曹 慧②，王福東③，孫樂(lè)棟2，劉 佳，李宗香

(1.桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院皮膚科， 廣西 桂林 541199；2.南方醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院皮膚科， 廣東 廣州 510515)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus， SLE)是一種累及多系統(tǒng)、多器官組織的全身性自身免疫性疾病，臨床高發(fā)于育齡期女性，本病臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，病情反復(fù)難愈，病程遷延，嚴(yán)重危害我國(guó)人民健康。其中，狼瘡腎炎(lupus nephritis，LN)是SLE最嚴(yán)重的并發(fā)癥，并發(fā)率高達(dá)55%以上，且腎臟受累損害的程度與患者預(yù)后密切相關(guān)[1]。系統(tǒng)性紅斑狼瘡是由B細(xì)胞介導(dǎo)的慢性自身免疫性疾病，自身抗體的產(chǎn)生以及III型超敏反應(yīng)的慢性系統(tǒng)性炎癥是該疾病的顯著特征[2]。自身抗體和相應(yīng)抗原形成免疫復(fù)合物，沉積于各組織、器官，引起局部組織炎癥和損害[3]。LN是SLE所產(chǎn)生的免疫復(fù)合物沉積在腎臟，改變腎血管的通透性所引起的一種繼發(fā)性腎小球疾病。目前，國(guó)內(nèi)外常規(guī)的藥物治療根據(jù)臨床表現(xiàn)的輕重，病理類型的不同，治療方案不一而足。主要的藥物有糖皮質(zhì)激素、環(huán)磷酰胺、硫唑嘌呤、霉酚酸酯等，但是長(zhǎng)期應(yīng)用大劑量免疫抑制劑，毒性反應(yīng)大，長(zhǎng)期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素會(huì)增加SLE患者慢性器官損害并導(dǎo)致患者生存率下降。中醫(yī)認(rèn)為，LN的發(fā)生屬正虛邪實(shí)，腎虛為本，熱毒為標(biāo)[4]，治療應(yīng)當(dāng)以益腎健脾為根基[5-6]。小四五顆粒由東漢張仲景《傷寒論》中的小柴胡湯、五苓散及宋代《太平惠民和濟(jì)局方》中的四物湯三方組成，本文將探討該藥方對(duì)狼瘡腎炎的治療作用及其免疫機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

8周齡雌性MRL/MpJ-Faslpr小鼠和8周齡SPF級(jí)雌性Balb/c小鼠，購(gòu)自廣州市賽柏諾生物科技有限公司。小四五顆粒劑(柴胡、黃芩、半夏、人參、白術(shù)、茯苓、澤瀉、豬苓、桂枝、熟地黃、白芍、當(dāng)歸、川穹等)由廣東一方制藥廠生產(chǎn)，每袋3 g，相當(dāng)于生藥6 g。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥 MRL/MpJ-Faslpr自發(fā)性狼瘡小鼠20只，隨機(jī)分成兩組，狼瘡對(duì)照組和小四五治療組，各10只，Balb/c小鼠10只為正常對(duì)照組，小四五治療組予小四五顆粒劑，制成每毫升含生藥6 g的水煎劑，根據(jù)許淑云主編的《藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法》，按公式：小鼠劑量(g/kg)=人用劑量×0.0026×50 g計(jì)算，小四五給藥組給予0.2 ml/20 g的小四五懸液灌胃，2次/d，連續(xù)6周，狼瘡對(duì)照組及正常對(duì)照組等體積生理鹽水灌胃，2次/d，連續(xù)6周。

1.2.2 尿蛋白含量檢測(cè) 于用藥后6周末采集小鼠晨尿，將所有尿液標(biāo)本稀釋500倍，采用碧云天公司生產(chǎn)的BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)尿蛋白含量，加入樣品及工作液后，37 ℃孵育30 min，酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算樣品尿蛋白濃度。

1.2.3 血清IL-4、IL-10、IFN-γ檢測(cè) 小鼠于第6周末眼眶取血，4℃，4 000 r/min，離心15 min，取上清液凍存于-80 ℃?zhèn)溆?，小鼠血清中IL-4、IL-10、IFN-γ檢測(cè)方法按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th1與Th2細(xì)胞數(shù)量 小鼠處死后，分離脾臟100 mg，制備脾臟單細(xì)胞懸液，以每孔1×106個(gè)細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入細(xì)胞刺激劑及高爾基體抑制劑，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h，固定、破膜、染色后，行流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)脾臟中Th1與 Th2細(xì)胞數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 尿蛋白測(cè)定情況

與正常組小鼠相比，狼瘡組小鼠尿蛋白含量顯著增加；與狼瘡組相比，小四五治療組小鼠尿蛋白含量降低(P<0.05)，見表1。

表1 不同組小鼠尿蛋白檢測(cè)情況

2.2 血清IL-4、IL-10、IFN-γ含量測(cè)定

與對(duì)照組小鼠相比，狼瘡組小鼠血清中IL-4、IL-10含量顯著增加，IFN-γ含量顯著降低；與狼瘡組相比，治療組IL-4、IL-10含量降低，增加IFN-γ含量(P<0.05)，見表2。

表2 小四五顆粒對(duì)MRL/MpJ-Faslpr小鼠血清IL-4、IL-10、IFN-γ的影響

2.3 Th1細(xì)胞與Th2細(xì)胞水平測(cè)定

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照小鼠相比，狼瘡組小鼠脾臟中的Th1水平顯著降低，Th2細(xì)胞水平顯著升高(P<0.05)，與狼瘡組相比，小四五顆粒能顯著增加Th1細(xì)胞水平，降低Th2細(xì)胞水平，Th1細(xì)胞/Th2細(xì)胞比值顯著升高，見表3。

表3 小四五顆粒對(duì)MRL/MpJ-Faslpr小鼠脾臟Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞數(shù)量的影響

3 討論

系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)生和進(jìn)展與遺傳、免疫、感染、激素和環(huán)境因素等有關(guān)，患者B淋巴細(xì)胞異常增生，T淋巴細(xì)胞降低，體內(nèi)出現(xiàn)大量抗體和致病性循環(huán)免疫復(fù)合物，激活補(bǔ)體系統(tǒng)，進(jìn)而引起全身炎癥反應(yīng)和免疫損傷[7]。近年來(lái)，機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能系統(tǒng)，尤其是Th1/Th2細(xì)胞失衡成為臨床研究SLE的熱點(diǎn)。 Th1細(xì)胞能分泌生成IFN-γ等因子，對(duì)細(xì)胞免疫具有介導(dǎo)作用，能促進(jìn)T細(xì)胞分化及成熟、增殖，促使炎癥介質(zhì)合成[8]。Th2細(xì)胞能分泌生成IL-4、IL-10等因子，對(duì)體液免疫具有介導(dǎo)作用，能促進(jìn)B細(xì)胞分化及成熟、增殖，促使IgE、IgG類等抗體生成[9]。Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子的平衡破壞在SLE發(fā)病機(jī)制中有重要作用。

狼瘡腎根據(jù)其臨床表現(xiàn)， 可歸屬于祖國(guó)醫(yī)學(xué)“水腫”“虛勞”“腎痹”等范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，LN的發(fā)生是由人體先天稟賦不足，陰陽(yáng)氣血失調(diào)，加之毒邪侵入，導(dǎo)致毒邪內(nèi)蘊(yùn)于腎，血脈凝滯而致[10]。故本病以肝腎虧虛為本，熱毒瘀結(jié)為標(biāo)，本虛標(biāo)實(shí)的癥狀貫穿疾病的始終。小四五顆粒中，小柴胡湯疏通三焦、理氣和解；五苓散通陽(yáng)化氣，利水滲濕；四物湯養(yǎng)血活血祛瘀。全方脾腎雙補(bǔ)，攻補(bǔ)兼施，陰陽(yáng)相濟(jì)，可行氣祛瘀，升清降濁，水濕歸于正化，使尿蛋白減少，腎功能改善。四物湯為中醫(yī)補(bǔ)血理氣的經(jīng)典方劑，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，它于免疫系統(tǒng)的功能具有多向調(diào)節(jié)作用，能增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能[11-12]。

研究結(jié)果顯示，MRL/MpJ-Faslpr小鼠脾臟Th1細(xì)胞/Th2細(xì)胞比值降低，與此相一致的是MRL/MpJ-Faslpr小鼠外周血中IFN-γ水平降低，IL-4、IL-10水平升高，經(jīng)小四五顆粒處理后，可緩解Th1細(xì)胞/Th2細(xì)胞比例及其分泌的細(xì)胞因子不平衡。筆者推測(cè)小四五顆粒對(duì)狼瘡小鼠腎炎病情的改善，可能通過(guò)降低Th1細(xì)胞/Th2細(xì)胞比值，減少自身反應(yīng)性B細(xì)胞及自身抗體的產(chǎn)生進(jìn)而減少腎臟免疫復(fù)合物的沉積，最終減輕腎臟的損害。后續(xù)，筆者將深入開展相關(guān)機(jī)制研究。