 的生物膜的整體發(fā)展和結(jié)構(gòu)變化，發(fā)現(xiàn)金銀花提取物主要通過(guò)抑制生物膜立體結(jié)構(gòu)形成而實(shí)現(xiàn)對(duì)生物膜的清除作用。

3.3 金銀花與PA的QS系統(tǒng)

金銀花及其組分綠原酸等均被證實(shí)對(duì)PA的QS系統(tǒng)相關(guān)毒力因子，如彈性蛋白酶、綠膿素的表達(dá)及QS基因有抑制作用。陳一強(qiáng)等[15]證實(shí)了金銀花組分綠原酸具有抑制PA毒力因子及QS系統(tǒng)信號(hào)分子的作用，這可能與其抑制了QS系統(tǒng)的相關(guān)基因表達(dá)有關(guān)；該研究還通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了綠原酸在體內(nèi)對(duì)PA的抑制作用。李鏞等[19]研究發(fā)現(xiàn)，泛耐藥 PA 群體行為與 QS 基因相關(guān)，且彈性蛋白酶和LasI，LasR表達(dá)過(guò)高，提示 QS 基因在 PA 耐藥機(jī)制中起重要作用。Wang等[20]也證實(shí)綠原酸在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)QS系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)，下調(diào)PA的QS相關(guān)基因lasI，lasR，rhlI，rhlR，pqsA和pqsR的表達(dá)，從而細(xì)菌生物膜形成受阻，成群運(yùn)動(dòng)減弱和毒力因子表達(dá)下降。Annapoorani等[21]采用Glide version 5.5篩選1 920種天然化合物和PA的LasR和RhlR受體蛋白進(jìn)行對(duì)接、QSI評(píng)價(jià)。綠原酸在總蛋白水解試驗(yàn)、LasB彈性蛋白酶試驗(yàn)、溶血素測(cè)定試驗(yàn)對(duì)PA01， AS1 and AS2 菌株均表現(xiàn)出不同的抑制效果，蛋白酶顯示出活性下降，即這五種QSI化合物可能抑制蛋白酶的產(chǎn)生，并且這五種化合物并未與蛋白酶進(jìn)行結(jié)合或者降解酶活性，說(shuō)明是通過(guò)化合物本身的QSI潛力起作用。在PA01、AS1和AS2生長(zhǎng)中，被測(cè)QSI化合物作用組和對(duì)照組的細(xì)胞生長(zhǎng)密度無(wú)變化，也證明了這些化合物的抑制作用不是由于抗菌活性，而可能是通過(guò)QSI活性。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)亞抑菌濃度(4 mg/ml)的山銀花粗提物對(duì)綠膿素及彈性蛋白酶的表達(dá)有顯著的抑制作用，山銀花粗提物在MIC時(shí)對(duì)鼠李糖脂有極顯著抑制作用；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示山銀花粗提物在亞抑菌濃度(4 mg/ml)時(shí)，rhlI和lasI基因的表達(dá)量顯著低于空白對(duì)照組；在MIC時(shí)對(duì)rhlR基因的表達(dá)有顯著的抑制作用。

綜上所述，形成生物被膜是PA耐藥的重要原因之一，而QS系統(tǒng)是調(diào)控PA生物膜形成的主要機(jī)制之一。金銀花能抑制PA的QS相關(guān)毒力因子及基因的表達(dá)，破壞其生物膜的形成，達(dá)到一定抑菌的效果。我國(guó)中草藥文化歷史悠久，中草藥抑菌作用研究成為國(guó)內(nèi)研究熱點(diǎn)，金銀花在治療感染性疾病方面具有多成分、多作用、多途徑、多環(huán)節(jié)的特點(diǎn)，抑菌機(jī)制值得深入研究。