吳紹梅，張 立，王 晶，馬 濤

無錫市婦幼保健院檢驗(yàn)科，無錫 214000

卵巢癌是婦科常見惡性腫瘤，具有高復(fù)發(fā)率和高死亡率的特點(diǎn)。在腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)后應(yīng)用以順鉑(cis-platinum，DDP)為主的聯(lián)合化療是當(dāng)前最常見的卵巢癌臨床治療方案[1-2]。但卵巢癌患者常出現(xiàn)原發(fā)性或獲得性的順鉑耐藥，嚴(yán)重影響了順鉑聯(lián)合化療的效果[3]。組蛋白去乙?；?histone deacetylase, HDAC)在調(diào)控細(xì)胞核組蛋白乙?；揎椫芯哂兄匾饔?，許多HDAC抑制劑被發(fā)現(xiàn)可以調(diào)控腫瘤的增殖、侵襲及多藥耐藥，具有重要的臨床應(yīng)用價值[4-7]。羅米地辛(Romidepsin，又稱FK228)是Class Ⅰ家族HDACs的抑制劑，在臨床上已被應(yīng)用于治療皮膚T淋巴瘤和外周T淋巴瘤[8-9]。本研究使用順鉑耐藥卵巢癌細(xì)胞系COC1/DDP，系統(tǒng)研究了羅米地辛對COC1/DDP細(xì)胞順鉑敏感性、PD-L1表達(dá)水平的影響和可能的調(diào)控機(jī)制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

超凈工作臺、酶標(biāo)儀、凝膠電泳儀和凝膠成像儀均購自上海天能科技有限公司；蛋白轉(zhuǎn)印儀(Bio-Rad)、流式細(xì)胞儀(BD)、熒光定量PCR儀均購自美國賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 試藥

人卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞株COC1/DDP(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞庫)；Romidepsin(德國Merck公司)；CCK-8細(xì)胞增殖試劑盒(日本同仁化學(xué)所)；Annexin V/PI細(xì)胞凋亡試劑盒(invitrogen)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(hyclone)、熒光素偶聯(lián)PD-L1抗體(FITC-anti-PD-L1 antibody)均購自北京義翹神州科技股份有限公司；總RNA提取試劑盒、SYBRgreen qPCR Mix均購自北京天根生物公司；細(xì)胞核蛋白提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；抗組蛋白H3抗體(anti-histone H3)、抗乙?；M蛋白H3抗體(anti-acetylated H3)、HRP-anti-mouse IgG均購自美國CST公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將COC1/DDP細(xì)胞株接種在含有青霉素/鏈霉素和體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d進(jìn)行傳代。

2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞存活率

將處于對數(shù)生長期的COC1/DDP細(xì)胞消化、離心并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至2×105個·mL-1，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔200 μL，讓細(xì)胞充分貼壁生長。細(xì)胞貼壁生長24 h后，將細(xì)胞分為2組，Romidepsin組加入終濃度為5 nmol·L-1的Romidepsin，Control組加入等體積的二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)。各組細(xì)胞均分別加入質(zhì)量濃度梯度為0、2.5、5、10、20、40、80 μg·mL-1的DDP，隨后放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，最后用酶標(biāo)儀檢測各孔450 nm波長處的吸光度(A)，并計(jì)算細(xì)胞活力。細(xì)胞活力(%)=(A-A空白)/(A0-A空白)×100%。

2.3 細(xì)胞凋亡率檢測

將處于對數(shù)生長期的COC1/DDP細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，并分為4組：Control組加等體積的DMSO，Romidepsin組加入終濃度為5 nmol·L-1的Romidepsin，DDP組加入終質(zhì)量濃度為20 μg·mL-1的DDP，Romidepsin+DDP組同時加Romidepsin和DDP。加藥培養(yǎng)24 h后，消化、離心收集細(xì)胞，用500 μL Annexin V結(jié)合緩沖液重懸，并加入10 μL FITC-Annexin V，室溫避光孵育15 min后，加入5 μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)，隨后用流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞。

2.4 實(shí)時熒光PCR

Control組細(xì)胞和Romidepsin組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，離心收集細(xì)胞，使用總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，取1 μg總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。隨后用SYRB green qPCR mix進(jìn)行實(shí)時熒光PCR，分別檢測PD-L1和STAT3 mRNA的表達(dá)水平，以GAPDH作為內(nèi)參。

2.5 流式細(xì)胞染色檢測PD-L1表達(dá)

貼壁生長的Control組和Romidepsin組COC1/DDP細(xì)胞經(jīng)過胰酶消化、離心收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106個·mL-1。取50 μL細(xì)胞懸液，加入0.5 μL FITC-anti-PD-L1抗體，4 ℃避光孵育1 h，隨后加入450 μL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)，用流式細(xì)胞儀檢測PD-L1的表達(dá)水平。

2.6 Western blot檢測組蛋白乙酰化水平

離心收集各組細(xì)胞，使用細(xì)胞核蛋白提取試劑盒分離細(xì)胞核蛋白，加入5×SDS上樣緩沖液，置于100 ℃沸水浴中加熱10 min。使用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白樣品，隨后使用蛋白轉(zhuǎn)印儀將凝膠上的蛋白樣品轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride，PVDF)膜上。PVDF膜經(jīng)過體積分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉室溫封閉40 min后，分別用抗組蛋白H3抗體、抗乙?；M蛋白H3抗體孵育和HRP二抗孵育，用化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)底物檢測蛋白條帶。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad Prism 7.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間差異采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞存活率

與Control組相比，使用5 nmol·L-1Romidepsin處理的COC1/DDP細(xì)胞在各質(zhì)量濃度梯度(2.5、5、10、20、40、80 μg·mL-1)順鉑處理下，細(xì)胞存活率均顯著下降(P<0.05)，結(jié)果見圖1。計(jì)算順鉑IC50值，Control組細(xì)胞IC50值為24.8 μg·mL-1，Romidepsin組細(xì)胞IC50值為10.3 μg·mL-1，逆轉(zhuǎn)指數(shù)為2.43。

圖1 細(xì)胞存活曲線

3.2 細(xì)胞凋亡率

與Control組相比，Romidepsin組COC1/DDP細(xì)胞早期凋亡率和晚期凋亡率稍微升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.058、P=0.103)，而DDP組細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均升高(P=0.009、P=0.011)。與DDP組相比，Romidepsin+DDP組細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均顯著升高(P=0.004、P=0.003)。結(jié)果見表1。

表1 各組細(xì)胞的凋亡率

3.3 實(shí)時熒光PCR實(shí)驗(yàn)檢測PD-L1 mRNA的表達(dá)水平

與Control組相比，Romidepsin組COC1/DDP細(xì)胞PD-L1 mRNA的表達(dá)水平上升了(2.43±0.57)倍(P=0.012 7)，表明Romidepsin可以促進(jìn)COC1/DDP細(xì)胞PD-L1 mRNA的表達(dá)，結(jié)果見圖2A。

3.4 流式細(xì)胞染色檢測細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)水平

與Control組相比，Romidepsin組COC1/DDP細(xì)胞表面PD-L1信號明顯增強(qiáng)，細(xì)胞峰值右移，表明Romidepsin處理可以促進(jìn)細(xì)胞PD-L1蛋白在細(xì)胞膜上的表達(dá)，結(jié)果見圖2B。

3.5 組蛋白乙酰化水平

Control組與Romidepin組細(xì)胞組蛋白H3(histone H3)表達(dá)水平無明顯變化，但Romidepin組細(xì)胞乙酰化組蛋白H3(acetylated H3)水平顯著上升，計(jì)算條帶灰度值，與Control組相比，Romidepin組細(xì)胞組蛋白H3乙?；缴吡?32.7±8.95)倍(P<0.000 1)，表明Romidepin可以促進(jìn)組蛋白H3的乙?；＝Y(jié)果見圖3。

注：A.Western blot檢測結(jié)果；B.灰度值分析。

3.6 熒光定量PCR檢測STAT3表達(dá)水平

與Control組相比，Romidepsin組COC1/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子STAT3的相對表達(dá)水平顯著下降(1.00±0.09vs.0.69±0.13，P=0.027 4)。

4 討論

本研究發(fā)現(xiàn)HDAC抑制劑Romidepsin可以在體外培養(yǎng)條件下，增強(qiáng)順鉑耐藥的卵巢癌細(xì)胞COC1/DDP對順鉑的敏感性，順鉑聯(lián)合Romidepsin處理顯著促進(jìn)了卵巢癌細(xì)胞的凋亡。抗血管新生藥物治療、順鉑聯(lián)合化療等卵巢癌術(shù)后的常用化療方案，由于許多卵巢癌患者存在多藥耐藥性，導(dǎo)致化療效果并不理想[2, 9-11]。因此，探究卵巢癌細(xì)胞順鉑耐藥的機(jī)制、尋找新的聯(lián)合化療藥物、增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對順鉑的敏感性是解決該問題的主要手段。

Romidepsin是重要的HDAC抑制劑，主要抑制Class Ⅰ家族HDAC(包括HDAC1、HDAC2和HDAC3)的去乙?；钚裕龠M(jìn)組蛋白乙酰化水平的升高[12-13]。在本研究中，用Western blot驗(yàn)證了Romidepsin對COC1/DDP細(xì)胞組蛋白H3乙?；降拇龠M(jìn)作用。在臨床上，Romidepsin已經(jīng)被應(yīng)用于治療T細(xì)胞淋巴瘤[9]。當(dāng)前，越來越多的研究表明，Romidepsin對于多種實(shí)體腫瘤也表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性。陳柯宇等[14]發(fā)現(xiàn)Romidepsin與阿糖胞苷聯(lián)合用藥可以通過增強(qiáng)CASP3啟動子的轉(zhuǎn)錄活性抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲；PATTARAWAT P等[15]的研究發(fā)現(xiàn)Gemcitabine(吉西他濱)、Romidepsin和順鉑聯(lián)合用藥可以顯著抑制三陰性乳腺癌的疾病進(jìn)展。本研究也發(fā)現(xiàn)Romidepsin和順鉑聯(lián)合用藥可以顯著抑制體外培養(yǎng)的卵巢癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。這一發(fā)現(xiàn)提示Romidepsin在卵巢癌臨床治療中的潛在應(yīng)用價值。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)經(jīng)Romidepsin處理的COC1/DDP細(xì)胞PD-L1的表達(dá)水平也顯著升高。PD-L1常高表達(dá)于腫瘤細(xì)胞，可以通過與殺傷性T細(xì)胞表面PD-1蛋白的結(jié)合幫助腫瘤逃避免疫系統(tǒng)的殺傷作用[16-18]。Romidepsin處理導(dǎo)致的卵巢癌細(xì)胞高表達(dá)PD-L1可能會引起免疫抑制，從而促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸。但從另一方面考慮，高表達(dá)的PD-L1可能會促進(jìn)靶向PD-L1的單抗藥物的作用。

STAT3是促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移的重要轉(zhuǎn)錄因子，一些研究也發(fā)現(xiàn)STAT3的高表達(dá)和活化與腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性密切相關(guān)[19-20]。本研究通過實(shí)時熒光PCR實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)經(jīng)Romidpesin處理的卵巢癌細(xì)胞STAT3的表達(dá)水平也顯著升高，表明Romidepsin可能通過對組蛋白去乙?；傅囊种平档土薙TAT3的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平，從而進(jìn)一步逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞對順鉑的耐藥性。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了Romidepsin聯(lián)合順鉑用藥可以逆轉(zhuǎn)對順鉑耐藥的卵巢癌細(xì)胞的耐藥性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，揭示了Romidepsin在卵巢癌術(shù)后化療中潛在的重要作用。然而Romidepsin可以促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞PD-L1的表達(dá)，提示其可能會引起腫瘤的免疫抑制，促進(jìn)腫瘤免疫逃逸。